口服滅活幽門螺桿菌對新生BALB/c小鼠胃黏膜的免疫保護(hù)作用研究

楊鈺欣　江吉富

(遵義市婦幼保健院，遵義563000)

口服滅活幽門螺桿菌對新生BALB/c小鼠胃黏膜的免疫保護(hù)作用研究

楊鈺欣江吉富

(遵義市婦幼保健院，遵義563000)

[摘要]目的：探索BALB/c小鼠新生期口服滅活幽門螺桿菌(H.pylori)后對胃黏膜是否具有免疫保護(hù)作用。方法：將32只BALB/c小鼠分為四組進(jìn)行實驗。第Ⅰ組為PBS對照組，第II組為滅活H.pylori組，第Ⅲ組為滅活H.pylori加大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)組，第IV組為正常對照組。用相應(yīng)抗原成分對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組出生24 h以內(nèi)的新生BALB/c小鼠進(jìn)行灌胃免疫，末次免疫兩周后，將小鼠用108CFU的幽門螺桿菌SS1株進(jìn)行活菌灌胃攻擊，連續(xù)攻擊兩天，每天兩次。在攻擊后的第28天，將各組小鼠處死，取胃組織進(jìn)行活菌計數(shù)及組織病理學(xué)炎性評分。結(jié)果：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組慢性炎癥評分分別為2.25±0.46、2.12±0.35、1.5±0.53、0.25±0.46，炎癥活動度評分為2.12±0.35、2.12±0.35、1.37±0.52、0.25±0.46；除Ⅰ、Ⅱ組間無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組細(xì)菌定植量分別為1.33±0.21、1.18±0.27、1.05±0.37×105CFU/1個胃，Ⅳ組細(xì)菌定植量<4×102CFU/1個胃，低于檢測值，Ⅲ組的細(xì)菌計數(shù)低于Ⅰ、Ⅱ組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：BLAB/c小鼠新生期給予滅活幽門螺桿菌加LTB灌胃免疫與活菌攻擊后炎癥的減輕和細(xì)菌定植量的減少可能相關(guān)，具有一定的免疫保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]滅活幽門螺桿菌；LTB；新生BALB/c小鼠；免疫保護(hù)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)在1979年被澳大利亞學(xué)者Warren和Marshall發(fā)現(xiàn)，于1982年成功地從人胃黏膜中分離培養(yǎng)出來，并證實了該細(xì)菌的感染與胃炎相關(guān)。1983年，他們的這一成果發(fā)表在Lancet雜志上[1]。幽門螺桿菌感染在全世界廣泛流行，日本的一項研究顯示，H.pylori的暫時定植可能在新生兒期就有出現(xiàn)[2]。雖然兒童患消化性潰瘍并不多見，但與兒童慢性胃炎、消化不良、慢性腹瀉和復(fù)發(fā)性腹痛等的發(fā)病密切相關(guān)[3]。實驗證明有效的疫苗接種能夠防止H.pylori的感染[4]。一種用福爾馬林滅活的H.pylori全菌體凍干疫苗輔以LT的雙突變佐劑給予BALB/c小鼠灌胃免疫，結(jié)果證明具有良好的免疫保護(hù)反應(yīng)[5]。本課題的前期研究表明，對出生 24 h內(nèi)新生BALB/c小鼠用滅活幽門螺桿菌加大腸桿菌不耐熱腸毒素——LTB進(jìn)行灌胃免疫后，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)[6]。而這種免疫反應(yīng)是否具有保護(hù)作用尚不明確，所以本實驗的主要目的在于探索口服滅活幽門螺桿菌疫苗對新生期小鼠胃粘膜炎癥變化的影響，希望能為人類新生期接種H.pylori疫苗的可行性作一鋪墊。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑與儀器哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、H.pylori培養(yǎng)選擇性添加劑購自英國OXIOD公司；布氏肉湯購自杭州天和有限責(zé)任公司；三元混合氣體(O2、CO2、N2)購自貴陽申建氣體有限責(zé)任公司；LTB購自Sigma公司；恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9272)購自上海一恒有限責(zé)任公司。

1.1.2 菌株滅活幽門螺桿菌NCTC 11637(活菌購自中國疾病預(yù)防控制中心傳染病防治研究所。培養(yǎng)后經(jīng)本室滅活制成終濃度為2×109ml-1的H.pylori滅活菌液，4℃保存?zhèn)溆?[6]。幽門螺桿菌SS1株(由中國疾病預(yù)防控制中心饋贈)。

1.1.3動物模型BALB/c小鼠(購于中國藥品生物制品檢定所)，清潔級，雌雄兼用，自由飲水，分籠飼養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1免疫方案根椐不同的免疫劑型將小鼠分為四組(如表1所示)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組為實驗組(8只/組)，Ⅳ組為正常對照組(8只/組)。用H.pylori滅活全菌體與已經(jīng)溶解的LTB對各組BALB/c小鼠進(jìn)行灌胃免疫，免疫時間為出生后第0(24 h內(nèi))、7、21天。第0天免疫時，將24 h以內(nèi)出生的BALB/c小鼠與母鼠分離3 h后，進(jìn)行灌胃，灌胃完畢，繼續(xù)放入籠中(與母鼠隔離)，4 h后，再次按照上述方法給予第二次灌胃，免疫結(jié)束2 h后，將母鼠放回籠中。第7、21天各免疫1次，第7天免疫前，與母鼠隔離6 h，免疫方法同前，免疫2 h后放回母鼠籠中。

表1實驗分組

Tab.1Group of experiment

第21天免疫前斷食24 h，斷水4 h后進(jìn)行灌胃免疫，2 h后恢復(fù)食水。正常對照組正常喂養(yǎng)，不進(jìn)行任何處理。

1.2.2攻擊前準(zhǔn)備將哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)第三天的H.pylori SS1株刮取一環(huán)，接種到含30 ml氏肉湯的三角燒瓶里，灌入混合氣體，置37℃水平振蕩培養(yǎng)150次/min，培養(yǎng) 48 h后，取菌懸液涂片革蘭染色鏡檢，觀察是否有雜菌生長，菌體形態(tài)是否改變；通過動力實驗觀察動力是否良好。如觀察結(jié)果正常，收集菌懸液，5 000 r/min離心10 min，收集沉淀，加入PBS使其再次懸浮，放入37℃孵箱10 min，使其恢復(fù)動力后，用比濁儀測定并用PBS調(diào)整至攻擊所需濃度；攻擊菌液為每次攻擊前用新鮮培養(yǎng)物配制。

1.2.3攻擊方法末次免疫兩周后，將Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組小鼠用H.pylori SS1株進(jìn)行活菌攻擊，108CFU/0.2 ml/次，每天灌胃2次，兩次攻擊中間隔6 h，連續(xù)2 d。攻擊前斷食12 h，斷水4 h，用50 μl 3%NaHCO3中和胃酸，20 min以后進(jìn)行活菌攻擊，每日末次攻擊2 h后恢復(fù)飲食。正常對照組正常喂養(yǎng)，不進(jìn)行任何處理。

1.2.4胃組織炎性檢測將活菌攻擊后28 d的各組小鼠及與其年齡相同的正常對照組小鼠同時進(jìn)行脫椎脊處死，用碘酒、酒精徹底消毒整個腹部，然后用無菌剪刀將其剪開，從賁門到幽門處剪取胃，置無菌平皿內(nèi)，沿胃大彎剖開，平均分成兩半，一半用于組織病理學(xué)檢測，用無菌棉拭子輕輕去除胃內(nèi)容物，在蒸餾水中輕輕漂洗后，放入盛有10%福爾馬林的小瓶內(nèi)固定，送病理科進(jìn)行石蠟切片并行HE染色、瑞氏吉姆薩染色觀察小鼠在活菌攻擊后胃部的炎癥改變，另一半用于H.pylori培養(yǎng)，了解細(xì)菌定植量；高倍鏡下觀察10個視野固有層淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的浸潤情況，判斷炎癥程度。評分方法如下：慢性炎癥評分：0分：固有層偶見淋巴細(xì)胞浸潤；1分：固有層散在淋巴細(xì)胞浸潤；2分：固有層有中等量淋巴細(xì)胞浸潤；3分：固有層大量淋巴細(xì)胞浸潤，個別在胃粘膜下有淋巴濾泡形成[7]。炎癥活動度評分：0分：固有層偶見中性粒細(xì)胞浸潤；1分：固有層散在中性粒細(xì)胞浸潤；2分：固有層有中等量中性粒細(xì)胞浸潤；3分：固有層有大量中性粒細(xì)胞浸潤。

1.2.5H.pylori定植量檢測按照上述操作，將余下的另一半胃組織放入無菌EP管內(nèi)，加入100 μl布氏肉湯，用剪刀剪碎組織，再加入1 900 μl布氏肉湯，混勻后，倒入事先準(zhǔn)備好的無菌玻璃勻漿器內(nèi)進(jìn)行充分勻漿，然后將組織勻漿液分別做1∶10，1∶100，1∶1 000稀釋，分別接種100 μl到含H.pylori選擇性添加劑的哥倫比亞血瓊脂內(nèi)，用傾注法培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計數(shù)，最后將平皿置培養(yǎng)罐內(nèi)，充入混合氣體，37℃培養(yǎng)5~7 d，觀察菌落，進(jìn)行涂片染色鏡檢、觸酶、氧化酶及快速脲酶試驗并計數(shù)。

2結(jié)果

2.1活菌攻擊后胃組織炎癥評分將各組BALB/c小鼠采集的胃組織標(biāo)本進(jìn)行炎癥評分，從圖1中可以看出Ⅲ組的炎癥評分明顯低于Ⅰ、Ⅱ組，說明使用滅活H.pylori與LTB共同免疫小鼠后，能降低H.pylori攻擊后對胃組織的病理損傷作用，結(jié)果顯示具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05.( 如圖1 所示) 。Ⅰ、Ⅱ組病理切片中固有層可見大量淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞浸潤( 如圖2) 。Ⅲ組的病理切片中亦有不同程度的炎性反應(yīng)，但評分低于Ⅰ、Ⅱ組。

2.2活菌攻擊后H.pylori定植量檢測(表2)從表2中可以看出Ⅲ組的活菌定植量低于Ⅰ、Ⅱ組，說明使用滅活H.pylori與LTB共同免疫小鼠后，能減少活菌攻擊后的H.pylori體內(nèi)定植量，結(jié)果具統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Note：Compared with groupsⅠandⅡ,1)P<0.05.

3討論

早在90年代初期，有關(guān)H.pylori疫苗的研究就已經(jīng)開始。近年來，有著較多關(guān)于H.pylori疫苗的研究。根據(jù)疫苗的構(gòu)成不同，可將其分為全菌疫苗、亞單位疫苗、表位疫苗、載體疫苗等。亞單位疫苗的結(jié)構(gòu)與組成較為明確，是可引起免疫保護(hù)的一類蛋白質(zhì)、脂多糖等微生物組分。與亞單位疫苗相比，全菌疫苗的優(yōu)點是能誘發(fā)針對細(xì)菌各種抗原的免疫應(yīng)答[8]。但是這些蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答機(jī)制仍然不十分清楚，另一方面，現(xiàn)在仍然不能確定對H.pylori整個菌體有效的理想疫苗，與其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的效應(yīng)因子是什么(例如抗體、CD4+亞群、細(xì)胞因子等)。雖然目前的研究成果沒能達(dá)到人們的期望值，但致力于H.pylori疫苗各個方向的研究人員都在不斷的努力。該疫苗的研究成果在中國較為領(lǐng)先，Zeng等[9]用重組H.pylori疫苗對6~15歲兒童進(jìn)行口服免疫，結(jié)果顯示服疫苗組能降低H.pylori的感染率。在國外，Nedrud等[10]用重組的CTA1-UreB3T-DD疫苗對BALB/c小鼠給予鼻黏膜免疫后，亦產(chǎn)生了良好的免疫反應(yīng)并減少了H.pylori的定植。但他們的實驗對象多為成年鼠、成人或兒童。

我們將新生BALB/c小鼠作為實驗對象，因為調(diào)查結(jié)果再次證實部分H.pylori的感染在幼兒期就已存在[11]。我們希望通過對新生嬰兒進(jìn)行疫苗接種后，達(dá)到能在早期預(yù)防H.pylori感染的目的。本次實驗結(jié)果顯示，在活菌攻擊后，各組均有不同程度的炎癥反應(yīng)。PBS組的炎性反應(yīng)較明顯，多數(shù)胃黏膜固有層及黏膜下層可見較多淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞的浸潤。滅活H.pylori加佐劑組的炎癥評分結(jié)果低于Ⅰ、Ⅱ兩組，提示BALB/c小鼠在新生期口服滅活H.pylori與LTB后能一定程度地降低活菌攻擊后胃黏膜的炎性反應(yīng)，但與正常對照組比較還存在一定差異?；罹ㄖ擦繖z測所得出的實驗結(jié)果顯示，滅活H.pylori加佐劑組在活菌攻擊后的細(xì)菌定植量與前兩組比較，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。提示該組抗原成分能刺激機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫應(yīng)答來減少細(xì)菌的定植。雖然初步的實驗結(jié)果令人興奮，但還存在著許多待解決的問題。由于粘膜免疫的特殊性，我們需要一種對胃粘膜具有高免疫原性的疫苗來預(yù)防H.pylori 的感染，這包括對抗原與佐劑設(shè)計，免疫方法及途徑的進(jìn)一步探索；我們還需要在新生期機(jī)體免疫機(jī)制方面進(jìn)行更深層次地研究。

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[收稿2015-05-15修回2015-08-26]

(編輯許四平)

·啟事·

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《中國免疫學(xué)雜志》編輯部

Immunoprotection of gastric mucosa in newborn mice after oral immunization with inactived H.pylori

YANGYu-Xin,JIANGJi-Fu.WomenandChildren′sHospitalofZunyi,Zunyi563000，China

[Abstract]Objective:To explore the Immunoprotection of gastric mucosa in newborn mice after oral immunization with inactived H.pylori .Methods: Thirty-two BALB/c mice were randomly divided into four groups,including PBS control group(groupⅠ),the group of inactivated H.pylori(groupⅡ),the group of inactivated H.pylori and Escherichia cole heat-labile enterotoxin B subunit(LTB)(group Ⅲ),and normal group(group Ⅳ).Newborn BLAB/c mice within 24 hours were immunized through oral gavage with corresponding antigen,Two weeks after final immunization,the mice were challenged with 1×108CFU live H.pylori strain SS1,twice once day,for 2 days.The twenty-eighth day post-challenge,all of mice were sacrificed and stomachs were removed for grades of inflammation and The counting of H.pylori colonizing.Results: The mean scores of stomach tissue inflammation of groupⅠ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ were 2.25±0.46，2.12±0.35，1.5±0.53，0.25±0.46,respectively,and the score of inflammatory activity of the above four groups were 2.12±0.35，2.12±0.35，1.37±0.52，0.25±0.46.Among these four groups,the results were statistically significant between any two groups except the result between groupⅠand group Ⅱ.Finally,H.pylori colonization quantity in the stomachs of group Ⅲ was lower than groupⅠand group Ⅱ(P< 0.05),as expected,the H.pylori colonization was undetectable in group Ⅳ.Conclusion: The oral gavage with inactived H.pylori plus LTB to newborn mice may be associate with the lightening of inflammation and the decrease of H.pylori colonizing number.

[Key words]Inactivated H.pylori;LTB;Newborn BALB/c mice;Immunoprotection

通訊作者及指導(dǎo)教師：江吉富(1956年-)，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事感染與免疫研究，就職于遵義醫(yī)學(xué)院，E-mail: jifujiang@163.com。

作者簡介：楊鈺欣(1983年-)，女，碩士，主要從事感染與免疫研究，就職于遵義醫(yī)學(xué)院，E-mail: yangxx_123@126.com。

中圖分類號R392.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)02-0201-04