加味孔圣枕中丹對(duì)局灶性腦缺血模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

武　冰　吳智春　季旭明　劉國偉　劉　恒　于華蕓

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東　濟(jì)南　250355)

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加味孔圣枕中丹對(duì)局灶性腦缺血模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

武冰吳智春季旭明劉國偉劉恒1于華蕓

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250355)

〔摘要〕目的研究加味孔圣枕中丹對(duì)局灶性腦缺血模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、P53表達(dá)的影響。方法線栓法建立局灶性腦缺血大鼠模型，隨機(jī)分為模型組、銀杏葉組及加味孔圣枕中丹組，另設(shè)假手術(shù)組(n=10)。灌胃給藥，連續(xù)14 d。觀察大鼠神經(jīng)功能癥狀評(píng)分，熒光TUNEL法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡，免疫組織化學(xué)法測定Bcl-2、P53表達(dá)。結(jié)果與模型組比較，加味孔圣枕中丹能顯著降低局灶性腦缺血大鼠Zea Longa 和網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)評(píng)分，降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和P53蛋白表達(dá)，增強(qiáng)Bcl-2蛋白表達(dá)(P均<0.05)。結(jié)論加味孔圣枕中丹能改善腦缺血引起的神經(jīng)功能損傷，其機(jī)制可能與調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)、抑制腦缺血引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕加味孔圣枕中丹；局灶性腦缺血；細(xì)胞凋亡；Bcl-2；P53

1山東大學(xué)齊魯醫(yī)院耳鼻喉實(shí)驗(yàn)室

第一作者：武冰(1991-)，女，在讀碩士,主要從事中藥資源與質(zhì)量控制研究。

神經(jīng)細(xì)胞凋亡是腦缺血疾病造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷的重要病理生理機(jī)制，通過相應(yīng)措施延緩或抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對(duì)于改善、恢復(fù)患者神經(jīng)功能有積極作用。加味孔圣枕中丹可補(bǔ)腎活血開竅，具有改善腦缺血后神經(jīng)功能損傷的作用〔1〕。本次研究采用局灶性腦缺血模型大鼠，通過觀察加味孔圣枕中丹對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用，探討其改善神經(jīng)功能損傷的可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)SD雄性大鼠，240～280 g，購自山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(魯)20050015。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物加味孔圣枕中丹組成有龜板、石菖蒲、生龍骨、山茱萸、肉蓯蓉、丹參、遠(yuǎn)志、川芎，飲片均購自山東省宏濟(jì)堂大藥店，水煎濃縮制成200%濃度(含生藥2 g/ml)；華納杏銀杏葉分散片(批號(hào)：100603)，湖南華納大藥廠有限公司，實(shí)驗(yàn)前配制成混懸液，濃度為2.2 g/100 ml。4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑和儀器Bcl-2、P53單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；TUNEL試劑盒(美國ROCHEI公司)；LEICARASP300全自動(dòng)脫水機(jī)(德國)；LEICARM2145自動(dòng)切片機(jī)(德國)；奧林巴斯IX71熒光倒置顯微鏡(日本)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1模型復(fù)制采用Longa等〔2〕報(bào)道的大腦中動(dòng)脈栓塞 (MCAO)法建立局灶性腦缺血大鼠模型。模型成功判定標(biāo)準(zhǔn)：左側(cè)肢體疼痛回縮遲鈍或消失；提尾倒懸時(shí)左上肢向胸前屈曲；行走時(shí)左側(cè)傾倒或向左轉(zhuǎn)圈；右側(cè)出現(xiàn)霍納征，如霍納征不出現(xiàn)則應(yīng)有左側(cè)肢體癱瘓?bào)w征。假手術(shù)組除插線1 cm外，其余步驟同造模組 。

1.2.2動(dòng)物分組及給藥30只MCAO大鼠隨機(jī)分為模型組、銀杏葉組和加味孔圣枕中丹組，另設(shè)假手術(shù)組，每組10只。造模成功24 h后分別予以銀杏葉片混懸液和加味孔圣枕中丹水煎濃縮液(18 ml/kg體質(zhì)量)灌胃，假手術(shù)組及模型組大鼠灌胃等容量生理鹽水，1次/d，連續(xù)14 d。實(shí)驗(yàn)大鼠未到觀察時(shí)相點(diǎn)死亡者，通過隨機(jī)抽樣原則補(bǔ)齊。

1.2.3動(dòng)物神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)模型制作成功后分別在術(shù)后24 h、給藥7 d和給藥14 d進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，采用Zea Longa和網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)評(píng)分法〔2,3〕。

1.2.4熒光TUNEL法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡組織切片常規(guī)脫蠟、水合，加蛋白酶K(20 μg/ml)，37℃孵育30 min，與含末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)和TMR結(jié)合的脫氧尿苷三磷酸(TMR-dUTP)反應(yīng)液在37℃下孵育60 min，PBS液洗3次。實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照用去離子水代替TdT液。細(xì)胞核用4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)復(fù)染。熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞呈紅色熒光。每例觀察5個(gè)視野(×400)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率(AR)。AR(%)=(TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)/神經(jīng)細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.2.5免疫組織化學(xué)法檢測Bcl-2、P53蛋白表達(dá)組織切片常規(guī)脫蠟、抗原修復(fù)，按照試劑盒說明書操作，應(yīng)用SABC法。200倍鏡下，隨機(jī)選取3個(gè)視野，Image Pro Plus醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，計(jì)算積分光密度(IOD)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS14.0軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠Zea Longa評(píng)分和網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，加味孔圣枕中丹組大鼠Zea Longa評(píng)分和網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)評(píng)分顯著降低(P<0.05)，見表1，表2。

2.2對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響TUNEL結(jié)果顯示，假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率為(18.46±1.96)%，模型組為(42.18±1.87)%，銀杏葉組為(38.88±1.13)%，加味孔圣枕中丹組為(26.10±1.54)%。與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，銀杏葉組、加味孔圣枕中丹組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖1。

2.3對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和P53表達(dá)的影響免疫組化結(jié)果顯示，Bcl-2陽性細(xì)胞可見棕黃色或棕褐色顆粒，陽性表達(dá)定位于神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)、核膜及突起。Bcl-2蛋白各組陽性表達(dá)IOD值分別為假手術(shù)組(3 825.42±1 190.22)，模型組(2 793.89±326.41)，銀杏葉組(3 554.68±807.70)，加味孔圣枕中丹組(3 677.07±762.96)。P53陽性表達(dá)定位在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，陽性細(xì)胞可見棕黃色或棕褐色顆粒。P53蛋白各組陽性表達(dá)IOD值分別為假手術(shù)組(2 189.78±578.13)，模型組(2 844.45±851.44)，銀杏葉組(2 513.22±437.73)，加味孔圣枕中丹組(2 263.41±579.38)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，P53蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，銀杏葉組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，加味孔圣中丹組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高，P53蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖2，圖3。

表1　大鼠Zea Longa評(píng)分結(jié)果

與假手術(shù)組比較:1)P<0.05；與模型組比較2)P<0.05

表2　大鼠網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)評(píng)分結(jié)果

與假手術(shù)組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05；與銀杏葉組比較:3)P<0.05

圖1　神經(jīng)細(xì)胞凋亡(熒光TUNEL，×400)

圖2　各組Bcl-2蛋白表達(dá)(SABC,×200)

圖3　各組P53蛋白表達(dá) (SABC,×200)

3討論

80%左右的腦卒中屬于缺血性腦卒中〔4,5〕。腦缺血后半暗區(qū)神經(jīng)細(xì)胞處于低氧、低灌注狀態(tài)，發(fā)生以細(xì)胞凋亡為主的遲發(fā)性死亡，是缺血后神經(jīng)功能損傷的重要原因之一。保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，抑制其凋亡可減少缺血后神經(jīng)功能損傷，是防治腦缺血損傷的重要干預(yù)靶點(diǎn)。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主性死亡過程，受促凋亡基因和抑凋亡基因的協(xié)同調(diào)控。bcl-2基因是最早發(fā)現(xiàn)的抑凋亡基因，編碼Bcl-2家族蛋白質(zhì)。Bcl-2蛋白可以在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)，參與磷酸化依賴性調(diào)節(jié)，線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑。研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2的表達(dá)與細(xì)胞存活密切相關(guān)，增加腦內(nèi)Bcl-2的表達(dá)可減少腦梗塞灶大小，減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，引起特定腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目的增多〔6，7〕。p53基因是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的重要基因，編碼P53蛋白。P53蛋白可防止細(xì)胞增生和保持DNA受損基因組的完整性，以細(xì)胞凋亡的方式清除異常細(xì)胞，在多種腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭蠵53表達(dá)上調(diào)〔8,9〕。

缺血性腦血管病屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，腎精虧虛，瘀血阻竅是其主要病機(jī)〔10,11〕?！澳X為髓之海”，賴髓之充養(yǎng)，腦髓為腎之精華所化生。缺血性腦血管病多發(fā)于中老年人，中年之后腎精漸虧，不能生髓充腦，髓?？仗?，則腦的生理功能得不到正常發(fā)揮，此為病本。腎精不足，陰血虧虛，脈道失養(yǎng)，血行澀滯可留瘀；加之老年人喜靜好臥，過于安逸，亦可使氣血運(yùn)行緩慢，甚則停而為瘀，腦絡(luò)中血液凝澀不暢，則發(fā)為中風(fēng)?？梢姳静∫阅I虛為本，瘀血阻竅為標(biāo)。治當(dāng)以補(bǔ)腎活血開竅以標(biāo)本兼顧。篩選《備急千金要方》孔圣枕中丹加味，方中龜板、山茱萸、肉蓯蓉滋腎陰、溫腎陽，治腎精虧虛之本；川芎、丹參活血祛瘀，石菖蒲、遠(yuǎn)志、龍骨開竅醒神，五藥活血開竅以治病標(biāo)。方中補(bǔ)陰藥與補(bǔ)陽藥配伍，以陰陽并補(bǔ)；補(bǔ)腎與活血開竅藥同用，以標(biāo)本兼顧，尤為適宜于缺血性腦中風(fēng)辨證為腎虛瘀阻竅閉者。 本次研究發(fā)現(xiàn)加味孔圣枕中丹能明顯改善局灶性腦缺血引起的大鼠神經(jīng)功能缺損，其作用機(jī)制可能與抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、上調(diào)大鼠腦組織Bcl-2蛋白表達(dá)、下調(diào)P53蛋白表達(dá)相關(guān)。

4參考文獻(xiàn)

1于華蕓,吳智春,趙艷,等.加味孔圣枕中丹對(duì)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)行為學(xué)及VEGF表達(dá)的影響〔J〕.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2013；8(12):1211-4.

2Longa EZ ,Weinstein PR,Carlson S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats 〔J〕.Stroke,1989；20(1):84-91.

3徐莉,李玲,陳景藻,等.康復(fù)訓(xùn)練對(duì)大鼠腦梗塞神經(jīng)功能恢復(fù)的影響〔J〕.中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志,2000；22(2):86-8.

4陳竺.全國第三次死因回顧抽樣調(diào)查報(bào)告〔M〕.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2008：14-7.

5Zhou MG,Offer A,Yang G,etal.Body mass index,blood pressure,and mortality from stroke:a nationally representative prospective study of 212,000 Chinese men〔J〕.Stroke,2008；39(3):753-9.

6Martinou JC,Youle RJ.Mitochondria in apoptosis:Bcl-2 family members and mitochondrial dynamics 〔J〕.Dev Cell,2011；21(1):92-101.

7李偉,吳剛,薛榮亮.Bcl-2過度表達(dá)對(duì)全腦缺血再灌注后大鼠海馬回P53蛋白表達(dá)的影響〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2012；38(2):175-9.

8周桔,羅榮保,湯長發(fā),等.Bcl-2蛋白家族和P53基因在細(xì)胞凋亡中的調(diào)控效應(yīng)〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù),2007；11(10):1950-2.

9Yonekura I,Takai K,Asai A,etal.p53 potentiates hippocampal neuronal death caused by global ischemia〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab,2006；26(10):1332-40.

10周清安,李建生,王至婉,等.腎虛血瘀在老年缺血性中風(fēng)發(fā)病中的地位及意義〔J〕.中國中醫(yī)急癥,2003；12(1):67-8.

11嚴(yán)一文.試論腦病(中風(fēng))從腎論治〔J〕.中國中醫(yī)急癥,2011；20(9):1450-4.

〔2014-11-17修回〕

(編輯李相軍)

Impacts of modified Kongsheng Zhenzhong pills on apoptosis of neural cells in MCAO rats

WU Bing,WU Zhi-Chun,JI Xu-Ming,etal.

Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,Shandong,China

【Abstract】ObjectiveTo study the impacts of modified Kongsheng Zhenzhong pills on apoptosis,Bcl-2 and P53 expressions of neural cells in focal cerebral ischemia rats.MethodsThe model of middle cerebral artery occlusion(MCAO) was established by suture method.30 MCAO rats were randomly divided into model,ginkgo leaf and modified Kongsheng Zhenzhong pills groups.The neurological symptom scores were observed for the analysis of neural behavior.Fluorescent TUNEL assay was used to detect neural cells apoptosis.Immunohistochemistry was employed to determine the expressions of apoptosis-related protein Bcl-2 and P53.ResultsCompared with those of model group,the scores of Zea Longa and screen test,the apoptosis rate of neural cells and the expression of P53 were reduced,while the expression of Bcl-2 was increased significantly in modified Kongsheng Zhenzhong pills group(P<0.05).ConclusionsModified Kongsheng Zhenzhong pills could improve the nerve function injury of MCAO rats by modulating the expression of apoptosis-related protein and inhibiting the neuronal apoptosis.

【Key words】Modified Kongsheng Zhenzhong pills;Focal cerebral ischemia;Apoptosis;Bcl-2;P53

通訊作者：于華蕓(1977-)，女，博士，碩士生導(dǎo)師，副教授，主要從事復(fù)方藥理學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81202641)；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2009-006)

〔中圖分類號(hào)〕R285.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)22-6325-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.003