RUNX3 甲基化在非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者中的表達(dá)

岳 峰* 韓 偉 趙 晨 江 彬

（大連市友誼醫(yī)院泌尿外科，遼寧 大連 116001）

RUNX3 甲基化在非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者中的表達(dá)

岳 峰* 韓 偉 趙 晨 江 彬

（大連市友誼醫(yī)院泌尿外科，遼寧 大連 116001）

目的 對(duì)非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（NMIBC）患者的癌旁正常尿路上皮組織進(jìn)行RUNX3甲基化表達(dá)的檢測(cè)，證實(shí)RUNX3在膀胱癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。方法 接受經(jīng)尿道電切術(shù)的膀胱腫瘤患者65例，取腫瘤組織和對(duì)應(yīng)癌旁正常尿路上皮組織進(jìn)行試驗(yàn)。采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（MS-PCR）的方法對(duì)RUNX3甲基化程度進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（NMIBC）患者的腫瘤標(biāo)本中RUNX3甲基化發(fā)生率明顯高于癌旁正常尿路上皮組織（P=0.03），癌旁正常尿路上皮組織和腫瘤組織中RUNX3甲基化率分別為47%和69%，癌旁正常尿路上皮組織中RUNX3甲基化率與腫瘤數(shù)量（P=0.021）和疾病進(jìn)展（P=0.036）相關(guān)。多因素Cox回顧分析提示RUNX3在正常黏膜中出現(xiàn)甲基化是腫瘤進(jìn)展的獨(dú)立因素。結(jié)論 RUNX3甲基化與正常尿路上皮向膀胱癌轉(zhuǎn)化相關(guān)。RUNX3甲基化在癌旁正常尿路上皮中的表達(dá)可以為接受經(jīng)尿道電切手術(shù)的非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（NMIBC）患者的腫瘤進(jìn)展起到預(yù)測(cè)作用。

膀胱癌；甲基化；非肌層浸潤(rùn)性

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的首位。約85%的膀胱癌為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（NMIBC），NMIBC大部分具有惰性和復(fù)發(fā)性的特點(diǎn)，少部分還可以進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（MIBC），具有侵襲性［1］。當(dāng)NMIBC行經(jīng)尿道手術(shù)（TUR），癌旁正常尿路上皮組織日后進(jìn)展為癌的可能性為50%～80%。所以，對(duì)NMIBC患者進(jìn)行疾病進(jìn)展的預(yù)測(cè)對(duì)醫(yī)師和患者都十分必要。建立一種既準(zhǔn)確又可靠的診斷指標(biāo)更是十分的必要。

RUNX3不僅是癌癥的腫瘤抑制因子，還是TGF-β家族信號(hào)通路的靶點(diǎn)。非活性的RUNX3被甲基化后引起膀胱癌發(fā)生，是膀胱癌的一個(gè)十分重要的預(yù)測(cè)因子，本實(shí)驗(yàn)RUNX3在40例正常對(duì)照組膀胱上皮組織中全部表達(dá)陰性。本文著重對(duì)RUNX3甲基化在NMIBC患者癌旁正常尿路上皮的表達(dá)來(lái)幫助對(duì)有潛在腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的患者進(jìn)行分類，進(jìn)行早期干預(yù)。

1　材料與方法

1.1一般資料：收集我院65例NMIBC腫瘤標(biāo)本和對(duì)應(yīng)正常癌旁上皮組織。男47例，女18例，年齡60.5歲（51～84歲）。腫瘤分級(jí)采用2002TNM分類和1973WHO分級(jí)系統(tǒng)。

1.2基因組DNA提取和甲基化特異性聚合酶聯(lián)反應(yīng)（MS-PCR）：使用基因組DNA純化系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)DNA提?。≒romega，Madison，WI，USA），無(wú)水乙醇沉淀純化，保存于-20 ℃冰箱中?；蚪MDNA的重亞硝酸鹽處理使用的是EZ DNA Methylation-Gold Kit（Zymo Research，Orange，CA，USA）標(biāo)準(zhǔn)方法。

1.3數(shù)據(jù)分析：對(duì)初發(fā)NMIBC患者的病理和預(yù)后特征進(jìn)行分析研究，根據(jù)癌旁正常尿路上皮組織中甲基化水平進(jìn)行分層分析。分類變量使用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較和Kaplan-Meier方法計(jì)算進(jìn)展時(shí)間。計(jì)算差別使用log軼統(tǒng)計(jì)量。鄰近正常尿路上皮行RUNX3甲基化后對(duì)預(yù)后的評(píng)估使用Cox相對(duì)危險(xiǎn)回歸法。統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 12.0軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t或卡方檢驗(yàn)，α=0.05作為數(shù)據(jù)的檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié) 果

中位隨訪時(shí)間58個(gè)月（14～79個(gè)月），術(shù)后接受膀胱內(nèi)灌注治療53/65，隨訪期內(nèi)，37/65患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，18/65出現(xiàn)疾病進(jìn)展。47/65表現(xiàn)為腫瘤RUNX3甲基化，35/65癌旁正常上皮組織RUNX3甲基化。

RUNX3甲基化在正常組織中的診斷價(jià)值：RUNX3甲基化在癌旁正常上皮組織表達(dá)與腫瘤數(shù)量（P=0.021）和腫瘤進(jìn)展（P=0.036）相關(guān)，癌旁正常上皮RUNX3甲基化陽(yáng)性患者具有顯著的更短的無(wú)進(jìn)展生存期（P=0.017）。然而，Kaplan-Meier檢驗(yàn)提示兩組復(fù)發(fā)情況無(wú)顯著差別（P=0.895）。雙重甲基化的患者（即腫瘤和癌旁組織均檢測(cè)出RUNX3甲基化）比單甲基化和無(wú)甲基化有更短的無(wú)進(jìn)展生存期（P=0.036）。多因素分析提示，腫瘤分級(jí)（P=0.042）和癌旁正常組織RUNX3甲基化（P=0.045）是NMIBC的獨(dú)立進(jìn)展因素。

3　討 論

膀胱癌具有多灶發(fā)病、復(fù)發(fā)性高以及同時(shí)或異時(shí)發(fā)病的特點(diǎn)，腫瘤細(xì)胞的微侵入性特點(diǎn)給膀胱癌的臨床診斷帶來(lái)極大困難。有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的微侵入性特點(diǎn)是不同時(shí)間或位置，原發(fā)腫瘤通過(guò)黏膜下種植、轉(zhuǎn)移進(jìn)行的［2］。然而，正常外觀的膀胱黏膜或病理證實(shí)正常的黏膜組織也可能有癌前改變，存在著腫瘤發(fā)生的不確定性。從Wolff等對(duì)膀胱癌采用高通量DNA甲基化檢測(cè)，正常外觀的膀胱組織和無(wú)癌膀胱組織均可有癌前改變。我們發(fā)現(xiàn)在癌旁正常組織中RUNX3甲基化率為47%，但仍低于腫瘤組織69%。因?yàn)槟蚵飞掀ぐ┦嵌嘣钚缘膼盒阅[瘤，RUNX3甲基化與正常黏膜向膀胱癌轉(zhuǎn)變相關(guān)，那么異常甲基化就是膀胱組織惡變前的反應(yīng)。RUNX3甲基化可能參與了膀胱癌發(fā)生的早期事件。

腫瘤抑制基因沉默導(dǎo)致異常高的甲基化是人類癌癥發(fā)病中最早，也是最普遍存在的事件之一。普遍來(lái)說(shuō)，異常甲基化在瘤前期病灶中可以被檢測(cè)出來(lái)，Dhawan等報(bào)道多種癌癥中異常升高的甲基化率和疾病進(jìn)展相關(guān)，包括肺癌和肝癌，發(fā)現(xiàn)從正常尿路上皮向尿路上皮癌轉(zhuǎn)變過(guò)程中甲基化率是顯著升高的［3-12］，并且最近一系列研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌和RUNX3之間的相關(guān)性，但是目前RUNX3甲基化研究還沒(méi)有關(guān)于膀胱癌正常癌旁組織的報(bào)道。膀胱癌行TUR術(shù)后的正常外觀的尿路上皮RUNX3進(jìn)行甲基化檢測(cè)，或復(fù)查膀胱鏡，是NMIBC患者腫瘤進(jìn)展的可靠預(yù)測(cè)因子，也可以用來(lái)區(qū)分高進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的患者，對(duì)于低進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的患者也有降低復(fù)查頻率的作用。

作為診斷預(yù)測(cè)因子，將患者分為雙甲基化、單甲基化，和無(wú)甲基化組，雙甲基化組具有更差的無(wú)進(jìn)展生存期。足以說(shuō)明正常RUNX3甲基化可以作為診斷預(yù)測(cè)因子。由于NMIBC和MIBC在生物學(xué)行為和預(yù)后不同，所以分開(kāi)進(jìn)行研究是有必要的。本實(shí)驗(yàn)主要遺憾為實(shí)驗(yàn)病例數(shù)較少。進(jìn)一步需要研究的內(nèi)容較多，生物多樣性例如mRNA表達(dá)或蛋白水平研究仍需進(jìn)行。我們正在收集更多的樣本，進(jìn)行膀胱癌患者尿液的脫落細(xì)胞RUNX3甲基化檢測(cè)。

最后，由于RUNX3異常甲基化頻繁出現(xiàn)在正常癌旁尿路上皮中，將來(lái)在膀胱癌的診斷、治療、復(fù)查方面，建議將RUNX3甲基化檢測(cè)作為常規(guī)檢測(cè)在高危人群中進(jìn)行。

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1671-8194（2016）27-0019-02

大連市衛(wèi)生局局級(jí)課題

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