黃芪多糖對(duì)甲流HA2蛋白真核表達(dá)載體免疫效果影響的研究①

褚兆蘋　吳淑慧　劉文泰　馬志紅　徐丙元　羅　俊　曹　剛　徐華洲　石玉娥　戴　軍

(河北省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，石家莊050051)

黃芪多糖對(duì)甲流HA2蛋白真核表達(dá)載體免疫效果影響的研究①

褚兆蘋吳淑慧②劉文泰②馬志紅②徐丙元②羅俊③曹剛②徐華洲②石玉娥②戴軍②

(河北省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，石家莊050051)

①本文受河北中醫(yī)學(xué)院博士科研基金(BSZ2014002)和河北省衛(wèi)生廳課題(20130139)資助。

②河北中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，石家莊050200。

③四川大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院微生物教研室，成都610041。

[摘要]目的：檢驗(yàn)不同劑量黃芪多糖對(duì)甲流HA2蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒免疫大鼠效果的影響。方法：首先，將編碼HA2的質(zhì)粒pHA2/EGFP轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，通過PT-PCR和熒光檢驗(yàn)其在真核細(xì)胞中的表達(dá)效果。然后將60只大鼠隨機(jī)分為6組，分別注射pEGFP-N1、生理鹽水和pHA2/EGFP加不同濃度的黃芪多糖，注射前收集大鼠血清作為對(duì)照，據(jù)最后一次注射后第36天處死各組大鼠收集各組大鼠的血清，測(cè)量血清中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4和血清中IgG對(duì)不同流感毒株血凝素的反應(yīng)情況。結(jié)果：pHA2/EGFP+中等劑量APS組的IFN-γ、IL-4和血清中IgG對(duì)血凝素的反應(yīng)情況均與低劑量組和陰性對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)。pHA2/EGFP+中等劑量APS組的細(xì)胞因子水平和對(duì)血凝素反應(yīng)與高劑量組無顯著性差別(P>0.05)。結(jié)論：中等劑量的黃芪多糖能增強(qiáng)甲流HA2蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒的免疫效果。

[關(guān)鍵詞]流感病毒；血凝素；IFN-γ；IL-4

甲型流感病毒是由八個(gè)RNA片段和其編碼的蛋白組成的正黏液病毒，該病毒導(dǎo)致了很多次流感世界性大流行[1,2]，每次世界性大流行均給世界造成了很大損失，所以預(yù)防甲型流感病毒的感染非常重要。組成流感病毒的蛋白中與預(yù)防關(guān)系最為密切的是血凝素(Hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)，針對(duì)HA的抗體可以阻止流感病毒侵入細(xì)胞，從而起到很好的預(yù)防作用。但HA變異非常厲害，這導(dǎo)致流感病毒能夠逃脫人體免疫的監(jiān)視，這也是甲流病毒反復(fù)流行的重要原因。

如何更有效地預(yù)防甲型流感病毒？我們通過下載National Center for Biotechnology Information (NCBI)上不同流感病毒HA序列并進(jìn)行序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)甲型流感病毒HA的序列中自N段開始從350號(hào)氨基酸到C段的氨基酸序列在不同流感病毒株之間序列比較保守，該序列位于流感病毒HA的尾端(HA2)，所以如果我們能夠誘導(dǎo)出針對(duì)HA2的有效免疫，那么我們就能更有效地控制不同流感病毒株的感染。但HA2在自然界中免疫原性比較差[3,4]，所以提高HA2的免疫原性就非常重要。黃芪多糖(Astragalus polysaccharides increase，APS)具有調(diào)節(jié)免疫作用[5]，一定劑量的黃芪多糖對(duì)免疫細(xì)胞有刺激作用，那么APS是否能夠能提高表達(dá)HA2的真核表達(dá)載體的免疫原性？針對(duì)這個(gè)問題，我們?cè)O(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料pEGFP-N1購自美國的Clontech公司，HA2序列(A/PR/8/34的HA部分序列，自羥基端開始從1050號(hào)核苷酸到1730號(hào)核苷酸序列)由英韋創(chuàng)津公司合成。實(shí)驗(yàn)前我教研室已經(jīng)將HA2序列插入pEGFP-N1中，酶切位點(diǎn)為EcoRⅠ和BamHⅠ，此質(zhì)粒命名為pHA2/EGFP。CHO細(xì)胞系購自美國ATCC。Escherichia coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞購于全式金生物技術(shù)有限公司。雄性Wistar 大鼠60只，12 周齡，體重(200±20)g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)SCXK(冀)2014-1-003]，清潔級(jí)。

1.1.2儀器微量臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Thermo 公司)；微量可調(diào)加樣器(Eppendorf)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，TGL-18C)；基因擴(kuò)增儀(Thermo 公司，TCP0096)；電泳儀(北京六一儀器廠，DYCZ-20C)；酶標(biāo)儀(北京六一儀器廠，WD-2103A)；凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂公司，GelDoc XR+)等。

1.1.3藥物與試劑黃芪多糖購自西安沃森生物科技有限公司；不同株流感病毒純HA蛋白H5和H1均購自BD公司；RT-PCR試劑盒購自北京全式金生物公司；HRP標(biāo)記的羊抗大鼠IgG抗體購自北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司；組織裂解液購自武漢博士德公司；IFN-γ和IL-4 ELISA試劑盒購自武漢博士德公司；Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞用含有10%FBS、1%青鏈霉素的1640培養(yǎng)基，在5%CO2、37℃條件下在六孔板中培養(yǎng)。培養(yǎng)至細(xì)胞匯合約60%時(shí)，按Lipofectamine 2000試劑盒說明書將質(zhì)粒pHA2/EGFP和pEGFP-N1轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，以生理鹽水(NS)作為空白對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h后，觀察EGFP綠色熒光表達(dá)情況。

1.2.2HA2基因表達(dá)的檢測(cè)收集各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按照RT-PCR試劑盒要求提取總RNA后，做RT-PCR。HA2的上游引物為CCGCTCGAGTATTGAAGGGGGATGGA，下游引物為CGCGGATCCTCATATTTCTGAAATTCTAAT，長度為700 bp。RT-PCR條件參照試劑盒要求條件進(jìn)行。RT條件如下：采用20 μl體系，第一鏈cDNA合成溫度為42℃，30 min；PCR條件為95℃，5 min。95℃，30 s，56℃，30 s，72℃，60 s，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后，進(jìn)行電泳。電泳條件為含溴化乙錠的1%的瓊脂糖凝膠上樣后，100 V，45 min，電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下照相。

1.2.3動(dòng)物分組Wistar大鼠60只，隨機(jī)分為六組，每組10只。六組分別是pEGFP-N1組、pHA2/EGFP+高劑量APS組(pHA2/EGFP+high dose of APS，pHA2/EGFP+hAPS)、pHA2/EGFP+中劑量APS組(pHA2/EGFP+medium dose of APS，pHA2/EGFP+mAPS)、pHA2/EGFP+低劑量APS組(pHA2/EGFP+low dose of APS，pHA2/EGFP+lAPS)、pHA2/EGFP組和生理鹽水組(Normal saline，NS)。pEGFP-N1組給予大鼠雙側(cè)后腿股四頭肌肌內(nèi)注射pEGFP-N1空質(zhì)粒共100 μg，每側(cè)各50 μg，共注射兩次，間隔3周；pHA2/EGFP+hAPS組給予pHA2/EGFP共100 μg，每側(cè)各50 μg，共注射兩次，間隔3周，同時(shí)腹腔注射黃芪多糖0.9 g/(kg·d)，連續(xù)腹腔注射3周；pHA2/EGFP+mAPS組在注射pHA2/EGFP同時(shí)腹腔注射黃芪多糖0.5 g/(kg·d)，連續(xù)腹腔注射3周；pHA2/EGFP+lAPS在注射pHA2/EGFP同時(shí)腹腔注射黃芪多糖0.1 g/(kg·d)，連續(xù)腹腔注射3周；pHA2/EGFP組給予pHA2/EGFP共100 μg，每側(cè)各50 μg，共注射兩次，間隔3周；生理鹽水組給予生理鹽水每側(cè)各50 μl，共注射兩次，間隔3周。

1.2.4標(biāo)本收集以上各組給藥前收集大鼠尾靜脈血液，分離血清，標(biāo)記為免疫前血清，置-70℃?zhèn)溆谩Ｗ詈笠淮谓o藥結(jié)束36 d處死各組大鼠，收集各組大鼠的血液，分離血清，標(biāo)記為免疫后血清置-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5血清細(xì)胞因子測(cè)定按照博士德公司的IFN-γ和IL-4 ELISA試劑盒說明書測(cè)定保存血清的IFN-γ和IL-4水平。

1.2.6抗體水平測(cè)定將H1和H5用PBS稀釋至200 ng/ml，再向空白ELISA板每孔中加入100 μl H1或H5，4℃包被過夜，封閉液洗滌待用。將各組血清分別加入包被好的各個(gè)孔中，每個(gè)孔加入100 μl血清，4℃過夜，洗滌，然后每孔中在加入100 μl稀釋后的HRP標(biāo)記的羊抗大鼠IgG抗體(1∶5 000稀釋)，洗滌后加入底物顯色10 min，終止反應(yīng)后測(cè)定490 nm的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)標(biāo)本取平均值作為結(jié)果。

2結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒pHA2/EGFP的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和鑒定重組質(zhì)粒pHA2/EGFP按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后觀察GFP的綠色熒光表達(dá)情況。如圖1所示pHA2/EGFP和pEGFP-N1組均有熒光出現(xiàn)。如圖1、2所示，收集各組細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR后只有pHA2/EGFP組出現(xiàn)700 bp左右的條帶。

2.2各組大鼠血清細(xì)胞因子水平各組大鼠血清細(xì)胞因子變化如表1所示，pHA2/EGFP+mAPS組血清IL-4水平和IFN-γ水平與pHA2/EGFP+lAPS組有顯著性差異(P<0.05)。pHA2/EGFP+mAPS組血清IL-4水平和IFN-γ水平與pEGFP-N1組有差異(P<0.05)。pHA2/EGFP+mAPS組血清IL-4水平和IFN-γ水平與pHA2/EGFP+hAPS組無顯著性差異(P>0.05),pEGFP-N1組與生理鹽水組無顯著性差異(P>0.05)，pHA2/EGFP組與pHA2/EGFP+lAPS組無顯著性差異(P>0.05)。

2.3各組大鼠血清IgG水平如表2和表3所示，免疫前各組血清無顯著性差別。免疫后pHA2/EGFP組、pHA2/EGFP+lAPS組、pHA2/EGFP+mAPS組和pHA2/EGFP+hAPS組血清IgG水平與免疫前上述組血清有顯著性差異(P<0.05)。當(dāng)使用H1包被ELISA板時(shí)，pHA2/EGFP+mAPS組測(cè)得反映血清IgG量的OD值與pHA2/EGFP+lAPS組和pEGFP-N1組均有顯著性差異(P<0.05)。pHA2/EGFP組與pHA2/EGFP+lAPS組無顯著性差異(P>0.05)。當(dāng)使用H5包被ELISA板時(shí)，我們也得到了相似結(jié)果，區(qū)別只是使用H5包被ELISA板時(shí)，測(cè)得的OD值低于使用H1包被ELISA板得到的OD值。免疫前各血清OD值無顯著性差別(P>0.05)。當(dāng)使用H1或H5包被ELISA板時(shí)，pHA2/EGFP+mAPS組測(cè)得反映血清IgG量的OD值與pHA2/EGFP+hPS無顯著性差別(P>0.05)。pHA2/EGFP組與pHA2/EGFP+lAPS組無顯著性差異(P>0.05)。

Note：vs pHA2/EGFP+lAPS,1)P<0.05;vs pHA2/EGFP，2)P<0.05；vs pHA2/EGFP+hAPS，3)P>0.05.

Note：vs pHA2/EGFP+lAPS，1)P<0.05；vs pEGFP-N1，2)P<0.05.

Note：vs pHA2/EGFP+lAPS，1)P<0.05；vs pEGFP-N1，2)P<0.05.

3討論

甲型流感病毒屬于正黏病毒科RNA病毒，其核酸由八個(gè)片段組成。甲型流感病毒以感染肺部為主，具有明顯的嗜肺性[6]。該毒曾經(jīng)數(shù)次引起世界性大流行，給世界造成很大損失，以預(yù)防甲流病毒非常重要。在預(yù)防甲流病毒方面，位于甲流病毒表面的HA非常重要[7,8]。HA包括兩個(gè)部分，分別是位于頭端的HA1和位于尾端的HA2。有報(bào)道認(rèn)為，抗HA的抗體能很好阻止甲流病毒進(jìn)入靶細(xì)胞。所以如果能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量抗HA的抗體，就可以很好預(yù)防甲流病毒。但甲流HA包括H1、H5等數(shù)個(gè)血清型且變異頻率非常高，這給甲流病毒的預(yù)防帶來了很大困難。

我們通過對(duì)不同毒株的甲流病毒HA分析發(fā)現(xiàn)，甲流病毒HA的尾端(HA2)非常保守[3,4]，如果能夠誘導(dǎo)出針對(duì)HA2的抗體我們就可以很好地預(yù)防甲流病毒，但HA2 免疫原性比較差，如何增強(qiáng)HA2的免疫原性就顯得非常重要。而很多文章報(bào)道，中藥黃芪的主要成分黃芪多糖能夠調(diào)節(jié)免疫，那么黃芪多糖是否可以用于增強(qiáng)HA2的免疫原性？我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)一定劑量[0.5 g/(kg·d)]黃芪多糖與表達(dá)HA2的真核表達(dá)載體聯(lián)用確實(shí)能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更多的IFN-γ和IL-4，但當(dāng)劑量過低時(shí)并不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ和IL-4，甚至當(dāng)抑制免疫的一些藥物與黃芪多糖同時(shí)使用時(shí)，黃芪多糖可能還會(huì)在一定程度上抑制免疫，以前我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說明了這一點(diǎn)[9]，這個(gè)現(xiàn)象的機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。IFN-γ與細(xì)胞免疫關(guān)系密切，在機(jī)體中可以起到抗病毒作用[10]。而黃芪多糖誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更多IFN-γ就意味著黃芪多糖能夠增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫。IL-4與體液免疫關(guān)系密切[11]，黃芪多糖誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更多IL-4，就意味著黃芪多糖能夠增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫。而血清IgG的結(jié)果也證實(shí)當(dāng)使用中等劑量黃芪多糖時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生的抗體確實(shí)增加了，這也從一個(gè)側(cè)面說明體液免疫得到了有效加強(qiáng)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還說明超過中等劑量的黃芪多糖并不能無限增強(qiáng)免疫，這提示我們今后使用黃芪多糖時(shí)，劑量不是越大越好的。

HA2上存在很多保守的表位[3,4]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)使用A/PR/8/34(H1N1)的HA2免疫大鼠可以使大鼠產(chǎn)生抗體能同時(shí)對(duì)抗H1和H5。以前，我們使用小鼠也得出相同的結(jié)果[3,4]，這說明使用表達(dá)HA2的質(zhì)粒免疫不同動(dòng)物確實(shí)可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生能結(jié)合多種HA的抗體，這些研究為馬上進(jìn)行的臨床試驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。有意思的是抗體與H5結(jié)合的能力略小于與H1的結(jié)合能力，這說明H5的HA2部分與H1有部分差別。盡管這樣，抗體與H5結(jié)合力仍遠(yuǎn)大于陰性對(duì)照。這說明使用H1的HA2部分誘導(dǎo)出的抗體也能結(jié)合H5。在血凝素為H5的毒株中有相當(dāng)多的是禽流感，有部分甚至是高致病性的禽流感，這些禽流感致死率高，而且因?yàn)閷?duì)禽類也有很高致死率，所以使用國際通用的雞胚來生產(chǎn)疫苗的方法，如果用來生產(chǎn)抗高致病性禽流感的疫苗將非常困難，而且禽流感在我們也時(shí)常發(fā)生，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也為生產(chǎn)這種抗高致病性禽流感的疫苗找到了一種方法。

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[收稿2015-08-15修回2015-09-15]

(編輯張曉舟)

Research of astragalus polysaccharides increasing immune effect of influenza A virus HA2 eukaryotic expression vector

CHUZhao-Ping,WUShu-Hui,LIUWen-Tai,MAZhi-Hong,XUBing-Yuan,LUOJun,CAOGang,XUHua-Zhou,SHIYu-E,DAIJun.DepartmentofGynaecologyandObstetrics,GeneralHospitalofHebeiProvince,Shijiazhuang050051，China

[Abstract]Objective:To study the astragalus polysaccharides (APS) effect on immune induced by influenza A virus HA2 eukaryotic expression vector.Methods: The HA2 encoded by the DNA vaccine vector was efficiently expressed in CHO cells,as determined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and fluorescence analysis.60 rats were divided into six groups randomly,which were immunized with normal saline,pEGFP-N1,pHA2/EGFP+different dose of APS by intramuscular injection.The control sera were collected before injection.After injected the 36th day,sera were collected to analyzing IFN-γ,IL-4 and IgG level.Results: IFN-γ,IL-4 and IgG level of pHA2/EGFP+mAPS group was different from that of pEGFP-N1 group or pHA2/EGFP +lAPS group(P<0.05).Conclusion: Middle dose of APS could increase immune induced by influenza A virus HA2 eukaryotic expression vector.

[Key words]Influenza A virus;Hemagglutinin;IFN-γ;IL-4

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.010

通訊作者及指導(dǎo)教師：戴軍(1976年-)，男，博士，講師，主要從事核酸疫苗研究工作，E-mail:calldj@163.com。

作者簡介：褚兆蘋(1978年-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事婦科感染性疾病研究，E-mail：2582079419@qq.com。

中圖分類號(hào)R373.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)02-0189-05