蛹蟲草抑制NF-κB p65表達(dá)對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

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(吉林大學(xué)第一醫(yī)院急診內(nèi)科，吉林　長(zhǎng)春　130021)

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蛹蟲草抑制NF-κB p65表達(dá)對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

閆魏魏蔡琦逄利徐大海王少坤張楠吳揚(yáng)

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院急診內(nèi)科，吉林長(zhǎng)春130021)

〔摘要〕目的探討蛹蟲草通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子p65(NF-κB p65)表達(dá)對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制。方法健康成年大鼠分成正常對(duì)照組(C組)、缺血再灌注組(I/R組)、蛹蟲草低劑量治療組(250 mg/kg)、蛹蟲草高劑量治療組(500 mg/kg)，再灌注48 h后采用免疫印跡法測(cè)NF-κB p65蛋白表達(dá)水平，采用免疫組化檢測(cè)海馬組織中突觸素陽(yáng)性細(xì)胞，蘇木素-伊紅染色(HE)法觀察大鼠海馬組織病理變化，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)海馬組織中腫瘤壞死因子(TNF)-α和白介素(IL)-10含量。結(jié)果I/R組大鼠海馬組織損傷明顯，NF-κB p65蛋白、TNF-α的表達(dá)明顯增多，突觸素陽(yáng)性細(xì)胞及IL-10表達(dá)明顯下降，與其他組比較差異顯著(P<0.05)，蛹蟲草高劑量治療組其NF-κB p65蛋白、TNF-α的表達(dá)均下降，而突觸素陽(yáng)性細(xì)胞及IL-10表達(dá)明顯升高，與I/R組比較差異明顯(P<0.05)，與HE法觀察海馬組織結(jié)果相一致。結(jié)論蛹蟲草可抑制NF-κB p65表達(dá)的活化和表達(dá)，減輕腦缺血再灌注損傷。

〔關(guān)鍵詞〕蛹蟲草；核轉(zhuǎn)錄因子p65表達(dá)；腦缺血再灌注；腦保護(hù)

第一作者：閆魏魏(1989-)，男，碩士，主要從危重癥的治療研究。

蛹蟲草具有抗感染、抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)、清除自由基、增強(qiáng)免疫力、抗凋亡、抗疲勞等作用〔1〕。多種研究表明其具有清除自由基及抑制炎性介質(zhì)釋放等作用。在腦缺血再灌注損傷后復(fù)雜的病理生理機(jī)制中，炎癥反應(yīng)、氧自由基損傷是導(dǎo)致腦缺血再灌注后神經(jīng)功能損傷的主要原因，是目前急危重癥醫(yī)學(xué)研究中的熱點(diǎn)，抗氧化應(yīng)激損傷、減輕炎癥反應(yīng)也成為治療缺血性腦血管疾病的重要途徑〔2～6〕。本研究旨在觀察蛹蟲草通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)p65的活化和表達(dá)，對(duì)腦缺血再灌注損傷的腦保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑健康成年雄性大鼠(吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)；酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(上海信然生物公司)；突觸素測(cè)定試劑盒(Nenmarkers公司)；NF-κB p65、Lamin抗體(上海通派科技)；蛹蟲草(吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究所，60℃烘干、含水量<1.0%、磨粉過100目篩)。

1.2分組對(duì)照組(C組)：進(jìn)行假手術(shù)操作，未使用線栓法建立腦缺血再灌注模型；缺血再灌注組(I/R組)：線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型，給予等量生理鹽水灌胃；蛹蟲草低劑量治療組(L-cordyceps組)：線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型，蛹蟲草溶液250 mg/kg灌胃；蛹蟲草高劑量治療組(H-cordyceps組)：線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型，蛹蟲草溶液500 mg/kg灌胃。

1.3動(dòng)物模型的建立除C組外，腦缺血再灌注大鼠模型均按制作方法〔7〕獲得，接受腦缺血2 h和再灌注48 h的處理。

1.4免疫印跡法用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉大鼠后，充分暴露大鼠心臟及主動(dòng)脈弓并留置輸液針，將右心耳剪開，用生理鹽水快速灌洗后再用4%的多聚甲醛灌流內(nèi)固定，直到流液透明，斷頭取腦，切取右側(cè)大腦半球距嗅球尖端7～11 mm，厚約2 mm的冠狀腦組織，將標(biāo)本保存于液氮中。取液氮中保存的腦組織標(biāo)本，于4℃解凍后稱重，每20 mg組織加入150～250 μl裂解液，用玻璃勻漿器勻漿，充分裂解后，10 000～14 000 r/min離心3～5 min，取上清，測(cè)定蛋白的濃度，將40 μg等蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素(NC)膜，經(jīng)3%牛血清蛋白(BSA)封閉并搖床后3 h，加入1∶2 000稀釋的抗體，4℃過夜，用Washing Buffer洗膜3次，5 min/閃，再加入1∶10 000稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記二抗后室溫?fù)u床2 h，再次用Washing Buffer洗膜5次，3 min/次，然后用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽/硝基四氮唑藍(lán)(NBT/BCIP)顯色，結(jié)果用圖像處理儀處理并得出吸光度(A)值，目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平以“NF-κB p65/內(nèi)參(β-actin)”的吸光度值比率計(jì)算。

1.5免疫組化新鮮海馬組織取出進(jìn)行常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、組織石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為5 μm，制成載玻片標(biāo)本，切片常規(guī)脫蠟至水，高溫高壓抗原修復(fù)，山羊血清封閉37℃，30 min，一抗4℃過夜，二抗37℃，30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，常規(guī)復(fù)染封片，在光鏡下觀察并用圖像分析儀檢測(cè)突觸素反應(yīng)產(chǎn)物的光密度值，以代表突觸素的量。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色將海馬組織切片脫蠟至水，常規(guī)HE，透明，封片，于光鏡下觀察海馬組織結(jié)構(gòu)。

1.7ELISA取新鮮海馬組織ELISA法檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-10的水平，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果

2.1免疫印跡法與C組(0.21±0.02)相比，I/R組NF-κB p65蛋白表達(dá)水平(0.56±0.10)顯著升高；蛹蟲草高、低劑量組可抑制腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的NF-κB p65蛋白表達(dá)水平，其中H-cordyceps組(0.31±0.05)與I/R組相比具有顯著差異(P<0.01)，而L-cordyceps組(0.50±0.15)與I/R組相比并無(wú)顯著差別(P=0.13)。見圖1。

2.2大鼠海馬CA1區(qū)突觸素陽(yáng)性細(xì)胞的分布大鼠腦組織切片進(jìn)行突觸素免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突觸素陽(yáng)性細(xì)胞在各組海馬CA1區(qū)的錐體層和顆粒層均有分布，I/R組突觸素表達(dá)的陽(yáng)性率(90±26)低于C組(232±14)(P<0.01)；H-cordyceps組(173±30)與I/R組相比差異顯著(P<0.01)，而L-cordyceps組(101±17)(P=0.10)與I/R組相比并無(wú)顯著差別(P>0.05)。見圖2。

圖1　各組NF-κB p65表達(dá)水平

圖2　各組中突觸素陽(yáng)性細(xì)胞分布

2.3HE染色光鏡下觀察，C組大鼠海馬CA1區(qū)可見3～4層排列緊密的錐體細(xì)胞，結(jié)構(gòu)較完整，胞體大且染色均一，細(xì)胞核大而圓，核仁清晰可見。I/R組海馬區(qū)可見變形腫脹的錐體細(xì)胞，細(xì)胞層次較C組明顯減少，細(xì)胞帶排列紊亂，細(xì)胞間隙增寬，可見脫失和膠質(zhì)化現(xiàn)象，胞核深染且體積減小，結(jié)構(gòu)不清，可見明顯呈多角形或三角形的核固縮現(xiàn)象，外周見星形膠質(zhì)細(xì)胞聚集，其細(xì)胞核明顯腫大、淡染。H-cordyceps組海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)比較完整，可見3～4層排列整齊的錐體細(xì)胞，呈圓形，核仁清晰可見，細(xì)胞脫失和膠質(zhì)化現(xiàn)象較模型組減少，膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯減輕。見圖3。

圖3　各組海馬組織HE染色

2.4ELISA 法測(cè)定海馬TNF-α和IL-10的含量I/R組大鼠腦組織勻漿中TNF-α含量(28.86±1.93)較C組(10.96±1.96)明顯增加；與I/R組比較，L-cordyceps組(25.44±2.94)可減少腦組織勻漿中的TNF-α含量，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而H-cordyceps組大鼠腦組織勻漿中的TNF-α的水平(25.46±1.17)顯著降低(P<0.05)。I/R組大鼠腦組織勻漿中IL-10含量(7.11±0.47)同C組(3.07±0.55)比較顯著增加；與I/R組比較，L-cordyceps組可升高腦組織內(nèi)IL-10含量(6.76±0.86)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；H-cordyceps組可明顯升高腦組織內(nèi)IL-10含量(8.84±0.53)(P<0.05)。

3討論

研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血缺氧使神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生損傷是一個(gè)快速的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括許多重要環(huán)節(jié)，其中炎性損傷是腦缺血再灌注神經(jīng)系統(tǒng)損傷的重要機(jī)制之一，炎性瀑布反應(yīng)觸發(fā)后可以加劇腦損傷的發(fā)展。NF-κB是JAK/STAT信號(hào)的下游分子，參與控制DNA的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞對(duì)外源性刺激的應(yīng)答反應(yīng)，如應(yīng)激、細(xì)胞因子、自由基、紫外線、過氧化脂質(zhì)以及細(xì)菌和病毒感染等〔8〕。NF-κB p65的活化及移位可導(dǎo)致下游多種細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β及IL-6的分泌，這些細(xì)胞因子參與了腦缺血損傷所導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)損傷，提示上述細(xì)胞因子可能成為減輕腦缺血再灌注后神經(jīng)系統(tǒng)損傷的新靶點(diǎn)。

蛹蟲草是我國(guó)名貴中藥，具有很高的食用和藥用價(jià)值。本研究說明蛹蟲草對(duì)NF-κB表達(dá)具有阻斷作用，高劑量蛹蟲草可通過減少大腦組織中TNF-α的含量從而減輕腦缺血再灌注后的炎癥損傷，發(fā)揮對(duì)腦組織及神經(jīng)功能的保護(hù)作用。而IL-10是重要的抗炎細(xì)胞因子，能抑制單核-巨噬細(xì)胞等的活性，降低細(xì)胞炎癥因子對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的刺激作用，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附分子表達(dá)和活性的下調(diào)，從而抑制TNF-α和一氧化氮(NO)的表達(dá)〔9〕，抑制白細(xì)胞聚集發(fā)揮其抗感染效應(yīng)以保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)功能。本研究說明蛹蟲草具有抑制腦缺血再灌注后炎癥反應(yīng)作用，這與大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)變化及免疫組化結(jié)果相一致，顯示了蛹蟲草可抑制NF-κB p65的活化和表達(dá)，從而減輕腦缺血再灌注后神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。

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〔2015-03-25修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：吳揚(yáng) (1960-)，女，教授，主要從事危重癥及中毒研究。

基金項(xiàng)目：吉林省科技發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(No.20130206063YY，20140204054YY)；長(zhǎng)春市科技計(jì)劃社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(No.12SF47)

〔中圖分類號(hào)〕R743

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)22-6333-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.006