兔骨髓細(xì)胞與PLGA/HA多孔支架和人同種骨植入材料（異體骨）相容性的對(duì)比研究

李忠義 冀 希（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院手外科，遼寧 沈陽(yáng) 110024）

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兔骨髓細(xì)胞與PLGA/HA多孔支架和人同種骨植入材料（異體骨）相容性的對(duì)比研究

李忠義 冀 希
（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院手外科，遼寧 沈陽(yáng) 110024）

【摘要】目的 探討新型多孔聚乳酸乙醇酸（polylac-ficglycolic acid，PLGA）/羥基磷灰石（hydroxyap-atite，HA）的復(fù)合支架材料（即PLGA/HA）相容性。方法 兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞（即BMSCs）用貼壁法行體外礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)、擴(kuò)增后，分別與實(shí)驗(yàn)A組（含10%HA的PLGA/HA和實(shí)驗(yàn)B組（即異體骨）行體外復(fù)合培養(yǎng)，定性和定量法檢測(cè)材料表面BMSCs的黏附能力和增殖活力以證實(shí)復(fù)合體成骨活性，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果 兩組均可見(jiàn)兔BMSCs生長(zhǎng)，并在支架材料表面形成鈣結(jié)節(jié)，兩組細(xì)胞黏附和增殖能力無(wú)明顯差異。結(jié)論 兔BMSCs與PLGA/HA支架材料和的異體骨具有相似的體外相容性，PLGA/HA可以作為異體骨替代材料。

【關(guān)鍵詞】兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞；聚乳酸乙醇酸/羥基磷灰石支架；異體骨；組織工程

骨缺損畸形修復(fù)作為整形、頜面外科等學(xué)科研究的重點(diǎn)，隨著支架材料的創(chuàng)新，其治療思路發(fā)生了重要轉(zhuǎn)變。本文通過(guò)對(duì)比PLGA/HA與異體骨支架的相容性，旨在為臨床支架材料的發(fā)展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料：大白兔3只，月齡3個(gè)月，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，PLGA/HA（沈陽(yáng)工業(yè)大學(xué)材料系制作），異體骨（異種異體骨），低糖DMEM培養(yǎng)基（?？寺。?，胎牛血清（新西蘭進(jìn)口），胰蛋白酶，四環(huán)素鹽酸鹽（Sigma），堿性磷酸酶（AKP）測(cè)試盒+4（南京建成），層流超凈臺(tái)，三洋（SANYO）CO2培養(yǎng)箱，Nikon TE2000-S倒置顯微鏡，中佳（Zokia）低速離心機(jī)，25 cm2及75 cm2培養(yǎng)瓶，六孔培養(yǎng)皿。

1.2 方法

1.2.1 分離培養(yǎng)兔BMSCs：局部麻醉起效后，無(wú)菌條件下在兔股骨大轉(zhuǎn)子部位抽取2 mL骨髓，無(wú)菌管收集后添加肝素，離心（1500 r/min）10min，去除上清液，添加標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液，吹散細(xì)胞團(tuán)置于培養(yǎng)瓶中在37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)，隔日換液1次。待約80%細(xì)胞發(fā)生融合后，去凈培養(yǎng)液，添加0.25%胰酶消化2 min，待細(xì)胞團(tuán)縮后，添加培養(yǎng)液，吹打未脫落細(xì)胞置入離心管，吹打分散均勻，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞懸液再次離心，棄上清液，添加標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液，均勻接種在培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)，3 d換液1次，待80%細(xì)胞融合時(shí)再次傳代。

1.2.2 制備支架材料：PLGA/HA材料和異體骨材料分別用誘導(dǎo)培養(yǎng)液浸泡，預(yù)濕24 h后，用濾紙吸干材料內(nèi)液體，備用。

1.2.3 接種細(xì)胞：取第3代兔BMSCs，經(jīng)消化后調(diào)整細(xì)胞濃度至1× 106/mL，將細(xì)胞懸液分別接種在支架材料和異體骨上至飽和。培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，再次接種細(xì)胞達(dá)1×105/mL，添加誘導(dǎo)培養(yǎng)液將材料浸泡后在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔日換液。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)：應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況。計(jì)數(shù)細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞黏附率和增殖情況，用酶聯(lián)免疫法定量檢測(cè)堿性磷酸酶（alka line phosphatase，ALP）活性。用熒光顯微鏡下利用四環(huán)素?zé)晒馊旧ㄓ^察鈣結(jié)節(jié)形成情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SAS6.1版本軟件分析數(shù)據(jù)，定量資料用t檢驗(yàn)分析，P＜0.05，差異具有顯著性。

2 結(jié) 果

兔BMSCc原代細(xì)胞培養(yǎng)5d后開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)并形成克隆，而且經(jīng)過(guò)復(fù)合培養(yǎng)后，材料表面均可見(jiàn)綠色熒光，提示鈣結(jié)節(jié)形成。PLGA/HA組細(xì)胞黏附率為34%，異體骨組細(xì)胞黏附率為32%，接種后第3天和第7天時(shí)PLGA/HA組和異體骨組細(xì)胞計(jì)數(shù)相仿，接種培養(yǎng)第7天，PLGA/HA組ALP活性為（4.31±0.26），異體骨組ALP活性為（4.41± 0.23），第14天時(shí)，PLGA/HA組ALP活性為（7.01±0.51），異體骨組ALP活性為（7.25±0.53），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析上述各項(xiàng)指標(biāo)兩組間均無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

3 討 論

隨著組織材料的發(fā)展，骨缺損修復(fù)效果得到了明顯提高，支架材料作為骨組織工程重點(diǎn)研究課題，一直受到臨床的廣泛關(guān)注，尤其是復(fù)合材料研究更是備受關(guān)注［1］。PLGA和HA作為最常用的復(fù)合物，其中PLGA屬于有機(jī)高分子材料，具有較好的生物相容性，但是由于親水性較差，而且缺乏骨誘導(dǎo)性，因此黏附能力、機(jī)械強(qiáng)度以及功能修復(fù)存在一定的缺陷。HA作為骨組織重要的無(wú)機(jī)成分，細(xì)胞親和度較好、抗壓強(qiáng)度較高，相關(guān)研究認(rèn)為將PLGA和HA復(fù)合后不僅能夠降低降解速度，而且能夠提高材料強(qiáng)度、中和部分酸性產(chǎn)物。雖然關(guān)于PLA/HA組織支架制作的研究較多［2-3］，但是目前臨床極少涉及應(yīng)用PLGA/HA支架材料進(jìn)行骨組織修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兔BMSCs于PLGA/HA支架材料和異體骨分別進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)后，兩種支架材料均能夠在組織表面存活、增殖，而且二者間的細(xì)胞黏附率、鈣結(jié)節(jié)形成情況、細(xì)胞增殖情況以及ALP活性均無(wú)明顯差異，表明PLGA/HA材料與骨細(xì)胞的結(jié)合能力與異體骨相似，而且其生物相容性與異體骨不存在明顯差異，因此我們認(rèn)為PLGA/HA可以替代異體骨進(jìn)行骨修復(fù)，進(jìn)行PLGA/HA支架修復(fù)骨缺損動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)研究具有科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］ 王紅忠，姚志文，楊安.多孔細(xì)菌纖維素/聚乳酸-羥基乙酸聚合物/羥基磷灰石復(fù)合纖維支架生物相容性研究［J］.中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2013，19（19）:4-5.

［2］ 姚志文，李紅玖，劉唯，等.多孔細(xì)菌纖維素-聚乳酸乙醇酸復(fù)合支架制備及性能研究［J］.現(xiàn)代醫(yī)院，2012，12（6）:12-14.

［3］ 張世杰，裴國(guó)獻(xiàn)，潘可風(fēng)，等.新型多孔PLGA/HA復(fù)合支架體外細(xì)胞相容性的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)美容整形外科雜志，2007，18（2）: 98-101.

中圖分類(lèi)號(hào)：R687

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1671-8194（2016）12-0033-01

基金項(xiàng)目：沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院科技基金項(xiàng)目：20142042