腎臟局部生物鐘系統(tǒng)與水鹽排泄晝夜節(jié)律的時相關系

張瑞雨，牟利軍，李雪梅，李學旺，秦　巖

中國醫(yī)學科學院　北京協(xié)和醫(yī)學院　北京協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100730

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腎臟局部生物鐘系統(tǒng)與水鹽排泄晝夜節(jié)律的時相關系

張瑞雨，牟利軍，李雪梅，李學旺，秦巖

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院北京協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100730

摘要：目的觀察大鼠水鹽排泄晝夜節(jié)律以及腎臟局部生物鐘系統(tǒng)的鐘基因及下游與水鹽轉(zhuǎn)運相關的鐘控基因的晝夜節(jié)律表達的關系。方法飼養(yǎng)正常成年SD雄性大鼠，分別于授時時間(ZT)00∶00-ZT12∶00(開燈后，即日間)及ZT12∶00-24∶00(關燈后，即夜間)留取尿液，比較日夜間尿量及尿鈉、尿鉀、尿氯的排泄率，然后分別于ZT2∶00、6∶00、10∶00、14∶00、18∶00及22∶00處死大鼠并取腎臟組織，應用實時定量PCR方法檢測6個鐘基因CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Cry1和Cry2及6個鐘控基因NHE3、αENaC、NCC、Ptges、V1aR 和V2R 的mRNA表達。應用部分傅里葉分析合并逐步回歸的分析方法對基因表達進行節(jié)律分析。結(jié)果正常大鼠尿量及尿鉀排泄率呈夜高日低的晝夜節(jié)律(P<0.05)，而尿鈉及尿氯排泄率也表現(xiàn)為夜間高于日間的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。與其同步的腎臟組織內(nèi)6個鐘基因CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Cry1、Cry2(P均<0.05)及6個鐘控基因NHE3、αENaC、NCC、Ptges、V1aR、V2R(P均<0.05)均表現(xiàn)晝夜節(jié)律，其峰值均處于大鼠夜間活動期。結(jié)論大鼠水鈉排泄節(jié)律與腎臟局部生物鐘系統(tǒng)的鐘基因及鐘控基因表達的晝夜節(jié)律具有時相協(xié)同性。

關鍵詞：腎臟；晝夜節(jié)律；鐘基因；鐘控基因；水鹽排泄

ActaAcadMedSin，2015,37(6)：698-704

地球上生物的生命活動大多數(shù)呈現(xiàn)晝夜節(jié)律，這是由生物體內(nèi)強大的生物鐘系統(tǒng)調(diào)控的。哺乳動物的各種生理活動如血壓、心率、呼吸及睡眠等呈現(xiàn)晝夜節(jié)律，是由遍布于全身各組織器官甚至細胞的生物鐘系統(tǒng)運行產(chǎn)生的[1]。生物鐘系統(tǒng)中樞器官位于下丘腦前部的視交叉視上核，即中樞振蕩器，能夠同步化調(diào)控外周各組織器官內(nèi)的生物鐘系統(tǒng)，使全身的生理生命活動協(xié)調(diào)一致[2]。各個組織器官的生物鐘系統(tǒng)都具有類似的分子機制，包括鐘基因及受其調(diào)控的下游鐘控基因。目前研究較多的鐘基因包括CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Cry1、Cry2，CLOCK與BMAL1的基因產(chǎn)物形成二聚體Clock/Bmal1，與Per1、Per2、Cry1、Cry2基因相結(jié)合，促進基因產(chǎn)物Per1- 2/Cry1- 2的表達。而Per1- 2/Cry1- 2反過來抑制Clock/Bmal1的表達，從而抑制自身表達。這些鐘基因相互抑制、相互促進、此消彼長，并調(diào)控下游的鐘控基因，構成了生物鐘系統(tǒng)運行的分子機制[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)外周組織器官的生物鐘系統(tǒng)不僅受中樞的協(xié)同調(diào)控，自身也具有獨立完整的節(jié)律自控能力，這可能與疾病的發(fā)生、發(fā)展有一定的關系，遂成為各領域研究的熱點[2]。

腎臟作為外周器官，具有生物鐘系統(tǒng)，參與調(diào)控血壓及水鹽排泄等生理晝夜節(jié)律的形成，這對維持腎臟的正常生理功能具有重要意義。有研究表明SD大鼠胚胎期20 d就發(fā)現(xiàn)腎臟局部鐘基因系統(tǒng)表達形成，并隨著幼鼠的發(fā)育成熟逐漸完善，因此腎臟局部生物鐘系統(tǒng)在胚胎發(fā)育早期即發(fā)揮維持腎臟功能運行的重要作用[2]。當出現(xiàn)腎臟疾病時，如慢性腎功能不全患者表現(xiàn)出多種節(jié)律紊亂如夜尿增多、血壓節(jié)律紊亂、睡眠節(jié)律紊亂、不寧腿綜合征等[2]，雖其發(fā)生機制并不明確，但這些節(jié)律紊亂往往在腎移植術后得到改善[3]。研究表明小鼠腎臟鐘基因CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Cry1、Cry2的表達均具有晝夜節(jié)律[4]。而參與腎臟水鹽代謝的功能基因中，NHE3及αENaC是目前研究較多、較明確的鐘控基因。NHE3是最早明確的腎臟內(nèi)鐘控基因，其基因產(chǎn)物是位于腎臟近曲小管的Na-H交換體，主要參與調(diào)控鈉離子代謝及酸堿平衡[3，5]。αENaC的基因產(chǎn)物是位于腎臟集合管及遠段小管的上皮鈉通道，受醛固酮的調(diào)控以調(diào)節(jié)鈉的代謝[6]。Zuber等[7]應用基因芯片技術發(fā)現(xiàn)小鼠腎臟遠曲小管、連接管及皮質(zhì)集合管均有鐘控基因NHE3、αENaC、V1aR、V2R mRNA的表達呈晝夜節(jié)律。雖然已有研究者開始關注腎臟鐘基因及鐘控基因的節(jié)律表達，但把腎臟鐘基因及鐘控基因的節(jié)律表達與腎臟水鹽代謝的生理節(jié)律相聯(lián)系的研究相對較少。本研究擬觀察正常成年大鼠腎臟鐘基因及鐘控基因的節(jié)律表達情況與大鼠尿鈉、尿鉀、尿量排泄的晝夜節(jié)律是否具有時相的一致性。

材料和方法

動物飼養(yǎng)及試劑健康清潔級雄性SD大鼠18只，所有大鼠為7～8周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。所有大鼠均在北京協(xié)和醫(yī)院實驗動物中心清潔級動物房飼養(yǎng)。適應性飼養(yǎng)2周，規(guī)律進食、進水。定時開關燈，早8∶00開燈，記為授時時間ZT00∶00，晚20∶00關燈，記為ZT12∶00。RNA穩(wěn)定液購自美國GIBCO公司，Trizol試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(型號DRR036A)及RT-PCR試劑盒(型號DRR082A)均購自日本TAKARA公司。

大鼠尿標本留取及檢測將大鼠放入代謝籠內(nèi)，禁食不禁水，飲水規(guī)律不變。自ZT00∶00～ZT12∶00留取日間尿液，ZT12∶00～24∶00留取夜間尿液。收集到的新鮮尿液立即3 000 r/min，離心5 min后去除沉渣。北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科Olympus AU2700自動生化分析儀分別測尿鈉(間接離子選擇電極法)、尿鉀(間接離子選擇電極法)、尿氯(間接離子選擇電極法)的濃度，并分別計算日夜間尿量及尿鈉、尿鉀、尿氯的排泄率。

腎組織留取分別于ZT2∶00、6∶00、10∶00、14∶00、18∶00及22∶00各處死3只SD大鼠。3%苯巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉。用碘伏消毒胸腹部皮膚后，打開腹腔，暴露腎臟；打開胸腔，在心尖處注入無菌冰生理鹽水，同時剪開右心耳，沖出大鼠體內(nèi)的血，直到腎臟發(fā)白為止。取下雙側(cè)腎臟置于冰生理鹽水中，去除腎臟表面筋膜。用眼科剪將腎臟組織均勻剪成黃豆粒大小，置于凍存管內(nèi)的RNA穩(wěn)定液中。置于-80℃冰箱保存。

實時定量PCR檢測目的基因表達應用Trizol試劑盒提取腎組織中的RNA，然后應用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA，進一步應用實時定量PCR試劑盒檢測鐘基因CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Cry1、Cry2及鐘控基因NHE3、αENaC、NCC、Ptges、V1aR、V2R mRNA的表達，得到目的基因mRNA/GAPDH mRNA的表達比值。每個步驟均參照試劑盒說明書。內(nèi)參基因GAPDH及目的基因的引物序列見表1。

統(tǒng)計學處理所得數(shù)據(jù)均應用Chronos-fit1.06軟件進行晝夜節(jié)律分析。該軟件的分析方法為部分傅里葉分析合并逐步回歸分析，部分傅里葉分析公式為f(t)=中位數(shù)+Σ[振幅i×cos(t-峰值ZT時間i)×2π/pi]，該函數(shù)表現(xiàn)為余弦曲線，中位數(shù)為所有數(shù)據(jù)的中位數(shù)，峰值ZT時間為余弦曲線高峰值對應的ZT時間。若所有數(shù)據(jù)經(jīng)上述函數(shù)分析后得到的曲線與擬合的余弦曲線模型相符合，那么所得曲線上的每個數(shù)值都符合余弦曲線，即經(jīng)F檢驗具有統(tǒng)計學意義。

表 1　實時定量PCR的引物序列

若上述函數(shù)分析所得的F值大于F-to-enter值，相當于P<0.05，即有統(tǒng)計學意義。若所得的F值小于或等于F-to-enter值，則無統(tǒng)計學意義。F-to-enter為軟件自行給出的固定值。日夜間尿量及尿鈉、尿鉀、尿氯的濃度及排泄率數(shù)據(jù)應用配對t檢驗，應用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

大鼠尿量、尿鉀排泄節(jié)律與夜間尿量(18.5±9.74) ml相比，SD大鼠日間尿量(8.78±3.94) ml明顯減少(P<0.05)。而尿鉀排泄率夜間(92.85±23.87)μmol/h顯著高于日間(24.82±5.75)μmol/h(P<0.05)。而尿鈉、尿氯排泄率夜間分別為(39.49±22.44)μmol/h、(70.81±20.90)μmol/h，日間分別為(31.54±8.46)μmol/h、(50.77±10.73)μmol/h，夜間排泄率雖有高于日間的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

大鼠腎臟鐘基因CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Cry1、Cry2 mRNA的表達節(jié)律鐘基因CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Cry1、Cry2 mRNA節(jié)律表達曲線F值分別為28.26、4.52、3.7、5.79、5.26、26.36>F-to-enter，即P<0.05，具有明顯的晝夜節(jié)律。其峰值時間分別位于ZT23∶21、ZT 22∶45、ZT13∶11、ZT14∶24、ZT15∶06、ZT17∶53，均處于大鼠夜間活動期(圖1)。

大鼠鐘控基因NHE3、αENaC、NCC、Ptges、V1aR、V2R mRNA的表達節(jié)律鐘控基因NHE3 mRNA節(jié)律表達的相對應F值為14.28>F-to-enter，即P<0.05，其峰值時間位于ZT14∶05。鐘控基因αENaC mRNA節(jié)律表達的相對應F值為28.22>F-to-enter，即P<0.05，其峰值時間位于ZT14∶18。鐘控基因NCC、Ptges mRNA節(jié)律表達的相對應的F值分別為14.81、13.52，P均<0.05，其峰值時間分別為ZT13∶53、ZT13∶53，而鐘控基因V1aR、V2R mRNA節(jié)律表達的相對應的F值分別為8.77、5.08，P均<0.05，其峰值時間分別為ZT23∶34、ZT20∶37(圖2)。

箭頭：節(jié)律高峰值對應的授時時間；2A：兩倍的振幅；圖中曲線為節(jié)律分析后各鐘基因的擬合曲線，經(jīng)F檢驗，P均<0.05

black arrow in every figure directs Zeitgeber time related to the peak value of the fitted curve (acrophase)；2A：double amplitude；the curve in the chart is the fitted one induced by circadian analysis of all clock genes，which is checked significantly byF-test，the correspondingP<0.05

圖 1腎臟鐘基因BMAL1(A)、CLOCK(B)、Cry1(C)、Cry2(D)、Per1(E)、Per2(F)mRNA的晝夜節(jié)律表達

Fig 1Expression of clock genes including BMAL1(A)、CLOCK(B)、Cry1(C)、Cry2(D)、Per1(E)、Per2(F) exhibit circadian pattern in kidney

箭頭：節(jié)律高峰值對應的授時時間；2A：兩倍的振幅；圖中曲線為節(jié)律分析后各鐘基因的擬合曲線，經(jīng)F檢驗，P均<0.05

black arrow in every figure directs Zeitgeber time related to the peak value of the fitted curve (acrophase)；2A：double amplitude；the curve in the chart is the fitted one induced by circadian analysis of all clock genes，which is checked significantly byF-test，the correspondingP<0.05

圖 2腎臟鐘控基因αENaC(A)、NHE3(B)、NCC(C)、Ptges(D)、V1aR(E)、V2R(F) mRNA晝夜節(jié)律表達

Fig 2Expression of clock-controlled genes including αENaC(A)、NHE3(B)、NCC(C)、Ptges(D)、V1aR(E)、V2R(F) exhibit circadian pattern in kidney

討論

早在19世紀50年代，Goldman[8]觀察到正常人的水及電解質(zhì)鈉、鉀的排泄表現(xiàn)為日高夜低的晝夜節(jié)律。隨后Minors[9]也觀察到正常人水、電解質(zhì)如鈉、氯、鉀、尿酸、鈣及磷的排泄表現(xiàn)出日高夜低的晝夜節(jié)律。也有研究顯示大鼠或小鼠等夜間活動的嚙齒類動物中水及電解質(zhì)鈉、鉀、氯等排泄呈日低夜高的晝夜節(jié)律[10]。本研究顯示大鼠尿量及尿鉀的排泄呈日低夜高的晝夜節(jié)律，而尿鈉與尿氯的排泄雖有日低夜高的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，這可能與本研究樣本量小有關。綜上，對于人類和嚙齒類動物研究表明水鹽排泄的峰值處于動物的活動期。

本研究顯示腎臟組織局部鐘基因CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Cry1、Cry2及其下游的與腎臟功能相關的鐘控基因NHE3、αENaC、NCC、Ptges、V1aR、V2R的mRNA表達均呈明確的晝夜節(jié)律，且所有基因節(jié)律高峰集中在大鼠的活動期(夜間)，這與其他研究者在小鼠上的研究結(jié)果[4]具有一致性。因此，本研究表明大鼠腎臟水鹽排泄與腎臟局部的鐘基因及鐘控基因的表達三者的節(jié)律具有時相一致性，峰值均位于活動期，谷值均位于睡眠休息期。該一致性表明夜間大鼠活動頻繁時腎臟代謝功能活躍，腎臟鐘基因、鐘基因下游的腎臟水鹽排泄功能基因表達增加，水鹽排泄增加；而日間大鼠休息時，上述鐘基因、鐘控基因表達減少，水鹽排泄減少，證實了腎臟生理功能的節(jié)律性與其內(nèi)部生物鐘系統(tǒng)基因的節(jié)律性具有時相的協(xié)同性，這種協(xié)同性是維持腎臟功能正常運行的重要分子機制之一。

破壞這種協(xié)同性可導致腎臟或全身疾病的發(fā)生。Zuber等[7]研究顯示CLOCK基因敲除小鼠腎臟局部的鐘控基因V2R、AQP2、AQP4及αENaC的表達節(jié)律紊亂，并伴有部分性尿崩癥、鈉排泄節(jié)律紊亂及顯著低血壓。有研究表明Cry1/Cry2基因表達缺失的小鼠腎臟局部的鐘控基因NHE3表達節(jié)律紊亂[11]，并表現(xiàn)鹽敏性高血壓[12]。Gumz等[6]研究顯示Per1基因表達缺失的小鼠腎臟局部的鐘控基因αENaC的節(jié)律表達改變，并伴尿鈉排泄增多，Per1基因敲除小鼠表現(xiàn)為低血壓、尿鈉排泄節(jié)律紊亂[13]。上述研究表明，當作為腎臟局部生物鐘系統(tǒng)重要組成部分的鐘基因表達缺失或減少時，與腎臟功能相關的鐘控基因的表達出現(xiàn)節(jié)律紊亂，而腎臟功能也表現(xiàn)節(jié)律紊亂，即三者之間形成的時相一致性遭到破壞而導致腎臟疾病的發(fā)生。另有研究表明鐘基因BMAL1、Per2基因敲除小鼠均表現(xiàn)非杓型血壓節(jié)律[13- 14]。這些研究從反向驗證了腎臟局部生物鐘系統(tǒng)對維持腎臟功能正常運行的重要性。臨床研究顯示有生物鐘節(jié)律紊亂的人群如夜班工作者較日間工作人群罹患糖尿病、高血壓、腫瘤等疾病的概率明顯增加[15]。

本研究顯示與腎臟功能相關的NHE3、αENaC、NCC、Ptges、V1aR、V2R mRNA的表達也呈晝夜節(jié)律，這些基因均是位于鐘基因下游的受鐘基因調(diào)控的鐘控基因。這些功能基因既受到上游鐘基因的調(diào)控，又直接參與調(diào)控腎臟水鹽排泄功能。鐘控基因NHE3、αENaC是腎小管內(nèi)參與水鈉調(diào)控的重要通道或轉(zhuǎn)運體。有研究通過體內(nèi)或體外分子水平實驗，直接證明醛固酮促進鐘基因Per1與鹽皮質(zhì)激素受體共同結(jié)合于鐘控基因αENaC的啟動子序列，從而促進產(chǎn)物αENaC的表達[16]。另外人們還發(fā)現(xiàn)小鼠腎臟中Clock/Bmal1二聚體與NHE3 mRNA啟動子的E-box序列相結(jié)合，從而促進產(chǎn)物NHE3的產(chǎn)生[5，11]。這項研究證明鐘基因Clock、Bmal1對鐘控基因NHE3的直接調(diào)控作用。上述兩種轉(zhuǎn)運體或通道均在醛固酮的調(diào)控下，參與水鈉代謝及血壓的調(diào)控[17]。

另有鐘控基因NCC的產(chǎn)物是Na-Cl同向轉(zhuǎn)運體，主要位于遠曲小管、連接管及皮質(zhì)集合管，也參與水鈉代謝的調(diào)控[18]。鐘控基因Ptges的產(chǎn)物是前列腺素E合成酶，位于遠曲小管及連接管，主要參與前列腺素E的合成。鐘控基因V1aR、V2R的產(chǎn)物分別是血管加壓素受體V1a及V2，位于遠曲小管、連接管及皮質(zhì)集合管，主要與血管加壓素結(jié)合，調(diào)控水的代謝[3]。上述基因產(chǎn)物作為腎臟的功能基因，接受上游鐘基因的調(diào)控，其表達的節(jié)律性與腎臟水鹽排泄的節(jié)律具有時相一致性，對維持腎臟水鈉代謝正常運行具有重要作用。這些腎臟特有的具有生理功能的鐘控基因作為連接腎臟局部生物鐘系統(tǒng)與腎臟生理功能的重要紐帶，是研究生物鐘系統(tǒng)運行機制及腎臟功能調(diào)控機制的重要突破點。

正常大鼠腎臟局部生物鐘系統(tǒng)的晝夜節(jié)律與腎臟生理功能具有時相的協(xié)同性。那么在腎臟疾病狀態(tài)下，這種協(xié)同性是否受到破壞？臨床觀察證實慢性腎臟病患者存在尿鈉排泄及血壓節(jié)律的紊亂[19]，那么腎臟局部的生物鐘分子表達是否發(fā)生改變，這些改變與腎臟病理生理的改變孰因孰果？這些都是進一步研究的方向。

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·論著·

Effects of Rapamycin and Rapamycin-loaded Poly(lactic-co-glycolic)Acid Nanoparticles on Apoptosis and Expression of bcl- 2 and p27kip1Proteins of Human Umbilical Arterial Vascular Smooth Muscle Cell Temporally Relationship between Renal Local Clock System and Circadian Rhythm of the Water Electrolyte Excretion

ZHANG Rui-yu，MOU Li-jun，LI Xue-mei，LI Xue-wang，QIN Yan

Department of Nephrology，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China

Corresponding author：Qin YanTel：010- 69155058，E-mail：qinyanbeijing@126.com

ABSTRACT：ObjectiveTo investigate the relationship of the circadian rhythm of the urine volume and urine electrolytes excretion rate and the daily expression pattern of the clock genes and clock-controlled genes with the water electrolyte transportation circadian pattern in rat kidneys. MethodsMale adult SD rats were exposed to in a light∶dark (12∶12) cycles. We collected two period urine from zeitgeber time (ZT)00∶00-ZT12∶00 (light time，rest period) and ZT12∶00-24∶00 (dark time，activity period) and then compared the urinary excretion rates of volume，sodium，potassium，and chloride at light time with those at dark time. Rats were sacrificed every 4 hours throughout a 24-hour day-night cycle. Circadian clock gene CLOCK，BMAL1，Per1，Per2，Cry1，Cry2 and kidney specific clock-controlled gene NHE3，αENaC、NCC，Ptges，V1aR，V2R expression were profiled by real-time quantitative polymerase chain reaction. Data were analysed by a partial Fourier analysis and a stepwise regression technique. ResultsUrine volume and urine potassium excretion rate displayed high level at dark time and low at light time in SD rats (P<0.05)，and urine sodium and chloride excretion rate also showed the trend(P>0.05).Clock gene CLOCK，BMAL1，Per1，Per2，Cry1，Cry2(P<0.05)and kidney specific clock-controlled gene NHE3，αENaC，NCC，Ptges，V1aR，V2R (P<0.05)mRNA expression showed circadian pattern，and the peak times of the genes were in the dark time. ConclusionUrine volume and urine electrolyte excretion rate which displayed circadian pattern were temporally coupled with the rhythm of expression of clock and clock-controlled genes associated with water electrolyte transportation in rats kidney.

Key words：kidney；circadian rhythm；clock gene；clock-controlled gene；water electrolyte excretion

收稿日期：(2015- 01- 04)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2015.06.010

中圖分類號:R589.4

文獻標志碼:A

文章編號：1000- 503X(2015)06- 0698- 07

通信作者：秦巖電話：010- 69155058，電子郵件：qinyanbeijing@126.com

基金項目：國家自然科學基金(81100545)Supported by the National Natural Sciences Fundation of China(81100545)