高血壓大鼠血腦屏障緊密連接變化與腦白質(zhì)病變的相關(guān)性

張　彥　崔　怡　董運(yùn)芳

(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，河北　石家莊　050011)

?

高血壓大鼠血腦屏障緊密連接變化與腦白質(zhì)病變的相關(guān)性

張彥崔怡1董運(yùn)芳1

(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，河北石家莊050011)

〔摘要〕目的探討高血壓大鼠血腦屏障緊密連接變化與腦白質(zhì)病變的可能關(guān)系。方法取健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠60只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型4、8、12、20、30 w組，每組10只。監(jiān)測(cè)血壓，進(jìn)行腦白質(zhì)病變分級(jí)，電鏡下觀察白質(zhì)區(qū)血腦屏障結(jié)構(gòu)，免疫熒光法檢測(cè)腦組織白蛋白滲出情況，Loyez染色法觀察神經(jīng)纖維變化。結(jié)果術(shù)后各模型周組大鼠血壓均明顯高于同期假手術(shù)組(P<0.05)；其中模型組大鼠術(shù)后4、8 w血壓與術(shù)前相比血壓明顯升高，而術(shù)后12、20、30 w血壓趨于平穩(wěn)。模型組大鼠術(shù)后8 w起胼胝體病變逐漸加重，之后尾核、內(nèi)囊、外囊受累病變明顯加重，術(shù)后20 w時(shí)胼胝體病變分級(jí)明顯高于之前(P<0.05)。模型12 w組25個(gè)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接中有7個(gè)連續(xù)性中斷，基底膜厚度增加；模型20 w組22個(gè)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接中有8個(gè)連續(xù)性破壞，細(xì)胞出現(xiàn)明顯腫脹，胞內(nèi)出現(xiàn)空泡樣病變；模型30 w組19個(gè)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接中有10個(gè)出現(xiàn)中斷。模型20 w組大鼠胼胝體存在可吞噬白蛋白的膠質(zhì)細(xì)胞；模型30 w組大鼠存在顆粒狀白蛋白滲出，分布于腦實(shí)質(zhì)中，以胼胝體、尾核滲出最為明顯。假手術(shù)組和模型4 w組大鼠的Loyez神經(jīng)纖維排列整齊；模型8 w組大鼠的Loyez神經(jīng)纖維排列出現(xiàn)紊亂；模型12 w組可見(jiàn)空泡樣改變；模型20 w可見(jiàn)腦白質(zhì)出現(xiàn)明顯疏松，神經(jīng)纖維斷裂；模型30 w組腦白質(zhì)疏松更為明顯。結(jié)論持續(xù)高血壓狀態(tài)會(huì)損傷血腦屏障的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接，進(jìn)而使血漿白蛋白滲出，引起神經(jīng)毒性，導(dǎo)致腦白質(zhì)病變的發(fā)生。

〔關(guān)鍵詞〕高血壓性腦白質(zhì)病變；血腦屏障

1河北醫(yī)科大學(xué)

第一作者：張彥(1970-)，女，主管護(hù)師，主要從事腦血管病教學(xué)護(hù)理及輔助治療研究。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，健康老年人群中約有14.2%的人存在腦白質(zhì)病變的趨勢(shì)〔1〕。高齡和高血壓均為腦白質(zhì)病變重要的危險(xiǎn)因素〔2〕，其中高血壓為可干預(yù)的影響因素。研究顯示，血腦屏障受損可能與腦白質(zhì)病變有關(guān)，但其具體的作用機(jī)制尚不十分清楚〔3〕。本研究旨在探討高血壓引發(fā)的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接損傷與高血壓性腦白質(zhì)病變的相關(guān)性。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性清潔級(jí)Wistar大鼠60只，體重70～100 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：桂檢字(2003)：第0005，嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查指南》進(jìn)行。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型4、8、12、20、30 w組，每組10只。

1.2模型建立和血壓測(cè)量根據(jù)已定型的雙腎雙夾法復(fù)制易卒中型腎血管性高血壓大鼠；假手術(shù)組采取未鉗位夾腎動(dòng)脈。在不同時(shí)間點(diǎn)使用BP-2000型大小鼠無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)經(jīng)尾動(dòng)脈測(cè)定大鼠收縮壓。

1.3腦白質(zhì)病變分級(jí)使用10%的水合氯醛麻醉大鼠，劑量為400 mg/kg，經(jīng)左心室向主動(dòng)脈插管，剪開(kāi)右心房，迅速灌注150 ml生理鹽水，至右心房流出無(wú)血澄清液體后使用4%多聚甲醛300 ml聯(lián)合0.1 mmol/L 磷酸緩沖液固定腦組織，開(kāi)顱將腦組織取出后固定1 h，梯度蔗糖溶液脫水；包埋后置于冷凍切片機(jī)切片并進(jìn)行HE染色。置于光學(xué)顯微鏡下觀察腦白質(zhì)病變情況，病變分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為0級(jí)：正常；Ⅰ級(jí)：神經(jīng)纖維相互纏繞；Ⅱ級(jí)：有明顯空泡樣改變；Ⅲ級(jí)：髓鞘的神經(jīng)纖維消失。

1.4毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接觀察按照1.3的方法開(kāi)顱取腦，取出腦白質(zhì)胼胝體后立即放于固定液中。根據(jù)電鏡操作標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程制作超薄切片、半薄切片，鈾鉛雙染后加速電壓90 kV條件下使用日立H-7650型透射電子顯微鏡觀察血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的變化情況。

1.5腦白質(zhì)白蛋白滲出檢測(cè)采取間接免疫熒光法檢測(cè)，先于枸櫞酸中修復(fù)抗原，在室溫條件下于兔血清中孵育1.5 h。將血清吸干后滴加稀釋過(guò)的綿羊白蛋白抗體，置于4℃環(huán)境中孵育過(guò)夜。用0.1 mmol/L磷酸緩沖液洗凈后，滴加兔抗綿羊二抗，避光條件下孵育1 h，洗凈后使用抗熒光淬滅封片液進(jìn)行封片，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6Loyez神經(jīng)纖維染色將冰凍切片置于4%鐵明礬溶液1 d，蒸餾水洗5～10次，使用新配置碳酸鋰蘇木素染液浸染1 d，置于1%鹽水乙醇分化20 s，流動(dòng)水清洗至返藍(lán)為止。梯度酒精脫水，二甲苯透明，封固后置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析。

2結(jié)果

2.1易卒中型腎血管性高血壓大鼠血壓監(jiān)測(cè)情況術(shù)前兩組大鼠血壓之間無(wú)差異(P>0.05)；術(shù)后4、8、12、20、30 w時(shí)模型組大鼠血壓均明顯高于同期假手術(shù)組大鼠血壓(P<0.05)；其中模型組大鼠術(shù)后4、8 w血壓與術(shù)前相比血壓明顯升高，而術(shù)后12、20、30 w血壓趨于平穩(wěn)。見(jiàn)表1。

表1　易卒中型腎血管性高血壓大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血壓變化情況±s,n=10,mmHg)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與同組術(shù)前比較：2)P<0.01

2.2腦白質(zhì)病變分級(jí)情況模型組大鼠腦白質(zhì)病變分級(jí)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸加重，術(shù)后4 w起模型組大鼠胼胝體、尾核、內(nèi)囊、外囊開(kāi)始出現(xiàn)輕微病變，術(shù)后8 w起胼胝體病變逐漸加重，之后尾核、內(nèi)囊、外囊受累病變明顯加重，術(shù)后20 w時(shí)胼胝體病變分級(jí)明顯高于之前(P<0.05)。另外3個(gè)區(qū)域各時(shí)間點(diǎn)與之前相比均無(wú)明顯改變(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2　不同時(shí)間點(diǎn)腦白質(zhì)病變分級(jí)情況±s,n=10)

與模型20 w組比較：1)P<0.05

2.3血腦屏障超微結(jié)構(gòu)觀察假手術(shù)組大鼠毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間吻合、連接完整，血管形態(tài)平滑。模型4 w組和8 w組相鄰內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接中連續(xù)且吻合緊密；模型12 w組25個(gè)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接中有7個(gè)連續(xù)性中斷，基底膜厚度增加；模型20 w組22個(gè)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接中有8個(gè)連續(xù)性破壞，細(xì)胞出現(xiàn)明顯腫脹，胞內(nèi)出現(xiàn)空泡樣病變；模型30 w組19個(gè)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接中有10個(gè)出現(xiàn)中斷。

2.4腦白質(zhì)白蛋白滲出檢測(cè)模型4、8、12 w組大鼠腦實(shí)質(zhì)和血管周圍未發(fā)現(xiàn)有血漿白蛋白滲出；模型20 w組大鼠胼胝體存在可吞噬白蛋白的膠質(zhì)細(xì)胞，血管附近存在增強(qiáng)的白蛋白熒光；模型30 w組大鼠存在顆粒狀白蛋白滲出，分布于腦實(shí)質(zhì)中，以胼胝體、尾核滲出最為明顯，血管周圍白蛋白滲出少于之前。

2.5Loyez神經(jīng)纖維染色結(jié)果假手術(shù)組和模型4 w組大鼠的Loyez神經(jīng)纖維排列整齊；模型8 w組大鼠的Loyez神經(jīng)纖維排列出現(xiàn)紊亂；模型12 w組可見(jiàn)空泡樣改變；模型20 w組可見(jiàn)腦白質(zhì)出現(xiàn)明顯疏松，神經(jīng)纖維斷裂；模型30 w組腦白質(zhì)疏松更為明顯。見(jiàn)圖1。

圖1　神經(jīng)纖維染色觀察(×200)

3討論

自發(fā)性高血壓易卒中大鼠模型來(lái)源較少，高昂的成本限制了其使用〔4〕。易卒中型腎血管性高血壓大鼠多用于腦中卒相關(guān)研究，但該模型也適用于腦白質(zhì)病變的研究，首先建模過(guò)程與人體慢性高血壓性腦白質(zhì)病變發(fā)的發(fā)病過(guò)程相似的較高，其次病理切片顯示病情發(fā)展過(guò)程中出現(xiàn)的腦白質(zhì)疏松、神經(jīng)纖維缺失等病理改變與腦白質(zhì)病變的病理改變一致〔5〕。本次研究中胼胝體為模型組大鼠病變最顯著的部位，與雙側(cè)頸動(dòng)脈狹窄模型一致，原因主要為胼胝體供血的血管來(lái)源于豆紋動(dòng)脈終末支，同源自大腦表面的血管間吻合度較差，當(dāng)出現(xiàn)低灌注時(shí)胼胝體易出現(xiàn)缺血性改變。腦白質(zhì)病變發(fā)病中高血壓和高齡為兩個(gè)主要的危險(xiǎn)因素。高血壓患者的腦血管阻力提升、血管自動(dòng)調(diào)節(jié)能力降低與腦白質(zhì)病變的嚴(yán)重程度密切相關(guān)〔6〕。本研究結(jié)果支持高血壓與腦白質(zhì)病變存在明顯關(guān)聯(lián)，能夠促進(jìn)其發(fā)生、發(fā)展。血腦屏障對(duì)腦內(nèi)的微環(huán)境起到嚴(yán)格調(diào)控作用。血腦屏障受損后，細(xì)胞因子、蛋白等大分子物質(zhì)進(jìn)入血管鼻、血管間隙、腦組織中引發(fā)功能性損害，可能為腦蛋白病變的發(fā)病機(jī)制〔7〕。本研究進(jìn)一步支持了血腦屏障損傷在腦白質(zhì)病變過(guò)程中發(fā)揮一定作用。該作用可能為血腦屏障受損時(shí)血漿中的大分子物質(zhì)滲入腦組織，產(chǎn)生神經(jīng)纖維毒性，引發(fā)腦白質(zhì)病變。

4參考文獻(xiàn)

1常馨,霍世會(huì),李曉蕓,等.老年腦白質(zhì)病變患者認(rèn)知障礙特點(diǎn)及危險(xiǎn)因素〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2013;33(17):4324-5.

2Jalal FY,Yang Y,Thompson J,etal.Myelin loss associated with neuroinflammation in hypertensive rats〔J〕.Stroke,2012;43(4):1115-22.

3Kim CK,Lee SH,Kim BJ,etal.Age-independent association of pulse pressure with cerebral white matter lesions in asymptomatic elderly individuals〔J〕.J Hypertens,2011;29(2):325-9.

4Fujita Y,Lin JX,Takahashi R,etal.Cilostazol alleviates cerebral small-vessel pathology and white-matter lesions in stroke prone spontaneously hypertensive rats〔J〕.Brain Res,2008;1203(2):170-6.

5楊嫻,藍(lán)琳芳,邢世會(huì),等.血腦屏障緊密連接損壞引起大鼠高血壓性腦白質(zhì)病變〔J〕.中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志,2013;39(2):82-7.

6張友平,劉開(kāi)顏,蔡璇,等.91例缺血性腦白質(zhì)病變患者的危險(xiǎn)因素分析〔J〕.神經(jīng)損傷與功能重建,2014;9(6):472-4.

7Chida Y,Kokubo Y,Sato S,etal.The alterations of oligodendrocyte,myelin in corpus callosum,and cognitive dysfunction following chronic cerebral ischemia in rats〔J〕.Brain Res,2011;1414(1):22-31.

〔2015-04-19修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

基金項(xiàng)目：國(guó)家科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.00812736)；河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.p013206147)；河北省科技攻關(guān)計(jì)劃課題資助項(xiàng)目(No.07278101D-7)

〔中圖分類號(hào)〕R743.2

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)22-6335-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.007