外源甜菜堿對低溫脅迫下結(jié)縷草生理特性的影響

梁小紅，安勐潁，宋崢，徐廣臣，濮陽雪華*

(1.北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所, 北京 100083; 2.北京東方園林生態(tài)股份有限公司, 北京 100012)

外源甜菜堿對低溫脅迫下結(jié)縷草生理特性的影響

梁小紅1，安勐潁1，宋崢2，徐廣臣1，濮陽雪華1*

(1.北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所, 北京 100083; 2.北京東方園林生態(tài)股份有限公司, 北京 100012)

摘要：甜菜堿作為一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，與低溫脅迫下植物的抗逆性有著密切的聯(lián)系。為了探討不同濃度外源甜菜堿對低溫脅迫下結(jié)縷草相關(guān)生理指標(biāo)的影響，本實驗以結(jié)縷草‘青島’品種為實驗材料，分別采用0，50，100和150 mmol/L 的甜菜堿進(jìn)行葉面噴施，在8/2℃(白天/夜間)的培養(yǎng)箱中連續(xù)處理28 d，以正常管理(28/24℃)作為對照。結(jié)果表明：外源甜菜堿能夠有效緩解低溫脅迫下結(jié)縷草坪觀質(zhì)量和葉綠素含量的下降，減少電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量的升高，顯著提高SOD、POD、CAT和APX的活性，從而降低H2O2和O2·-的累積，同時，外源甜菜堿還可以提高低溫脅迫下結(jié)縷草可溶性蛋白和脯氨酸的含量，增強滲透調(diào)節(jié)能力，進(jìn)而增強結(jié)縷草對低溫脅迫的抵抗性。其中，外施100 mmol/L甜菜堿對提高結(jié)縷草的耐低溫能力的效果最為顯著。

關(guān)鍵詞：結(jié)縷草；低溫脅迫；甜菜堿；生理特性

Effects of exogenous glycine betaine on the physiological characteristics ofZoysiajaponicaunder low-temperature stress

LIANG Xiao-Hong1, AN Meng-Ying1, SONG Zheng2, XU Guang-Chen1, PUYANG Xue-Hua1*

1.InstituteofTurfgrassScience,BeijingForestryUniversity,Beijing100083,China; 2.BeijingOrientLandscapeEcologicalCo.,Ltd,Beijing100012,China

Abstract:Glycine betaine (GB) is an important compatible solute that is associated with stress tolerance in plants under low-temperature stress. To investigate the effect of exogenous GB on the physiological indexes of Zoysia japonica under low-temperature stress, GB at 0, 50, 100, and 150 mmol/L was applied as a foliar spray to ‘Qingdao’, a Z. japonica cultivar, before transferring the plants to growth chambers. The plants were grown under average temperatures of 8℃/2℃ (day/night) for 28 days in the low-temperature treatment, and under average temperatures of 28℃/24℃ (day/night) in the control. Exogenous GB alleviated the loss of turf quality and chlorophyll content, and reduced the increase in electrolyte leakage and malondialdehyde content in Z. japonica under low-temperature stress. Exogenous GB increased the activities of superoxide dismutase, peroxidase, catalase, and ascorbate peroxidase, leading to lower H2O2and O2·-contents. Also, exogenous GB enhanced the osmotic adjustment capacity of the plants by increasing the concentrations of proline and soluble protein. These results indicated that exogenous GB enhanced the resistance of Z. japonica to low-temperature stress, and 100 mmol/L exogenous GB was the most effective concentration.

Key words:Zoysia japonica; low-temperature stress; glycine betaine; physiological characteristics

結(jié)縷草屬(Zoysia)是一種隸屬禾本科(Gramineae)，虎耳草亞科(Chloridoideae)的多年生C4型草本植物，主要分布于亞洲東部地區(qū)，在澳洲、非洲等比較溫暖的地區(qū)也有分布，也是我國常用的多年生暖季型草坪草之一[1]。目前研究表明，結(jié)縷草屬主要包括11個種，若干個變種和變型，其中在我國自然分布的有5個種和2個變種，它們分別是結(jié)縷草(Zoysiajaponica)、中華結(jié)縷草(Zoysiasinica)、溝葉結(jié)縷草(Zoysiamatrella)、細(xì)葉結(jié)縷草(Zoysiatenuifolia)和大穗結(jié)縷草(Zoysiamacrostachya)5個種以及青結(jié)縷草(Zoysiajaponicavar.pollida)和長花結(jié)縷草(Zoysiasinicavar.nipponica)2個變種[2]。結(jié)縷草葉片厚硬而近革質(zhì)，適宜溫暖濕潤性氣候，耐高溫、耐陰性及耐旱性較強，此外，結(jié)縷草還具有耐鹽堿，抗病蟲害，耐粗放管理，耐踐踏、耐貧瘠等優(yōu)良特性，因此，結(jié)縷草具有很強的適應(yīng)性和抗逆性，在我國被廣泛應(yīng)用于城市園林綠化、水土保持、邊坡修復(fù)等諸多領(lǐng)域[2-4]。但是，結(jié)縷草也具有綠期短的缺點，在冬季會枯黃休眠，從而大大降低了其觀賞價值，限制了其在過渡帶及北方地區(qū)的推廣和使用[5]。因而，如何提高結(jié)縷草對低溫脅迫的抵抗性，延長結(jié)縷草的綠期，已經(jīng)成為國內(nèi)外眾多學(xué)者關(guān)注的問題之一。

甜菜堿(GB)是一種烷基烴類含氮化合物，屬于甘氨酸的季銨衍生物，它可以和多種氨基酸結(jié)合形成新的復(fù)合物，譬如甘氨酸甜菜堿、脯氨酸甜菜堿及組氨酸甜菜堿等，其中甘氨酸甜菜堿是結(jié)構(gòu)最為簡單，研究最為廣泛的一類甜菜堿，它廣泛分布于動植物和微生物體內(nèi)[6-7]。植物受到逆境脅迫時，甜菜堿可以作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)參與植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)，亦可作為滲透保護(hù)物質(zhì)來提高生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性[8]。因此，在低溫和鹽漬等逆境脅迫下，甘氨酸甜菜堿可以提高植物的抗逆性，研究表明，外源甜菜堿可以提高小麥(Triticumaestivum)、大麥(Hordeumvulgare)、煙草(Nicotianatabacum)、黃瓜(Cucumissativus)、玉米(Zeamays)等多種植物對低溫脅迫的抵抗性[9-13]。然而，目前關(guān)于外源甜菜堿對提高草坪草抗寒性的相關(guān)研究較少，尤其是寒冷脅迫下，外源甜菜堿對結(jié)縷草生理代謝影響的報道甚少。因此，開展相關(guān)研究有利于進(jìn)一步闡明甜菜堿對提高結(jié)縷草耐寒能力的生理機制，從而延長結(jié)縷草的綠期，為結(jié)縷草的進(jìn)一步推廣和應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1　實驗材料

本研究選擇結(jié)縷草‘青島’為研究對象，結(jié)縷草種子由青島海源草坪有限責(zé)任公司提供。2013年7月將種子播種于直徑16 cm，高度15 cm的塑料花盆中，播種量為20 g/m2，花盆中的基質(zhì)為草炭∶蛭石∶沙=4∶2∶1的混合物。播種后的植物材料在溫室中培養(yǎng)4個月，溫室條件為光周期14 h，光合有效輻射(PAR)400 μmol/(m2·s)，溫度白天28℃，夜間24℃。在生長期間，每3 d澆水1次，每周采用半強度Hoagland營養(yǎng)液施肥1次[14]，成坪后每周修剪至約10 cm高。

1.2　低溫處理與取樣

在低溫處理前3周，所有的植物材料被轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件同溫室條件。在2周的適應(yīng)生長后，即低溫脅迫處理前1周，處理組結(jié)縷草分別被噴施濃度為0，50，100，150 mmol/L的甜菜堿。低溫處理條件為光周期14 h，光合有效輻射(PAR)400 μmol/(m2·s)，溫度白天8℃，夜間2℃，低溫處理時間共28 d。以正常管理作為對照組。分別在低溫處理后的第0，7，14，21和28天取樣，液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱進(jìn)行保存。

1.3　測定指標(biāo)及方法

坪觀質(zhì)量參照Turgeon[15]的方法，采用1~9分制進(jìn)行評分；葉綠素含量采用95%乙醇提取測定[16]；電解質(zhì)滲透率采用Blum和Ebercon[17]的方法測定；丙二醛含量采用Heath 和 Packer[18]的方法測定；過氧化氫含量的測定采用文獻(xiàn)[19]的方法；超氧陰離子含量采用Jiang 和Zhang[20]的方法測定；抗氧化酶活性的測定采用Zhang 和 Kirkham[21]的方法；可溶性蛋白含量的測定采用Bradford[22]的方法；脯氨酸含量采用李合生[23]的方法測定。

1.4　數(shù)據(jù)分析

實驗設(shè)置4個重復(fù)，采用Excel 2013和SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，并使用Excel 2013作圖。

2結(jié)果與分析

2.1　外源甜菜堿對低溫脅迫下結(jié)縷草傷害指標(biāo)的影響

2.1.1坪觀質(zhì)量和葉綠素含量低溫脅迫導(dǎo)致結(jié)縷草的坪觀質(zhì)量和葉綠素含量呈顯著下降趨勢(P<0.05)，在第28天時，結(jié)縷草坪觀質(zhì)量為4.7分，處于不可接受狀態(tài)，葉綠素含量與對照相比下降了71.71%(圖1)。與單獨低溫脅迫相比，外施3種不同濃度的甜菜堿都在一定程度上緩解了坪觀質(zhì)量和葉綠素含量的下降，其中，外施100 mmol/L甜菜堿的緩解效果最為顯著，而外施150 mmol/L甜菜堿緩解作用較小，尤其是對葉綠素含量的影響。在第28天時，100 mmol/L甜菜堿預(yù)處理的結(jié)縷草坪觀質(zhì)量得分為6.7分，依然處于可接受狀態(tài)，葉綠素含量相比單獨低溫脅迫升高了1.21倍。

圖1　外施不同濃度甜菜堿對低溫脅迫下結(jié)縷草坪觀質(zhì)量和葉綠素含量的影響Fig.1　Effects of exogenous glycine betaine (GB) with different concentrations on turf quality and chlorophyll content of Z. japonica under low-temperature stress　CK(對照組)=常溫+0 mmol/L 甜菜堿；T0=低溫脅迫+0 mmol/L甜菜堿；T1=低溫脅迫+50 mmol/L甜菜堿；T2=低溫脅迫+100 mmol/L甜菜堿；T3=低溫脅迫+150 mmol/L甜菜堿。圖中上方的垂直線條表示同一時間下不同處理之間的標(biāo)準(zhǔn)誤(P<0.05)。下同。CK (control)=normal temperature+0 mmol/L GB; T0=low temperature+0 mmol/L GB; T1=low temperature+50 mmol/L GB; T2=low temperature+100 mmol/L GB; T3=low temperature+150 mmol/L GB. Vertical bars on the top indicate least significant difference values (P<0.05) for treatment comparison at a given day of treatment. The same below.

2.1.2電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量由圖2可知，低溫脅迫導(dǎo)致結(jié)縷草的電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量呈顯著上升趨勢(P<0.05)，到第28天時，單獨低溫脅迫的結(jié)縷草電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量與對照相比分別增加了185.84%和99.47%。外施3種不同濃度的甜菜堿都在一定程度上緩解了低溫脅迫引起的電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量的上升，而且，外施100 mmol/L甜菜堿的緩解效果最為顯著。在第28天時，與單獨低溫脅迫相比，100 mmol/L甜菜堿預(yù)處理的結(jié)縷草電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量分別降低了44.9%和23.6%。

圖2　外施不同濃度甜菜堿對低溫脅迫下結(jié)縷草電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量的影響Fig.2　Effects of exogenous glycine betaine with different concentrations on electrolyte leakage and MDA content of Z. japonica under low-temperature stress

2.2　外源甜菜堿對低溫脅迫下結(jié)縷草抗氧化響應(yīng)指標(biāo)的影響

2.2.1過氧化氫和超氧陰離子含量低溫脅迫導(dǎo)致結(jié)縷草的H2O2含量和O2·-含量呈顯著上升趨勢(P<0.05)，到第28天時，單獨低溫脅迫的結(jié)縷草H2O2含量和O2·-含量與對照相比分別升高了1.61和1.32倍(圖3)。與單獨低溫脅迫相比，外施3種不同濃度的甜菜堿都顯著降低了H2O2含量和O2·-含量，其中，外施100 mmol/L甜菜堿的緩解效果最為明顯。在第28天時，相比單獨低溫脅迫，100 mmol/L甜菜堿預(yù)處理的結(jié)縷草H2O2含量和O2·-含量分別下降了44.4%和40.0%。

圖3　外施不同濃度甜菜堿對低溫脅迫下結(jié)縷草H2O2含量和O2·-含量的影響Fig.3　Effects of exogenous glycine betaine with different concentrations on H2O2 and O2·- content of Z. japonica under low-temperature stress

2.2.2抗氧化酶活性由圖4可知，低溫脅迫顯著提高了結(jié)縷草4種抗氧化酶的活性(P<0.05)。低溫脅迫處理條件下，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)的活性分別在第14，28，21和28天時達(dá)到峰值，與對照相比其活性分別提高了151.09%，67.18%，110.99%和72.22%。與單獨低溫脅迫處理相比，外施3種不同濃度的甜菜堿均在不同程度上提高了4種抗氧化酶的活性，其中100 mmol/L 的外源甜菜堿作用效果最為顯著，而150 mmol/L的外源甜菜堿作用效果較小，尤其是對CAT和APX活性的影響。相比單獨低溫脅迫，100 mmol/L甜菜堿預(yù)處理的結(jié)縷草SOD、POD、CAT和APX的活性分別在第14，28，21和28天時增加了82.5%，47.4%，77.2%和68.5%。

圖4　外施不同濃度甜菜堿對低溫脅迫下結(jié)縷草抗氧化酶活性的影響Fig.4　Effects of exogenous glycine betaine with different concentrations on antioxidant enzyme activity of Z. japonica under low-temperature stress

2.3　外源甜菜堿對低溫脅迫下結(jié)縷草滲透調(diào)節(jié)指標(biāo)的影響

2.3.1可溶性蛋白含量低溫脅迫下結(jié)縷草的可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，其含量在第14天時達(dá)到峰值，與對照相比增加了94.74%(圖5)。同單獨低溫處理相比，外施100 mmol/L甜菜堿顯著提高了結(jié)縷草的可溶性蛋白含量，在第14天時增加了72.7%， 而外施50和150 mmol/L甜菜堿對低溫脅迫下結(jié)縷草可溶性蛋白含量的影響并不顯著。

圖5　外施不同濃度甜菜堿對低溫脅迫下結(jié)縷草可溶性蛋白含量的影響Fig.5　Effects of exogenous glycine betaine with different concentrations on soluble protein content of Z. japonica under low-temperature stress

2.3.2脯氨酸含量從第14天開始，低溫脅迫顯著提高了結(jié)縷草的脯氨酸含量(P<0.05)，在第21天時，單獨低溫脅迫的結(jié)縷草脯氨酸含量達(dá)到峰值，與對照相比提高了22.46倍，此后其含量開始呈現(xiàn)下降趨勢(圖6)。在第28天時，與單獨低溫脅迫處理相比，外施50和100 mmol/L的甜菜堿分別使脯氨酸含量提高了1.65和3.73倍，而外施150 mmol/L的甜菜堿與單獨低溫脅迫處理相比沒有顯著差異。

圖6　外施不同濃度甜菜堿對低溫脅迫下結(jié)縷草脯氨酸含量的影響Fig.6　Effects of exogenous glycine betaine with different concentrations on proline content of Z. japonica under low-temperature stress

3討論與結(jié)論

坪觀質(zhì)量是評價草坪質(zhì)量好壞最直接的指標(biāo)，更是評價草坪優(yōu)劣的綜合性指標(biāo)[24]。從本研究的結(jié)果可以看出，低溫脅迫會顯著降低結(jié)縷草的坪觀質(zhì)量，而外施甜菜堿則可有效的緩解低溫脅迫對坪觀質(zhì)量的影響，使結(jié)縷草保持較高的坪觀質(zhì)量。葉綠素是植物光合作用中不可缺少的重要物質(zhì)，更是反應(yīng)葉片受傷程度最為直接的指標(biāo)[25-26]。本實驗中，低溫脅迫顯著降低了結(jié)縷草的葉綠素含量，這與前人的研究結(jié)果相一致[27-28]。這可能是由于低溫脅迫不僅破壞了葉綠體的超微結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致光合色素降解，而且抑制了葉綠素的合成，從而降低了葉綠素的含量。外施甜菜堿則顯著緩解了低溫脅迫下結(jié)縷草葉綠素含量的降低，說明外施甜菜堿可以保護(hù)低溫脅迫下結(jié)縷草的葉綠體結(jié)構(gòu)，從而使結(jié)縷草的葉綠素含量保持較高水平。

細(xì)胞膜系統(tǒng)是植物感受低溫最敏感的部位，也是植物抵抗低溫傷害的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量通?？梢杂行У胤从吵黾?xì)胞膜系統(tǒng)的傷害程度和膜脂的過氧化程度[29-30]。本研究表明，低溫脅迫顯著增加了結(jié)縷草細(xì)胞膜的電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量，說明低溫脅迫導(dǎo)致了膜脂過氧化反應(yīng)，破壞了結(jié)縷草的細(xì)胞膜系統(tǒng)。研究表明，甜菜堿能夠防止細(xì)胞膜的熱變性，降低原生質(zhì)膜從液晶相轉(zhuǎn)變?yōu)槟z相的溫度，從而對低溫脅迫下的細(xì)胞膜的完整性起到保護(hù)作用[31]。也有研究指出，甜菜堿可以穩(wěn)定低溫脅迫下的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)是由于甜菜堿的季銨化陽離子特性可以結(jié)合細(xì)胞膜上的羥基陰離子[32]。本實驗中，外施甜菜堿顯著降低了低溫脅迫下結(jié)縷草的電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量，說明外施甜菜堿能夠緩解低溫脅迫下結(jié)縷草的膜脂過氧化反應(yīng)，對結(jié)縷草細(xì)胞膜系統(tǒng)的完整性起到了一定的保護(hù)作用，進(jìn)而提高了結(jié)縷草對低溫脅迫的抵御能力。

低溫脅迫下植物體內(nèi)積聚的活性氧是導(dǎo)致膜脂過氧化反應(yīng)，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞的重要原因，其中H2O2和O2·-是2個最常見的活性氧[33-34]。本研究表明，低溫脅迫顯著提高了結(jié)縷草的H2O2和O2·-含量，說明低溫脅迫使得自由基的產(chǎn)生和清除處于失衡的狀態(tài)，植物體內(nèi)積聚了大量的H2O2和O2·-，造成了結(jié)縷草細(xì)胞膜的膜脂過氧化反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致丙二醛含量的上升。因此，提高植物的抗氧化代謝能力來清除活性氧對植物抵御低溫脅迫至關(guān)重要。酶促防御系統(tǒng)中，SOD負(fù)責(zé)將O2·-歧化成為H2O2，而CAT和POD則分別在葉綠體和細(xì)胞質(zhì)將H2O2降解為無毒害作用的水分子和氧氣，同時APX則參與抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)，催化抗壞血酸和H2O2反應(yīng)從而協(xié)助清除植物體內(nèi)的H2O2[35]。本實驗中，外施甜菜堿顯著提高了低溫脅迫下4種抗氧化酶的活性，從而降低了H2O2和O2·-含量。研究表明，甜菜堿可以防止蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)受到其他物質(zhì)的破壞，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)，尤其是在脅迫條件下，甜菜堿可以作為一種低分子量的伴侶分子來起到對酶蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定作用，并使酶蛋白處于激活且有功能的狀態(tài)，增強酶的活力[36-37]。因此，外施甜菜堿可以有效激活結(jié)縷草的酶促防御系統(tǒng)，增強低溫脅迫下結(jié)縷草的抗氧化酶活性，從而清除低溫脅迫誘導(dǎo)出的多余的活性氧，進(jìn)而提高了結(jié)縷草抵御低溫脅迫的能力。

可溶性蛋白和脯氨酸是植物體內(nèi)的2種重要的滲透調(diào)節(jié)劑?？扇苄缘鞍缀透彼岜旧矶季哂泻軓姷挠H水性，其含量的增加會提高細(xì)胞內(nèi)束縛水的含量，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞膜免受脫水的傷害，來達(dá)到提高植物抵御低溫脅迫能力的目的[38]。本研究表明，低溫脅迫顯著增加了結(jié)縷草的可溶性蛋白和脯氨酸含量，并且外施甜菜堿進(jìn)一步增加了其含量。相關(guān)研究指出，增加的可溶性蛋白很可能是一些植物抵御低溫脅迫相關(guān)的或有專一性的功能蛋白酶[39]。也有研究表明，甜菜堿可能在加速低溫脅迫下受到損傷的蛋白質(zhì)的從頭合成過程中起到一定作用[40]。因此，外施甜菜堿能夠通過可溶性蛋白和脯氨酸的滲透調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步提高結(jié)縷草對低溫脅迫的抵抗性。

綜上所述，外源甜菜堿能夠有效緩解低溫脅迫下結(jié)縷草坪觀質(zhì)量和葉綠素含量的降低，減少電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量的升高，一方面是通過提高結(jié)縷草的抗氧化代謝能力，增強了SOD、POD、CAT和APX的活性，從而清除了多余的H2O2和O2·-，進(jìn)而保護(hù)了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，提高了結(jié)縷草抵御低溫脅迫的能力；另一方面是通過提高可溶性蛋白和脯氨酸的滲透調(diào)節(jié)能力，增強胞內(nèi)滲透勢，減少細(xì)胞失水，進(jìn)而提高結(jié)縷草對低溫脅迫的抵抗性。其中，外施100 mmol/L甜菜堿對提高結(jié)縷草抵御低溫脅迫能力的效果最為顯著。

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通訊作者*Corresponding author. E-mail: puyangxuehua@163.com

作者簡介：梁小紅(1979-)，女，遼寧本溪人，實驗師。E-mail: liang81511@163.com

基金項目：國家863計劃-花卉、牧草、竹藤功能基因組學(xué)研究與應(yīng)用項目(2013AA102607)資助。

收稿日期：2014-10-21；改回日期：2014-11-18

DOI：10.11686/cyxb2014431http://cyxb.lzu.edu.cn