骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝豆?fàn)詈俗冃院喜⒏卫w維化肝功能的臨床研究①

張東鋒　王煜姝　滕軍放

(鄭州人民醫(yī)院，鄭州450003)

·生物治療·

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝豆?fàn)詈俗冃院喜⒏卫w維化肝功能的臨床研究①

張東鋒王煜姝滕軍放②

(鄭州人民醫(yī)院，鄭州450003)

[摘要]目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)治療對(duì)肝豆?fàn)詈俗冃愿卫w維化患者肝功能及其血清學(xué)指標(biāo)的影響。方法：將60例確診肝豆?fàn)詈俗冃愿卫w維化患者隨機(jī)分為：青霉胺組、BMSCs組和BMSCs+青霉胺組。無菌條件下進(jìn)行骨髓干細(xì)胞采集、分離、鑒定。青霉胺組：口服青霉胺(每日40 mg/kg),12周；BMSCs組：將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞液2 ml+生理鹽水100 ml經(jīng)外周靜脈移入人體，10 d 1次，3次為一個(gè)療程；BMSCs+青霉胺組：青霉胺(40 mg/kg)口服，12周，同時(shí)經(jīng)外周靜脈輸入BMSCs，方法同上。分別于治療0、4、8、12周檢測(cè)血總膽紅素(total bilirubin,TBIL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、白蛋白(Albumin，ALB)、膽堿酯酶活力(Cholinesterase,CHE)、血小板衍生生長因子-BB(Platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α) 的含量，并做組間比較，分別于治療前后做肝組織病理活檢。結(jié)果：BMSCs+青霉胺組肝組織活檢肝纖維化整體改善較其他兩組明顯；各組TBIL、ALT、ALB、CHE、PDGF-BB、TGF-β1、IL-6和TNF-α均持續(xù)降低，但BMSCs+青霉胺組中肝功能改善和細(xì)胞因子的降低比其他組更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：BMSCs聯(lián)合青霉胺治療對(duì)肝豆?fàn)詈俗冃院喜⒏卫w維化肝功能有明顯改善。

[關(guān)鍵詞]肝豆?fàn)詈俗冃?；肝功能；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；青霉胺

肝豆?fàn)詈俗冃?Hepatolenticular degeneration，HLD)因伴隨銅離子代謝失衡，常導(dǎo)致多器官受累。肝臟作為最主要的代謝場所更易受到損害，如若發(fā)展為肝硬化乃至失代償其治療更為棘手[1]。為探索HLD肝纖維化患者的治療，現(xiàn)收集我院肝豆?fàn)詈俗冃愿卫w維化患者，并使用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)聯(lián)合青霉胺治療，研究該治療對(duì)HLD合并肝纖維化患者肝功能以及相關(guān)細(xì)胞因子的改變。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料肝豆?fàn)詈俗冃曰颊吆喜⒏卫w維化患者來源于我院住院患者，均已明確診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡18~65歲；孕婦或哺乳期婦女；合并心、肺、腎等重要臟器功能不全者；嚴(yán)重感染者；伴有惡性腫瘤者；合并如肝性腦病、肝腎綜合征、上消化道大出血等嚴(yán)重并發(fā)癥患者；合并嚴(yán)重出血傾向者；過敏體質(zhì)等其他嚴(yán)重情況影響治療者。選取我院住院患者60例，男性32例，女性28例，年齡18~50歲，平均年齡(28.92±7.25)歲；入組患者生命體征平穩(wěn)，所有治療患者在知情同意的情況下，簽定《知情同意書》。

1.1.2藥物、試劑及儀器青霉胺(0.125 g/片，上海信誼制藥公司)，生理鹽水(100 ml，四川科倫藥業(yè)股份有限公司)，2%利多卡因(天津藥業(yè)集團(tuán))，DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，Percoll分離液(美國GE Healthcare公司)，酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(美國R&D)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組將符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者隨機(jī)分為三組：青霉胺組、BMSCs組、BMSCs+青霉胺組。①青霉胺組：給予青霉胺(40 mg/kg)口服，12周。②BMSCs組：將3×106細(xì)胞/ml的BMSCs液2 ml加入100 ml生理鹽水，經(jīng)外周靜脈移入人體，10 d1次，3次為一個(gè)療程。③BMSCs+青霉胺組：青霉胺(40 mg/kg)口服，12周，同時(shí)經(jīng)外周靜脈輸入BMSCs，方法同上。

1.2.2骨髓干細(xì)胞采集、分離、鑒定①術(shù)前做好患者思想工作，安撫緊張情緒。②無菌條件下，使用2%利多卡因局部麻醉，于雙側(cè)髂后上棘進(jìn)行骨髓穿刺，抽取骨髓約50~80 ml，加入肝素抗凝。③以2 000 r/min×20 min離心骨髓，去除上層脂肪細(xì)胞，用等量DMEM培養(yǎng)液將骨髓稀釋為細(xì)胞懸液。④將細(xì)胞懸液加入Percoll分離液，離心1 200 r/min ×25 min。⑤吸取細(xì)胞層，使用生理鹽水洗脫，1 500 r/min×5 min，重復(fù)3次。⑥使用生理鹽水重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)在1×108/L~10×108/L之間，4℃保存。⑦使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行BMSCs表面標(biāo)記測(cè)定： CD44、CD90為陽性(均大于90%)，CD34、CD45為陰性(均小于5%)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)室檢查分別于治療前和治療后4、8、12周抽取病人外周血5 ml，測(cè)定血中總膽紅素(Total bilirubin,TBiL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、白蛋白(Albumin，ALB)、膽堿酯酶活力(Cholinesterase,CHE)的值。測(cè)定血小板衍生生長因子-BB(Platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α) 、白介素6(Interle-ukin-6，IL-6)的含量，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法檢測(cè)，具體操作步驟詳見說明書。

1.2.4肝組織病理標(biāo)本實(shí)時(shí)B 超引導(dǎo)下經(jīng)皮肝組織穿刺活檢術(shù)，由配套活檢槍使用16G活檢針進(jìn)行，保證所取的肝組織標(biāo)本長1.2~1.8 cm。標(biāo)本經(jīng)連續(xù)切片后作常規(guī)伊紅染色和網(wǎng)狀纖維染色，根據(jù)1995年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病分會(huì)肝纖維化分期診斷標(biāo)準(zhǔn)，將纖維化分為S0~S4期。S0期，無纖維化；S1期，匯管區(qū)纖維化擴(kuò)大；S2期，匯管區(qū)周圍纖維化纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留；S3期，纖維間隔形成伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無肝硬化；S4期，早期肝硬化。(肝纖維化病理分期與肝血流動(dòng)力學(xué)、肝纖維化指標(biāo)的關(guān)系)。由專門的病理學(xué)醫(yī)師進(jìn)行診斷及分析。

2結(jié)果

2.1不同組血清中TBIL和ALT表達(dá)各組中治療12周后TBIL和ALT較治療前均有所降低，各組間相比較，BMSCs+青霉胺組降低最明顯，與青霉胺組、BMSCs組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05(圖1、2)。

2.2不同組血清中ALB和CHE表達(dá)各組中治療12周后ALB和CHE較治療前均有所升高，各組間相比較，BMSCs+青霉胺組升高最明顯，與青霉胺組、BMSCs組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05(圖3、4)。

2.3不同組血清細(xì)胞因子表達(dá)治療12周后各組中PDGF-BB、TGF-β1、IL-6和TNF-α各類細(xì)胞因子較治療前均降低，各組間相比較，BMSCs+青霉胺組降低最明顯，與青霉胺組、BMSCs組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05(圖5~8)。

2.4肝組織病理檢查結(jié)果肝組織病理檢查顯示青霉胺組纖維化分期2例由S2期變?yōu)镾1期，BMSCs組5例由S2期變?yōu)镾1期，3例由S3期變?yōu)?/p>

S2期，BMSCs+青霉胺組7例由S2期變?yōu)镾1期，3例由S3期變?yōu)镾2期，3例由S3期變?yōu)镾1期，2例由S4期變?yōu)镾3期(圖9)。

3討論

HLD由于銅離子排泄障礙而在肝內(nèi)緩慢蓄積，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，纖維組織增生，引起細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)在肝內(nèi)不斷沉積，進(jìn)而導(dǎo)致纖維化。肝纖維化是肝臟受到慢性損傷時(shí)發(fā)展為肝硬化的初期階段，而肝纖維化甚至早期肝硬化可以逆轉(zhuǎn)已成為共識(shí)[2,3]。因此探討HLD肝臟受損初期改善肝功能逆轉(zhuǎn)肝纖維化的治療就顯得尤其重要。

BMSCs因易于取材，便于分離培養(yǎng)，具有較強(qiáng)的分化潛能，并且可自體移植，越來越受到學(xué)者們的青睞，被認(rèn)為是不久即將被引入臨床治療的最優(yōu)干細(xì)胞。目前國內(nèi)外有大量研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過分化為肝細(xì)胞進(jìn)而有效改善肝功能，并且有較少的副作用[4-6]。肝纖維化進(jìn)程中PDGF-BB、TGF-β1等細(xì)胞因子發(fā)揮著關(guān)鍵作用，多種細(xì)胞因子參與肝星狀細(xì)胞的激活和肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展[7,8]。

PDGF是近年來開始研究的一個(gè)細(xì)胞因子,在肝纖維化形成過程中發(fā)揮重要作用[9]。研究表明PDGF-BB在肝纖維化進(jìn)展過程中更為重要[10]。血清PDGF-BB水平可以影響肝臟損傷和肝纖維化[11]。已有研究表明PDGF可以通過激活PDGF-b R/NLRP3/caspase1 通路促進(jìn)炎癥因子的釋放[12]。BMSCs可能通過干擾PDGF信號(hào)通路引起血清中PDGF減少而發(fā)揮改善肝功能的作用，但具體分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)BMSCs和青霉胺治療后炎癥因子TGF-β1、TNF-α、IL-6均有所下降。青霉胺可以促進(jìn)銅排出，減輕肝臟損傷，BMSCs促進(jìn)肝細(xì)胞恢復(fù)再生，進(jìn)而導(dǎo)致影響肝功能的炎癥因子減少。TGF-β1在肝纖維化初期發(fā)揮關(guān)鍵作用，主要作用是促進(jìn)ECM合成并抑制其降解，血漿TGF-β1水平與肝纖維化程度正相關(guān)[13]。研究發(fā)現(xiàn)一些miRNAs(如miR-31)可以通參與TGF-β/Smad3信號(hào)通路調(diào)節(jié)肝纖維化[14]。TNF-α可以通過活化TGF-β和PDGF等細(xì)胞因子并與之形成調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶參與肝纖維化[15,16]。TNF-α與PDGF等細(xì)胞因子可導(dǎo)致Kupffer細(xì)胞大量釋放炎癥因子,進(jìn)而參與肝損傷過程[17]。IL-6可以聯(lián)合TNF-α共同刺激Kupffer細(xì)胞，釋放諸如TGF、PDGF等細(xì)胞因子,形成正反饋?zhàn)饔?產(chǎn)生更多的ECM[18]。可見BMSCs和青霉胺可以降低血清中多種細(xì)胞因子的表達(dá)，有利于促進(jìn)肝功能的恢復(fù)，但其具體分子機(jī)制不一而同，需要進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)才能驗(yàn)證。 總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)在運(yùn)用青霉胺聯(lián)合BMSCs治療HLD肝纖維化時(shí)，可能通過協(xié)同作用降低各類損傷肝臟的細(xì)胞因子進(jìn)而使肝功能得到改善。國內(nèi)外已有大量研究表明干細(xì)胞移植可以緩和肝纖維化，改善肝功能，并且具有較廣泛的應(yīng)用范圍[19,20]。進(jìn)一步提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療技術(shù)有望在治療HLD肝纖維化中得到更廣泛的臨床應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1]Aggarwal A,Bhatt M.Update on wilson disease[J].2013:313-348.

[2]Wallace KD,Burt AD，Wright MC.Liver fibrosis[J].Biochem J,2008,411(1):1-18.

[3]Zischka H,Lichtmannegger J.Pathological mitochondrial Copper overload in livers of Wilson′s disease patients and related animal models[J].Ann NY Acad Sci，2014，6:15.

[4]Usunier B.Management of fibrosis:the mesenchymal stromal cells breakthrough[J].Stem cell Int，2014，2014:3402-3457.

[5]Dong S,Su SB.Advances in mesenchymal stem cells combined with traditional Chinese medicine therapy for liver fibrosis[J].J Integr Med,2014,12(3):147-155.

[6]Kim N,Cho SG.Clinical applications of mesenchymal stem cells[J].Korean J Intern Med,2013,28(4):387-402.

[7]Elpek GO.Cellular and molecular mechanisms in the pathogenesis of liver fibrosis:An update[J].World Journal of Gastroenterology,2014,20(23):7260-7276.

[8]Nakamura I,Zakharia K,Banini BA,etal.Brivanib attenuates hepatic fibrosis in vivo and stellate cell activation in vitro by inhibition of FGF,VEGF and PDGF signaling[J].PLoS One,2014,9(4):e92273.

[9]Czochra P,Klopcic B,Meyer E,etal.Liver fibrosis induced by hepatic overexpression of PDGF-B in transgenic mice[J].J Hepatol,2006,45(3):419-428.

[10]Zhang BB,Cai WM,Weng HL,etal.Diagnostic value of platelet derived growth factor-BB,transforming growth factor-beta1,matrix metallopr-oteinase-1,and tissue inhibitor of matrix metallopro-teinase-1 in serum and peripheral blood mononuclear cells for hepatic fibrosis[J].World J Gastroenterol,2003,9(11):2490-2496.

[11]Diang XC,Ma LN,Li YF,etal.Association between serum platelet-derived growth factor BB and degree of liver damage,fibrosis and hepatitis B e antigen (HBeAg) status in CHB patients[J].Hepatogastroenterology,2013,59(120):2357-2360.

[12]Wu X,Zhang F,Xiong X,etal.Tetramethylpyrazine reduces inflammation in liver fibrosis and inhibits inflammatory cytokine expression in hepatic stellate cells by modulating NLRP3 inflammasome pathway[J].IUBMB Life,2015,67(4):312-321.

[13]Lee HJ.Sauchinone attenuates liver fibrosis and hepatic stellate cell activation through TGF-beta/Smad signaling pathway[J].Chem Biol Interact，2014,224C：58-67.

[14]Hu J,Chen C,Liu Q,etal.The role of the miR-31/FIH1 pathway in TGF-β-induced liver fibrosis[J].Clin Sci (Lond),2015,129(4):305-317.

[15]Amara S，Lopez K，Banan B，etal.Synergistic effect of pro-inflammatory TNFalpha and IL-17 in periostin mediated collagen deposition:potential role in liver fibrosis[J].Mol Immunol，2015,64(1)：26-35.

[16]Zhou L，Yan C，Gieling RG，etal.Tumor necrosis factor-alpha induced expression of matrix metalloproteinase-9 through p21-activated kinase-1[J].BMC Immunol，2009,10:15.

[17]Klironomos S.Octreotide modulates the effects on fibrosis of TNF-alpha,TGF-beta and PDGF in activated rat hepatic stellate cells[J].Regul Pept，2014,188:5-12.

[18]Choi GS,Lee MG.Analysis of methods for the generation of dendritic cells from human peripheral blood monocytes[J].Yonsei Med J,2000,41(5):642-650.

[19]Sakaida I.Autologous bone marrow cell infusion therapy for liver cirrhosis--now and future[J].Rinsho Byori,2011.59(12):1092-1098.

[20]Alison MR,Lim S.Stem cells in liver regeneration,fibrosis and cancer:the good,the bad and the ugly[J].J Pathol,2009,217(2):282-298.

[收稿2015-04-20修回2015-09-28]

(編輯倪鵬)

Clinical research about liver function of hepatolenticular degeneration combined liver fibrosis by transplantation of bone marrow stem cells

ZHANGDong-Feng，WANGYu-Shu，TENGJun-Fang.ZhengzhouPeople′sHospital，Zhengzhou450003，China

[Abstract]Objective:To evaluate the influence of bone marrow stem cells (BMSCs) in the serological indicators of hepatolenticular degeneration combined liver fibrosis.Methods: 60 cases were randomly divided into 3 groups: penicillamine group, BMSCs group and BMSCs+penicillamine group.BMSCs(2 ml)were injected into vein with normal saline(100 ml) every 10 days ( 3 times for a period of treatment).Liver tissue pathology biopsy was inspected and TBIL, ALT, ALB, CHE, PDGF-BB, TGF-β1, IL-6 and TNF-α were detected at 0,4,8 and 12 weeks.Results: The level of serological indicators about liver functions were reduced in every group, while the changes in BMSCs+penicillamine group were especially obvious (P<0.05).Conclusion: Penicillamine combined with BMSCs was effective in the improvement of liver functions of hepatolenticular degeneration combined liver fibrosis.

[Key words]Hepatolenticular degeneration；Liver function;Bone marrow stem cells；Penicillamine

作者簡介：張東鋒(1976年-)，男，在讀博士，副主任醫(yī)師，主要從事運(yùn)動(dòng)障礙病方面研究，E-mail:zhangdongfeng_hn@163.com。

中圖分類號(hào)R742.4
①本文為鄭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(121PPTGG494-1)。
②鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州450052。

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)02-0193-05