信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3表達(dá)水平與垂體腺瘤各亞型的相關(guān)性

焦永輝，劉小海，代從新，蔡　鋒，王任直

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院　北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院　北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100730

2浙江大學(xué)　醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科,杭州　310009

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信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3表達(dá)水平與垂體腺瘤各亞型的相關(guān)性

焦永輝1，劉小海1，代從新1，蔡鋒2，王任直1

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100730

2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科,杭州310009

摘要：目的探討信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)表達(dá)水平和垂體腺瘤各亞型之間的相關(guān)性。方法應(yīng)用實時定量PCR、Western blot以及免疫組織化學(xué)染色檢測STAT3在垂體腺瘤各亞型的表達(dá)。結(jié)果STAT3在垂體腺瘤各亞型均有表達(dá)，與其他類型腫瘤，包括催乳素、促卵泡激素/促黃體生成激素以及促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤相比，STAT3在生長激素腺瘤表達(dá)最高，促卵泡激素/促黃體生成激素腺瘤表達(dá)最低。結(jié)論STAT3在垂體腺瘤各亞型的差異表達(dá)表明STAT3調(diào)控的細(xì)胞特異性本質(zhì)，這種特異性的調(diào)控機制值得進一步研究。

關(guān)鍵詞：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3；促腎上腺皮質(zhì)激素；生長激素；泌乳素；卵泡刺激素/黃體生成素；垂體腺瘤

Effects of Rapamycin and Rapamycin-loaded Poly(lactic-co-glycolic)Acid Nanoparticles on Apoptosis and Expression of bcl- 2 and p27kip1Proteins of Human Umbilical Arterial Vascular Smooth Muscle Cell Correlation between Expression of Signal Transducer and Activator of Transcription 3 and Pituitary Adenoma Subtypes

ActaAcadMedSin，2015,37(6)：693-697

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)3是STAT家族的一員，參與對細(xì)胞因子和生長因子的細(xì)胞反應(yīng)[1]。位于細(xì)胞質(zhì)的磷酸化的STAT3變?yōu)槎垠w并移位至細(xì)胞核內(nèi)，其后調(diào)節(jié)靶基因調(diào)控細(xì)胞增殖、存活和分化[2]。有研究顯示許多癌癥STAT3過表達(dá)和/或持續(xù)性活化[3]。STAT3的持續(xù)性活化受抑制后，可以使細(xì)胞生長抑制，甚至細(xì)胞死亡，因此STAT3可以作為癌癥治療的靶標(biāo)[4]。目前STAT3抑制劑的Ⅰ、Ⅱ腫瘤試驗也在進行中[5]。在垂體，STAT3不僅調(diào)控gp130控制的促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)細(xì)胞的增殖和生長，而且也是白血病抑制因子介導(dǎo)的ACTH分泌的重要調(diào)節(jié)器[6- 7]。有研究已經(jīng)證實STAT3在正常垂體組織低表達(dá)，而在生長激素(growth hormone，GH)腺瘤表達(dá)增高，但是STAT3在垂體腺瘤各亞型表達(dá)是否有差異，尚不是很明確[8]。因此，本研究主要探討STAT3表達(dá)水平和垂體腺瘤各亞型之間的相關(guān)性。

材料和方法

標(biāo)本垂體腺瘤標(biāo)本來自2010年5月至2013年6月北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科接受手術(shù)治療的74例垂體腺瘤患者，所有手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)臨床及病理診斷證實。腫瘤標(biāo)本包括20例GH腺瘤、20例泌乳素(prolactin，PRL)腺瘤、14例ACTH腺瘤、11例卵泡刺激素/黃體生成素(follicle-stimulating hormone/luteinizing hormone，F(xiàn)SH/LH)腺瘤、9例嫌色細(xì)胞(null cell，NC)瘤。男性25例、女性49例，年齡17～57歲，平均(40.2±13.8)歲。按照垂體腺瘤Knosp標(biāo)準(zhǔn)分組，Ⅱ級以上27例、Ⅱ級以下47例。

免疫組織化學(xué)采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法檢測STAT3表達(dá)。鼠抗人STAT3單克隆抗體購自美國CST公司(1∶500，#9139)，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶試劑盒及3，3，-二氨基聯(lián)苯胺顯色劑均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司，其他試劑由北京協(xié)和醫(yī)院病理科提供。組織標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋作5 μm連續(xù)切片，行HE染色用于重新確認(rèn)病理結(jié)果，免疫組織化學(xué)按試劑盒操作說明進行。采用人乳腺癌陽性片為對照片，陰性對照以PBS替代一抗。

Western blot采用Western blot檢測STAT3表達(dá)。取液氮冰凍腫瘤組織100 mg，提取總蛋白，按美國細(xì)胞信號科技公司的說明書操作，進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、滴加一抗、二抗進行免疫反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，最后膠片拍照。采用Quantityone 4.6.2軟件測定各條帶積分灰度值。采用GAPDH為內(nèi)參計算蛋白的相對表達(dá)量。以STAT3與GAPDH蛋白產(chǎn)物條帶灰度值之比作為STAT3蛋白的相對表達(dá)量。

實時定量PCR實時定量PCR檢測STAT3 mRNA的表達(dá)。取液氮冰凍腫瘤組織100 mg，提取總mRNA，采用Nanodrop2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，取8 μl總RNA按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進行反轉(zhuǎn)錄操作，取2 μl cDNA產(chǎn)物進行PCR擴增，用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)ROX plus進行擴增，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行?；靹?，置于ABI7500熒光定量PCR儀中，95 ℃ 15 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，45個循環(huán)，輸出STAT3的熒光信號到達(dá)所設(shè)定的閾值時經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(cycle threshold，Ct)值。以β-actin為內(nèi)參計算基因相對表達(dá)量。STAT3 mRNA相對表達(dá)量采用指標(biāo)為：2-△△Ct。STAT3引物序列上游為：5’-CAGTCCGTGGAACCATACACAAAGC- 3’，下游為5’-CAATACTTTCCGAATGCCTCCTCCTT-3’；β-actin上游為5’-ACTTAG TTGCGTTACACCCTT-3’，下游為5’-GTCACCTTCACCGTTCCA- 3’。

免疫組織化學(xué)結(jié)果判定高倍率(×200)視野下評估STAT3的免疫染色結(jié)果。每個標(biāo)本分別由兩名病理科醫(yī)師單獨診斷評分。免疫組織化學(xué)半定量方法如下：對STAT3染色強度和陽性率分別進行評估。染色強度評分如下：0分，陰性；1分，弱陽性；2分，中等陽性；3分，強陽性。免疫陽性細(xì)胞的百分比定義為細(xì)胞在每個視野下顯示陽性的百分比。視野內(nèi)壞死、纖維化及人為污染區(qū)被排除在外。平均免疫陽性強度和百分比為觀察10個高倍視野平均所得。對于每個樣品，組織學(xué)評分計算按陽性細(xì)胞百分比乘以染色強度(1×陽性細(xì)胞百分比+2×陽性百分比+3×陽性細(xì)胞百分比)。組織學(xué)評分最高為3，最低為0。

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計方法采用t檢驗、ANOVA 或 Wilcoxon檢驗等進行統(tǒng)計學(xué)處理。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

免疫組織化學(xué)結(jié)果

STAT3細(xì)胞定位：STAT3在所有垂體腺瘤亞型中均有表達(dá)。無論何種亞型，STAT3染色部位在細(xì)胞核和細(xì)胞漿，細(xì)胞漿中核旁區(qū)域較為明顯(圖1)。

STAT3免疫陽性細(xì)胞百分比：所有標(biāo)本STAT3陽性細(xì)胞的百分比為0%～100%，平均(60±30)%，其中平均陽性百分比最高的是GH腺瘤，為(84±13)%，其次是PRL腺瘤，為(64±29)%，最低的是FSH/LH腺瘤，為(21±29)%。

STAT3免疫陽性細(xì)胞染色強度：在所有腺瘤亞型，STAT3免疫染色強度為1.16±0.58(0~3)，其中染色強度最高的是GH腺瘤(1.60±0.75)，染色強度最低的是FSH/LH腺瘤(0.73±0.47)。

STAT3的組織學(xué)評分：在所有腫瘤亞型，平均組織學(xué)評分為(1.27±0.69)分(0～3分)，其中以GH腺瘤、PRL腺瘤組織學(xué)評分最高，分別為(1.70±0.80)分和(1.40±0.68)分，組織學(xué)評分最低的是FSH/LH腺瘤，為(0.73±0.47)分。

Western blot結(jié)果各類型垂體腺瘤(PRL、ACTH、GH、FSH/LH、NC)均顯示STAT3為相對分子質(zhì)量86 000大小的條帶，各腺瘤表達(dá)水平不一致，在GH腺瘤最高表達(dá)，與其他腺瘤比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，STAT3在FSH/LH腺瘤低表達(dá)(圖2、表1)。

實時定量PCR結(jié)果在各類型垂體腺瘤(PRL、ACTH、GH、FSH/LH、NC)均顯示STAT3表達(dá)，各腺瘤表達(dá)水平不一致，在ACTH腺瘤表達(dá)最高，NC、GH及PRL腺瘤次之，在FSH/LH腺瘤表達(dá)最低，GH與ACTH、FSH/LH比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

STAT3：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3；PRL：泌乳素；ACTH：促腎上腺皮質(zhì)激素；GH：生長激素；FSH/LH：卵泡刺激素/黃體生成素；NC：嫌色細(xì)胞

STAT3：signal transducer and activator of transcription 3；PRL：prolactin；ACTH：adrenocorticotropic hormone；GH：growth hormone；FSH/LH：follicle-stimulating hormone/luteinizing hormone；NC：null cell

A.PRL；B. ACTH；C. GH；D. FSH/LH；E. NC

圖 1STAT3在垂體腺瘤各亞型免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×200)

Fig 1STAT3 immunohistochemistry in various pituitary adenoma subtypes(×200)

Mr：相對分子質(zhì)量

Mr：relative molecular mass

圖 2Western blot檢測STAT3蛋白的表達(dá)

Fig 2Western blot assay shows the expression of STAT3 protein

討論

垂體腺瘤占顱內(nèi)腫瘤的10%～25%，居顱內(nèi)腫瘤第2位[9],其起源于高度分化的分泌一種或多種激素的垂體前葉細(xì)胞,因分泌激素類型不同，垂體腺瘤可以分為GH、PRL、ACTH、FSH/LH以及嫌色細(xì)胞瘤等，不同類型腫瘤臨床表現(xiàn)亦不同，例如肢端肥大癥、甲亢、閉經(jīng)/溢乳、庫欣綜合征或僅表現(xiàn)為壓迫周圍結(jié)構(gòu)等癥狀。除PRL腺瘤外，大部分垂體腺瘤首選手術(shù)治療，但部分腫瘤對藥物、手術(shù)等常規(guī)治療不敏感，術(shù)后復(fù)發(fā)率極高，總體預(yù)后很差，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量[10]。所以，本病亟待開發(fā)新的治療方法，近年關(guān)于STAT3作為潛在的有效的抗癌靶標(biāo)的研究越來越多。有研究已經(jīng)證實STAT3在正常垂體組織低表達(dá)，而在GH腺瘤表達(dá)增高，但是STAT3在垂體腺瘤各亞型表達(dá)是否有差異，尚不是很明確[8]。

表 1　垂體腺瘤各亞型STAT3蛋白和mRNA的

與GH比較，aP<0.05

aP<0.05 compared with GH

本研究采用免疫組織化學(xué)、Western blot以及實時定量PCR等方法探討STAT3表達(dá)與垂體腺瘤各亞型之間的關(guān)系，并且得出一個新的結(jié)論：STAT3在不同垂體腺瘤類型表達(dá)存在差異，結(jié)果表明STAT3蛋白在GH腺瘤最高，其次是PRL腺瘤，表達(dá)水平最低的是FSH/LH腺瘤。本研究結(jié)果與之前研究結(jié)果相似：與其他類型腺瘤相比，STAT3在GH腺瘤表達(dá)水平最高[8，11]。Trovato等[11]在30例垂體腺瘤(7例GH腺瘤、6例PRL腺瘤，4例ACTH腺瘤、1例FSH/LH腺瘤、12例嫌色細(xì)胞瘤)分析肝細(xì)胞生長因子/細(xì)胞間皮上皮轉(zhuǎn)化因子下游分子STAT3表達(dá)水平，結(jié)果表明STAT3在GH腺瘤表達(dá)水平最高，但是該研究方法為單一免疫組織化學(xué)，而且樣本數(shù)量偏少，因此本研究采用定性與定量相結(jié)合的方法探討STAT3在垂體腺瘤各亞型的表達(dá)差異，并且增加了腫瘤組織樣本量。

STAT3參與調(diào)控細(xì)胞分化和激素分泌過程。在小鼠垂體前葉細(xì)胞纖維母細(xì)胞生長因子受體4(fibroblast growth factor 4，F(xiàn)GFR4)的兩個多態(tài)性變異R388、G388，分別與GH和PRL分泌相關(guān)，當(dāng)FGFR4的跨膜結(jié)構(gòu)域的G388位點變?yōu)镽388后，垂體細(xì)胞不再分泌PRL，而是分泌GH，并且這個轉(zhuǎn)變過程與STAT3磷酸化相關(guān)[12]。表明STAT3可能在促乳生長激素細(xì)胞向生長激素細(xì)胞分化過程發(fā)揮重要作用。此外，生長激素釋放激素(growth hormone-releasing hormone，GHRH)與其受體結(jié)合后可以活化STAT3，在轉(zhuǎn)染了磷酸化的生長激素釋放激素受體的HeLa 人宮頸癌細(xì)胞系在予以GHRH后，STAT3表達(dá)水平增加，細(xì)胞增殖率加快，反之予以GHRH拮抗劑JMR- 132后，STAT3水平逐步回歸正常，細(xì)胞增殖率減慢[13]，進一步表明STAT3和生長激素細(xì)胞之間存在的密切聯(lián)系。在垂體，STAT3不僅調(diào)控gp130控制的ACTH細(xì)胞的增殖和生長，而且也是白血病抑制因子介導(dǎo)的ACTH細(xì)胞分泌的重要調(diào)節(jié)器[6- 7]。FGFR4的跨膜結(jié)構(gòu)域的變異FGFR-R388調(diào)控ACTH細(xì)胞生長以及對糖皮質(zhì)激素負(fù)反饋的敏感性，進而影響Cushing病的表型改變，而這個過程也是通過STAT3磷酸化介導(dǎo)的[14]。因此，STAT3在ACTH腺瘤形成過程是一種重要的調(diào)節(jié)元件。在正常垂體，STAT3不僅和GH、PRL細(xì)胞分化有關(guān)，而且與ACTH細(xì)胞生長、分化以及功能密切相關(guān)，STAT3可能部分或完全參與垂體前葉細(xì)胞分化過程，而STAT3在GH、PRL、ACTH等細(xì)胞表達(dá)水平的差異，可能是所介導(dǎo)的細(xì)胞事件所產(chǎn)生的副產(chǎn)品。因此，值得進一步探討STAT3在垂體前葉細(xì)胞的分化作用。

STAT持續(xù)活化促進腫瘤生長和進展，并且STAT3一直被認(rèn)定為潛在的抗癌靶標(biāo)[4]。STAT3在GH腺瘤的顯著高表達(dá)可能表明STAT3在GH腺瘤發(fā)展和/或進展中發(fā)揮作用，而STAT3可能是一種潛在的治療肢端肥大癥的靶目標(biāo)，但STAT3在GH腺瘤中發(fā)揮怎樣的調(diào)控作用并且如何更有效利用STAT3這個靶標(biāo)，需要進一步探討。

實時定量PCR結(jié)果雖然顯示STAT3在GH腺瘤與FSH/LH腺瘤之間存在表達(dá)差異，但是mRNA表達(dá)水平在ACTH腺瘤最高，PRL腺瘤與GH腺瘤差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明STAT3蛋白可能在ACTH腺瘤及PRL腺瘤半衰期短和/或STAT基因的翻譯效率較低，這需要進一步深入研究。綜上，在不同的垂體腺瘤亞型，STAT3表達(dá)水平不同，GH腺瘤表達(dá)水平最高，F(xiàn)SH/LH腺瘤表達(dá)水平最低。STAT3在垂體腺瘤各亞型的差異表達(dá)表明STAT3調(diào)控的細(xì)胞特異性本質(zhì)，而這種差異性的調(diào)控機制值得進一步研究。

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·論著·

JIAO Yong-hui1，LIU Xiao-hai1，DAI Cong-xin1，CAI Feng2，WANG Ren-zhi1

1Department of Neurosurgery，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China

2Department of Neurosurgery,the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University

School of Medicine,Hangzhou 310009,China

Corresponding author：WANG Ren-zhiTel：010- 69152530，E-mail：wangrz@126.com

ABSTRACT：ObjectiveTo investigate the correlation between signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) expression and pituitary adenoma subtypes. MethodThe STAT3 expression profiles in different pituitary adenomas from 74 patients were determined using quantificational real-time polymerase chain reaction，Western blot，and immunohistochemistry. ResultsExpression of STAT3 was observed in all pituitary adenoma subtypes. The STAT3 expression level was highest in growth hormone adenoma when compared with other tumors including prolactin，follicle-stimulating hormone/luteinizing hormone-secreting adenoma，and adrenocorticotrophic hormone-secreting adenoma. The follicle-stimulating hormone/luteinizing hormone adenomas exhibited the lowest STAT3 expression levels. ConclusionSTAT3 is differentially expressed in pituitary adenoma subtypes，suggesting the cell-specific features of STAT3 regulation，although further investigations are still warranted to clarify the underlying mechanisms.

Key words：signal transducer and activator of transcription 3；adrenocorticotropic hormone；growth hormone；prolactin；follicle-stimulating hormone/luteinizing hormone；pituitary adenoma

收稿日期：(2015- 02- 04)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2015.06.009

中圖分類號:R651

文獻標(biāo)志碼:A

文章編號：1000- 503X(2015)06- 0693- 05

通信作者：王任直電話：010- 69152530，電子郵件：wangrz@126.com