葡萄球菌腸毒素超抗原廣譜抑制性多肽的設(shè)計及空間結(jié)構(gòu)研究

王思雄　馬惠文　王東林

(重慶市腫瘤研究所,重慶400030)

葡萄球菌腸毒素超抗原廣譜抑制性多肽的設(shè)計及空間結(jié)構(gòu)研究

王思雄馬惠文王東林①

(重慶市腫瘤研究所,重慶400030)

[摘要]目的：以SEs氨基酸高度保守序列作靶序列設(shè)計抑制性多肽，研究篩選出的多肽P72的空間結(jié)構(gòu)。方法：用生物信息學(xué)軟件“Vector NTI 10.3，InsightII 2000,Discovery Studio 1.7”等分析及預(yù)測多肽P72的空間結(jié)構(gòu)。結(jié)果：P72在SEA、SEB和SEC的同源序列在空間結(jié)構(gòu)具有高度的相似性，P72遠(yuǎn)離SEB的TCR和MHCⅡ結(jié)合位。結(jié)論：P72可能不是與MHCⅡ類分子及TCR結(jié)合而產(chǎn)生的抑制作用，其具體的抑制機(jī)制有待深入研究。

[關(guān)鍵詞]葡萄球菌腸毒素;超抗原;合成多肽

葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxin SEs)屬于超抗原(SAg)，SEs進(jìn)入體內(nèi)，使得T淋巴細(xì)胞被大量激活，誘發(fā)機(jī)體強(qiáng)烈免疫反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂。對于該毒素的治療，常常應(yīng)用被動免疫療法的抗毒素血清，如國外有學(xué)者利用小鼠模型，構(gòu)建包含葡萄球菌腸毒素A(SEA)和毒性休克綜合征毒素(TSST-1)的融合蛋白產(chǎn)生的抗體，結(jié)果顯示該抗體對SEs的致休克效應(yīng)具有保護(hù)作用[1]。但是抗毒素血清無法應(yīng)用于預(yù)防，另外其本身能激發(fā)人體的免疫反應(yīng)而產(chǎn)生毒性。因此，針對SEs超抗原的致病機(jī)制，探討新的主動免疫治療手段，才可起到防治的目的。本研究通過對SEs氨基酸序列對比分析，設(shè)計并篩選對SEs具有廣譜抑制活性的多肽，并通過對該多肽空間結(jié)構(gòu)研究，探討其廣譜抑制功能的機(jī)制，為SEs相關(guān)疾病的防治提供新的手段。

1材料與方法

1.1抑制性多肽的設(shè)計根據(jù)已經(jīng)報道的SEs家族的氨基酸序列排列，對SEs的下列特征進(jìn)行研究。

SEs超抗原的氨基酸序列進(jìn)行對比分析，找出氨基酸序列的同源部分序列[2]。用Vector NTI 10.3軟件對SEs家族氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，并用Gene Doc軟件顯示和編輯比較結(jié)果。以SEB氨基酸序列作為肽設(shè)計的靶序列，并用Discovery Studio 1.7軟件對SEB和SEC超抗原與MHC 結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行顯示和分析。

1.2多肽的合成采用Fmoc固相合成多肽(上海生工生物工程有限公司)，色譜測定純度均為95%以上。

1.3蛋白質(zhì)序列檢索自瑞士生物信息研究所(Swiss Institute of Bioinformatics)提供的Swiss-Prot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http://expasy.hcuge.ch/sprot/index.htm)。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)包括SEA(PDB accession code:1SXT)、SEB(PDB accession code:3SEB)、SEC2 (PDB accession code:1STE)、SEB-HLA DR1(PDB accession code:1SEB)。

1.4分子模型的顯示、計算和結(jié)構(gòu)預(yù)測以PDB數(shù)據(jù)庫中的SEB 晶體結(jié)構(gòu)的對應(yīng)區(qū)域?yàn)槟０?，模擬了肽的三維結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)預(yù)測采用的是Sali等開發(fā)的一種基于“空間制約條件”的方法，計算工作均使用BIOSYM/MSI分子模擬系統(tǒng)，使用的軟件是InsightII 2000 及Discovery Studio v1.7。

2結(jié)果

2.1SEs超抗原與MHC 結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)對比分析對SEB和SEC超抗原的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比分析，結(jié)果顯示SEB和SEC的42~46位、92~98位氨基酸均與MHC直接接觸，而且呈線性，位于非結(jié)構(gòu)區(qū)域(圖1A,B)，因此，根據(jù)這些氨基酸序列可以設(shè)計抑制性多肽。

2.2SEs氨基酸序列同源性及其MHC、TCR結(jié)合位對比分析SEA、SEB、SEC3、SED和SEE的同源性在33%~81%之間，具有多個高度同源性保守區(qū)域(同源性超過80%)，已經(jīng)報道的SEs的某些MHC和TCR結(jié)合位于高度保守區(qū)。

2.3抑制性多肽的設(shè)計通過SEs氨基酸序列同源性及空間結(jié)構(gòu)的比較，根據(jù)SEs氨基酸序列保守區(qū)域及及其MHC和TCR的結(jié)合位，設(shè)計了9條多肽，這些多肽均位于氨基酸序列保守區(qū)，其中P40、P113包含MHC結(jié)合位，P11、P19、P91包含TCR結(jié)合位。經(jīng)過篩選，9條多肽中，P72能顯著抑制SEs的促人PBMC增殖活性，其余多肽抑制作用不明顯[3]。

2.4多肽P72的空間結(jié)構(gòu)多肽P72在SEA、SEB和SEC2中的同源序列見圖2，從P72在SEA、SEB和SEC2中的同源序列結(jié)構(gòu)圖中可以看出，P72在SEA、SEB和SEC的同源序列在空間結(jié)構(gòu)具有高度的相似性。

2.5多肽P72在TCRVβ-SEB-MHCⅡ空間結(jié)構(gòu)中的位置結(jié)果顯示，在TCRVβ-SEB-MHCⅡ三分子相互作用的空間結(jié)構(gòu)中，P72遠(yuǎn)離SEB的TCR和MHCⅡ結(jié)合位(圖3)，圖4示P72在SEB空間結(jié)構(gòu)中的位置。

3討論

金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxin，SE)是一類由金黃色葡萄球菌(Staphylococcal aureus)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，均為超抗原分子，其引起的疾病譜非常廣泛，毒性休克綜合征、多器官功能障礙綜合征、食物中毒、Kawasaki綜合征、多發(fā)性脈管炎、哮喘等多種疾病與SEs超抗原有

關(guān)[4-9]。因此針對SEs設(shè)計廣譜抑制性多肽，有望成為SEs相關(guān)疾病免疫防治的新手段。在前期的研究中，我們從SEs保守的同源氨基酸序列篩選出了一條廣譜抑制性多肽P72，能顯著抑制SEA、SEB、SEC三種超抗原促人PBMC增殖活性[3,10]。多肽P72能夠顯著抑制SEA、SEB和SEC的促PBMC增殖活性，顯示了其廣譜的抑制作用。多肽P72的氨基酸序列DLADKYKDKYVDVFG來源于超抗原SEB 的72~86位氨基酸殘基序列，這些序列位于SE家族中的同源保守部分，序列對比分析顯示SEA、SEB、SEC1和SEC2的72~86位氨基酸殘基序列同源性較高，與SEA的同位置的氨基酸序列相比，在15個氨基酸殘基中有9個相同，對于SEC1和SEC2則分別有10個和11個相同。空間結(jié)構(gòu)比對可以看出，SEA、SEB和SEC2所對應(yīng)的72~86位氨基酸序列的在空間結(jié)構(gòu)非常相似。國外的研究也表明SEB的76~86位氨基酸序列在SE家族中不僅顯示了序列的同源性，同時也顯示了空間的保守性[11]。因此P72能夠拮抗3種超抗原，顯示其廣譜抑制性。在前期研究的細(xì)胞模型結(jié)果顯示，P72能明顯抑制SEA、SEB、SEC刺激PBMC分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β，隨多肽的劑量增加而抑制作用增強(qiáng)，并可能為競爭抑制作用[3]，競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示P72對SEs的抑制作用可能不是與MHC Ⅱ類分子結(jié)合產(chǎn)生的。這與國外研究結(jié)果相反[12]，這可能是純化、修飾應(yīng)用于合成P72過程中，其空間結(jié)構(gòu)和性質(zhì)可能發(fā)生了變化[10]。

國外研究者Jett等[13]認(rèn)為其設(shè)計的多肽與SEs的氨基酸序列中參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖的某些保守區(qū)域結(jié)合而發(fā)揮抑制作用。Arad[12,14]沒有做相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，因此不清楚其設(shè)計的多肽P12是與MHC Ⅱ類分子還是TCRVβ鏈結(jié)合。Visvanathan等[15]研究了多肽6343的結(jié)合位點(diǎn)，利用人HLA-DR-1的ELISA結(jié)合試驗(yàn)研究了該肽分子與MHC Ⅱ類分子的結(jié)合活性，結(jié)果顯示多肽6343與MHC Ⅱ類分子具有很高的親和活性，表明此肽與SE競爭結(jié)合PBMC的MHC Ⅱ類分子的結(jié)合位點(diǎn)而發(fā)揮廣譜抑制作用。

超抗原能夠繞過主要組織相容性復(fù)合體的限制以及細(xì)胞內(nèi)抗原加工和提呈，直接與MHCⅡ類分子和TCR分子結(jié)合[16]。國外研究利用SEB與MHCⅡ類分子和TCR分子相互作用的三分子空間模型，研究設(shè)計的抑制性多肽的抑制活性功能，已經(jīng)有研究顯示了SEs家族的TCR的結(jié)合位點(diǎn)，如SEB的氨基酸序列81~93可能是TCR分子的結(jié)合位點(diǎn)[12,16,17]。P72的氨基酸序列來源于超抗原SEB的72~86位氨基酸序列，其中81~86位殘基部分地涉及801~93序列，有可能與TCR分子結(jié)合，但在TCRVβ-SEB-MHCⅡ三分子相互作用的空間結(jié)構(gòu)圖中，我們看到，P72遠(yuǎn)離SEB的TCR和MHCⅡ結(jié)合位，這表明SEB上的P72這段氨基酸序列可能既不與MHC也不與TCR結(jié)合，由于研究條件限制，P72與TCR結(jié)合的實(shí)驗(yàn)未能進(jìn)行，因此P72是否與TCR結(jié)合無法確定。

除了與MHC 和 TCR 結(jié)合產(chǎn)生抑制作用外，抑制性多肽還可能通過與 T 細(xì)胞或APC 上的受體結(jié)合誘導(dǎo)多肽適應(yīng)并模擬SEs超抗原分子上的對應(yīng)區(qū)域產(chǎn)生競爭抑制作用。如通過影響超抗原功能的協(xié)同刺激分子 (如 CD28/B7 和細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞抗原 4/B7 等)之間的相互作用而發(fā)揮抑制作用，P72 的抑制效應(yīng)是否為上述抑制途經(jīng)，有必要在將來的研究中探討[10,12,14]。 綜上，本研究運(yùn)用同源建模的方法，對P72的SEs廣譜抑制機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)多肽P72不與MHC結(jié)合，可能也不與TCR結(jié)合，其具體的抑制機(jī)制有必要在今后的研究中進(jìn)行探索，本研究可為SEs相關(guān)疾病的免疫防治提供線索和手段。

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[收稿2015-07-25修回2015-08-21]

(編輯許四平)----------------------------------------------

Study on design and three-dimension structure of a broad-spectrum inhibitory peptide against staphylococcal enterotoxins superantigen

WANGSi-Xiong，MAHui-Wen，WANGDong-Lin.ChongqingTumorInstitute,Chongqing400030,China

[Abstract]Objective:Peptides were designed on the basis of high conservative regions of amino acid sequences and structures of the SEs,three-dimension structure of P72 was constructed.Methods: Bioinformatics analysis softwares such as Vector NTI 10.3，InsightII 2000,Discovery Studio 1.7 were used to analyse and predict the space structure of P72.Results: three-dimensional domains of the peptide P72 from SEA,SEB and SEC were quite similar,Peptide P72 was far away from TCRVβ chain and MHC class II molecule.Conclusion: The inhibitory activity of peptide P72 may not due to binding to MHCⅡ and TCRVβ chain.The exact mechanism of inhibitory activity of P72 should be explored.

[Key words]Staphylococcal enterotoxin;Superantigen;Synthetic peptide

作者簡介：王思雄(1973年-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤免疫、分子免疫學(xué)方面的研究，E-mail:154055617@qq.com。

通訊作者①，E-mail:donglinw@21cn.com。

中圖分類號R392.11

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)02-0197-04