短鏈酰基輔酶A 脫氫酶缺乏癥患兒臨床特點(diǎn)及基因變異分析

王偉青 李文杰 宋東坡 于春冬 呂金峰 陳艷萍

青島市婦女兒童醫(yī)院新生兒篩查實(shí)驗(yàn)室（山東青島 266000）

短鏈?；o酶A 脫氫酶（short-chain acyl-CoA dehydrogenase，SCAD）位于真核生物的線粒體中，可以降解短鏈脂肪酸，屬于生物酰基輔酶A 脫氫酶（acyl-CoA dehydrogenase，ACAD）家族。1985年發(fā)現(xiàn)第1 例SCAD 缺乏癥（SCAD deficiency，SCADD）。SCADD 是由于ACADS基因缺陷，導(dǎo)致短鏈酰基肉堿異常升高的一種常染色體隱性遺傳代謝病。SCADD 臨床表現(xiàn)多變，最常見的特征是新生兒發(fā)育遲緩，肌肉張力減退，喂養(yǎng)困難，癲癇，發(fā)育不良，發(fā)育畸形等。SCAD 活性受損導(dǎo)致血液中丁?；鈮A（butyrylcarnitine，C4）和尿液中乙基丙二酸（ethylmalonic acid，EMA）濃度增加[1]，可以作為SCADD診斷的重要標(biāo)志物[2]。

1 臨床資料

2015年1月到2018年12月青島市共有476 379例活產(chǎn)新生兒，其中參加青島市新生兒疾病篩查的有473 777例，篩查率為99.5%。篩查前所有家長均簽署知情同意書。

篩查采用新生兒出生72 小時(shí)后的末梢血干濾紙片，以WATERS液相色譜-串聯(lián)TQ Detector質(zhì)譜儀，PerkinElmer公司的非衍生化多種氨基酸、肉堿測定試劑盒監(jiān)測標(biāo)本中的氨基酸及肉堿。尿有機(jī)酸以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀分析。

共296 627例新生兒采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行氨基酸檢測，初次篩查可疑陽性人數(shù)為4 864（1.6%），可疑SCADD 460例（0.16%）。經(jīng)復(fù)查串聯(lián)質(zhì)譜短鏈酰基肉堿仍然升高的新生兒，行尿有機(jī)酸分析和基因二代測序。

收集新生兒和監(jiān)護(hù)人的外周血，然后從外周血白細(xì)胞中提取基因組DNA。設(shè)計(jì)引物以ACADS的外顯子和外顯子-內(nèi)含子邊界為目標(biāo)，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物通過Sanger直接測序進(jìn)行分析。最終確診SCADD患兒7例，發(fā)病率為1/42 375。

7 例SCADD 患兒均為足月兒，體格檢查未見異常，四肢肌張力可，原始反射可引出。早期診斷確診后開始飲食治療，避免饑餓及感染，避免低血糖，低脂飲食。7例患兒均無臨床癥狀，因此未服用左旋肉堿或維生素B2等藥物。跟蹤隨訪至少3個(gè)月，所有患兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育均無異常，沒有骨骼肌張力減退或張力過高，生長良好，發(fā)育評(píng)估無異常。血清生化指標(biāo)無異常，見表1。

基因檢測結(jié)果顯示，確診患兒存在ACADS基因變異，分別為c.1029+89_1029+90insC，c.1031A>G，c.1130C>T，c.1157G>A，c.1186G>A，c.164C>T，c.445A>T，c.949A>G，c.989G>A。其中c.1031A>G（HGMD CM085212），c.1157G>A（rs766183395），c.164 C>T（HGMD CM 085955，rs 147442301），c.989 G>A（HGMD CM 067634）為致病變異，與SCADD發(fā)生有關(guān)，可能導(dǎo)致剪接部位變化，氨基酸序列改變，蛋白質(zhì)特性可能受到影響。ACADS基因變異c.1130C>T，c.1186G>A，c.445A>T，c.949A>G未見文獻(xiàn)報(bào)道，為臨床意義未明變異。

phastCons和phyloP可用于確定核苷酸保守程度，phastCons值在0到1之間變化，基于46種不同物種的基因組序列的多重比對(duì)反映每個(gè)核苷酸屬于保守元件的可能性。phyloP/phastCons值越接近1，核苷酸越可能是保守的，變異有害的可能性越大。c.1130C>T，c.1186G>A，c.445A>T，c.949A>G變異的phyloP/phastCons值分別為0.998、1.000、0.999、1.000，基因位點(diǎn)高度保守，變異有害的可能性較大。使用PROVEAN和SIFT軟件對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，結(jié)果均為有害（－9.11、－3.91、－3.55、－3.70）/（0.000、0.001、0.022、0.001）

6 例患兒的ACADS基因存在復(fù)合雜合變異，1 例患兒存在c.1031A>G純合變異，變異位點(diǎn)均分別來自父母。如例2 患兒ACADS基因的第10 號(hào)外顯子上新發(fā)的母本等位基因錯(cuò)義變異c.1186G > A（p.E396K），與第9 外顯子內(nèi)含子連接處的父本等位基因變異c.1029+89_1029+90 ins C（SNP，rs397744635），導(dǎo)致第396位的谷氨酸變?yōu)橘嚢彼?，編碼區(qū)第1029位堿基后89 與90 內(nèi)含子間插入了一個(gè)胞嘧啶，改變了氨基酸序列，影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能，最終導(dǎo)致SCAD功能異?；蚝铣烧系K，脂肪酸β 氧化受阻。目前在dbSNP數(shù)據(jù)庫（Genomes Project）中已有c.1029 +89_1029+1029+90 insC等變異的報(bào)道，但沒有更多致病機(jī)制的研究信息。

2 討論

新英格蘭的SCADD的新生兒發(fā)病率為1/33000，加利福尼亞約為1/34632[3]，美國各地區(qū)SCADD 的患病率在1/330000～3/33000之間[4]，中國尚未有SCADD患病率的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)，對(duì)SCADD患者進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查是很有必要的。

表1 7例SCADD患兒基本情況及臨床指標(biāo)

ACADS是SCAD的致病基因，PubMed已記錄162種變異。目前報(bào)道多例有癥狀的SCADD患者，大部分是復(fù)合雜合變異或純合變異。大多數(shù)SCADD 患者的初始癥狀表現(xiàn)為低血糖或神經(jīng)癥狀。ACADS 變異與SCADD的臨床癥狀和病情嚴(yán)重程度的關(guān)系尚不明確，純合變異可能與臨床疾病的易感性有關(guān)，在壓力或饑餓等應(yīng)激條件下，β 氧化能量供應(yīng)不足，攜帶變異的患者可能誘發(fā)SCADD。

研究者已克隆并測序了編碼人胎盤SCAD前體的cDNA。編碼SCAD的ACADS基因位于染色體12q24上，跨越14.2kb的DNA，其中1.9 kb的編碼區(qū)分裂成10個(gè)外顯子，編碼412個(gè)氨基酸，其中包括24個(gè)氨基酸的前導(dǎo)肽。與其他酰基輔酶A脫氫酶基因家族成員一樣，SCAD 是四聚體線粒體黃素蛋白，它以前體形式轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中，并經(jīng)過蛋白水解加工成成熟形式發(fā)揮作用。核基因組編碼SCAD，是脂肪酸氧化系統(tǒng)中的線粒體酶，催化β氧化螺旋的第一步，將四或六個(gè)碳鏈的酰基輔酶A轉(zhuǎn)化為2-烯酰輔酶A，介導(dǎo)丁酰輔酶A的脫氫反應(yīng)，并將電子傳遞給電子傳遞黃素蛋白（electron transport flavoprotein，ETE）[5]。丁酰基肉堿是SCAD的主要底物，SCADD患者尿液、血液和細(xì)胞中的丁?；鈮A，丁酰甘氨酸，EMA和甲基琥珀酸等代謝物升高。研究證實(shí)，有SNP（rs2055938的G等位基因）的兒童或成人可能與血清C 4 水平升高有關(guān)，但兩者的相關(guān)性無法確定，這也是導(dǎo)致新生兒C4濃度存在25%變異的原因[6]。有或者無明顯癥狀的SCADD患者C4均升高，可以通過新生兒遺傳代謝病篩查并進(jìn)一步通過基因檢測確診。

隨著20 世紀(jì)90 年代基因測序診斷方法的發(fā)展，有望確定脂肪酸氧化缺陷基因型與表型之間的關(guān)系，從而通過預(yù)測基因變異的結(jié)果指導(dǎo)臨床治療。研究證明，無義變異、剪接點(diǎn)改變和移碼變異可以影響無義介導(dǎo)的mRNA衰變（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）系統(tǒng)，導(dǎo)致mRNA 降解，進(jìn)一步表現(xiàn)為嚴(yán)重的臨床癥狀，而微小的插入和缺失變異以及錯(cuò)義變異可能與較溫和的臨床癥狀有關(guān)[7]。但SCADD 患者的代謝情況，酶濃度不能通過基因變異來預(yù)測，SCAD 功能障礙程度與臨床表現(xiàn)之間沒有明確關(guān)系，嚴(yán)重的ACADS變異可能并不會(huì)有嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)。

大多數(shù)SCADD患者攜帶純合變異或復(fù)合雜合變異，或ACADS基因伴失活變異。常見ACADS變異是錯(cuò)義變異，在歐洲人群中5和6號(hào)外顯子中c.511C> T和c.625 G> A變異最常見，而美國人群中c.511C> T的等位基因頻率為0.3%，c.625G> A的等位基因頻率為5.5%[8-9]。幾乎所有SCADD患者的ACADS中都包含錯(cuò)義變異，通過改變折疊方式和細(xì)胞的壽命來影響蛋白質(zhì)的生物合成[10]。

SCAD 缺陷小鼠與野生型小鼠相比，蛋白錯(cuò)誤折疊的趨勢和異常蛋白的濃度增加，這種現(xiàn)象表明變異可能是功能獲得性細(xì)胞表型[11]。c.1130 C>T，c.1186 G>A，c.445 A>T，c.949 A>G 被證實(shí)為是新的變異，在PubMed、dbSNP數(shù)據(jù)庫、1000 Genomes Project數(shù)據(jù)庫或Human Gene Mutation Database中均不存在。這些變異可以改變氨基酸序列，從而改變蛋白質(zhì)的疏水性，例如10號(hào)外顯子中的C.1186G>A使396位的谷氨酸（Glu）變?yōu)橘嚢彼幔↙ys）（p.E396K），谷氨酸的疏水性從－3.5變?yōu)椋?.9[12]。為了阻止與其他線粒體成分的疏水相互作用，某些易受攻擊的SCAD 蛋白被折疊，這種突變通過改變氨基酸的疏水性來改變蛋白折疊方式。作為基質(zhì)蛋白，SCAD 在線粒體hsp70的協(xié)助下被轉(zhuǎn)移到基質(zhì)中，然后在線粒體hsp70和hsp60/10的協(xié)助下折疊成功能結(jié)構(gòu)，并定位到活性位置[13]。在基質(zhì)之前折疊方式是正確的，小部分具有錯(cuò)義變異的蛋白質(zhì)可能錯(cuò)誤折疊成只具有部分功能的結(jié)構(gòu)，而其余的錯(cuò)誤折疊可能在體內(nèi)積累或直接降解，無法達(dá)到完全折疊的功能蛋白的構(gòu)象。折疊中間體的降解導(dǎo)致功能喪失。如果降解速率較低，并且依賴于基因與環(huán)境的相互作用，錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)可能會(huì)積累和干擾正常的細(xì)胞功能，這可能會(huì)與其他蛋白質(zhì)的產(chǎn)生相互作用[14]。由ACADS變異引起的SCAD 蛋白錯(cuò)誤折疊可能會(huì)改變其催化特性和結(jié)構(gòu)，從而賦予疾病易感性[15]，識(shí)別這些促成因素有助于有效診斷和治療SCADD。

本研究中7 例SCADD 患兒均為新生兒篩查早期確診，確診后采取低脂飲食治療，未服用藥物。雖然通過軟件預(yù)測大多數(shù)變異為有害變異，但除例3患兒失訪外，其他患兒均沒有出現(xiàn)SCADD的臨床表現(xiàn)，如喂養(yǎng)困難、發(fā)育遲緩、肌張力減退、癲癇等，僅有血液中C4水平持續(xù)偏高，推測ACADS基因變異與血清C4水平有相關(guān)性，但與臨床癥狀相關(guān)性不高。在早期確診后經(jīng)飲食干預(yù)可以避免新生兒面臨饑餓、壓力等應(yīng)激狀態(tài)，減少SCADD發(fā)病的可能性。

綜上，新生兒疾病篩查可以早期診斷、治療SCADD，延緩發(fā)病改善預(yù)后，對(duì)新生兒健康是重大的公共衛(wèi)生舉措。