珠芽蓼內(nèi)生細(xì)菌ZA1的抑菌物質(zhì)產(chǎn)生條件的優(yōu)化及其穩(wěn)定性測(cè)定

楊成德，暢濤，薛莉，馮中紅，姚玉玲，李婷，陳秀蓉

(草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室,

中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070)

珠芽蓼內(nèi)生細(xì)菌ZA1的抑菌物質(zhì)產(chǎn)生條件的優(yōu)化及其穩(wěn)定性測(cè)定

楊成德*，暢濤，薛莉，馮中紅，姚玉玲，李婷，陳秀蓉

(草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室,

中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070)

摘要：從珠芽蓼中分離的內(nèi)生細(xì)菌ZA1對(duì)馬鈴薯壞疽病菌具有良好的抑菌效果，鑒定為莫海威芽孢桿菌。本文通過(guò)平板對(duì)峙法對(duì)ZA1分泌物抑制馬鈴薯壞疽病菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)ZA1抑菌粗提物的穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，ZA1的最佳培養(yǎng)基為B培養(yǎng)液，最佳發(fā)酵溫度為17.8℃，培養(yǎng)基的最佳pH是6.9，150 mL三角瓶的最佳裝液量為20 mL，最佳培養(yǎng)方式為暗處理振動(dòng)培養(yǎng)96 h，經(jīng)對(duì)ZA1進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)，其對(duì)馬鈴薯壞疽病菌的EC50=0.1228 μL/mL，是優(yōu)化前EC50=4.5888 μL/mL的37倍。ZA1的抑菌粗提物90℃下處理2 h，其相對(duì)活性達(dá)到76.62%，具有耐高溫的特性；對(duì)紫外線照射30 min后相對(duì)活性差異不明顯； pH為3和11時(shí)，其相對(duì)活性分別為92.87%和85.11%；對(duì)蛋白酶和Ag+、Cu2+、Zn2+和Fe3+等金屬離子不敏感，經(jīng)Ag+處理后的相對(duì)活性可達(dá)到86.93%。

關(guān)鍵詞：珠芽蓼內(nèi)生菌；莫海威芽孢桿菌；抑菌粗提物；培養(yǎng)條件；穩(wěn)定性

Optimizing the culture conditions and determining the stability of antibiotic secretion byPolygonumviviparumof the endophytic bacteriaBacillusmojavensis

YANG Cheng-De*, CHANG Tao, XUE Li, FENG Zhong-Hong, YAO Yu-Ling, LI Ting, CHEN Xiu-Rong

KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity,PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince,Sino-U.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China

Abstract:One strain of Bacillus mojavensis (ZA1) is known to have a strong antibacterial effect against the pathogen of potato gangrene (Phoma foveata). In this study, P. foveata was isolated as a fungal pathogen and the method of petri dish confrontation was used to determine culture conditions for optimizing and stabilizing production of the antibiotic secreted by ZA1. The results showed that the optimum culture medium for ZA1 consisted of 200 g potato, 10 g peptone, 20 g sucrose and 1000 mL distilled water. The optimum fermentation temperature of ZA1 was 17.8℃.The optimum pH value of ZA1’s culture medium was 6.9. The optimum 150 mL triangle bottle volume of ZA1 was 20 mL. The optimum culture mode of ZA1 was shaking cultivation in the dark for 96 hours. Results showed that the EC50=0.1228 μL/mL against P. foveata after optimization was 37 times higher than the EC50=4.5888 μL/mL against P. foveata before optimization. Crude extracting of bacteriostatic from ZA1 showed that the characteristics of high temperature resistance and relative activity could reach 76.62% after it was treated at 90℃ for 2 hours. Relative activity was stable and could not be destroyed under UV irradiation for 30 minutes. The bacteriostatic extract of ZA1 had good acid and alkali resistance. When it was treated by pH=3 and pH=11, the relative activity was 92.87% and 85.11% respectively. It was not sensitive to protease and heavy metal ions such as Ag+, Cu2+, Zn2+and Fe3+. Relative activity remained at 86.93% after Ag+treatment.

Key words:Polygonum viviparum endophytic bacteria; Bacillus mojavensis; antagonistic substances; condition of culture; stability

微生物資源作為除動(dòng)物和植物之外的第三類(lèi)生物資源，而生防菌資源是微生物資源中的一類(lèi)重要生物資源，隨著綠色農(nóng)業(yè)的深入推廣，利用微生物源農(nóng)藥對(duì)植物病害進(jìn)行防治的研究成為了熱點(diǎn)。目前，除所推測(cè)的太空微生物資源未見(jiàn)生防菌報(bào)道之外，其他微生物資源如植物內(nèi)生菌、土壤微生物、極端環(huán)境微生物、濕地微生物、海洋微生物及動(dòng)物腸道和糞便菌均有生防菌的報(bào)道[1]，且從植物和土壤中分離得到了拮抗細(xì)菌、真菌、放線菌等拮抗微生物的報(bào)道較多[2-8]。近年來(lái)，對(duì)生防菌抑菌機(jī)制的研究和明確其抑菌物質(zhì)的種類(lèi)更是受到了眾多學(xué)者的青睞。研究表明，芽孢桿菌可以通過(guò)其核糖體途徑產(chǎn)生某些細(xì)菌素和酶類(lèi)及活性蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)來(lái)溶解病原菌的細(xì)胞壁，也可以通過(guò)非核糖體途徑產(chǎn)生的抗菌肽、脂肽物質(zhì)或抗菌素通過(guò)鋅離子通道或其他機(jī)制作用于病原菌的細(xì)胞膜[9-12]。隨著研究的不斷深入，學(xué)者報(bào)道了許多胞外分泌型抑菌蛋白[10]、抑菌酶[13]、抗生素[14]，其中，多數(shù)抑菌物質(zhì)制劑已用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中；近年來(lái)，學(xué)者更是借助超濾杯及小分子分離柱等分離得到具有抑菌作用的小分子抗菌肽[15-17]，這些抗菌肽的結(jié)構(gòu)一般為環(huán)形或線形，且其一般具有耐高溫和耐蛋白酶的特性，對(duì)酸堿和紫外線穩(wěn)定[18-19]。

馬鈴薯(Solanumtuberosum)是世界第四大糧食作物，在甘肅種植面積較大，近年來(lái)馬鈴薯貯藏期病害發(fā)生嚴(yán)重，其中以我國(guó)檢疫病害馬鈴薯壞疽病菌(Phomafoveata)最為嚴(yán)重，可在馬鈴薯的貯藏期造成大量腐爛[20]。馬鈴薯貯藏期長(zhǎng)達(dá)4至5個(gè)月，且溫度低，在此期間不便施用化學(xué)藥劑防治，但從東祁連山高寒草地珠芽蓼(Polygonumviviparum)中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌莫海威芽孢桿菌ZA1(Bacillusmojavensis)對(duì)馬鈴薯壞疽病菌的抑制效果明顯，且其對(duì)馬鈴薯其他貯藏期病害如馬鈴薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)、褐腐病菌(Stysanusstemonitis)、干腐病菌(Fusariumoxysporum)和早疫病菌(Alternariasolani)亦有較好的抑制效果[21]。因此，本試驗(yàn)研究了莫海威芽孢桿菌ZA1抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性，并優(yōu)化了培養(yǎng)條件，以期為ZA1研發(fā)成為微生物農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1　供試菌株

馬鈴薯壞疽病菌為供試病原菌；高寒草地珠芽蓼內(nèi)生細(xì)菌，菌株編號(hào)為ZA1，為供試拮抗菌，菌種均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2　培養(yǎng)基

供試培養(yǎng)基為PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)、NA(牛肉胨培養(yǎng)基)和NB(牛肉胨培養(yǎng)液)[22]。

1.3　無(wú)菌液的提取

將菌株ZA1在NA斜面培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌水配制懸浮液，接種于NA培養(yǎng)液中，裝液量為40 mL/150 mL，搖床培養(yǎng)24 h，即得發(fā)酵液，取發(fā)酵原液2 mL接種于NB培養(yǎng)液中搖床培養(yǎng)24 h，所得發(fā)酵液在轉(zhuǎn)速8000 r/min下離心20 min，取上清液用細(xì)菌過(guò)濾器(孔徑0.22 μm)過(guò)濾活菌體，即獲得菌株ZA1的無(wú)菌液，4℃下保存待用，用于研究?jī)?yōu)化產(chǎn)抑菌物質(zhì)的條件和穩(wěn)定測(cè)定。

1.4　ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)最佳條件的優(yōu)化

ZA1培養(yǎng)基，以PDA、NA培養(yǎng)基分別用于壞疽病菌和拮抗菌的活化；A、B、C、D、E、F、G、H等8種培養(yǎng)液用于研究其對(duì)抗菌物質(zhì)產(chǎn)生的影響。各配方如下：

A：牛肉胨5.0 g、蛋白胨10 g、蔗糖20 g、水1000 mL；

B：馬鈴薯200 g、蛋白胨10 g、蔗糖20 g、水1000 mL；

C(NB)：牛肉胨3 g、蛋白胨5.0 g、葡萄糖2.5 g、水1000 mL；

D(NYDA)：牛肉胨8 g、酵母浸膏5.0 g、葡萄糖10 g、水1000 mL；

E：玉米淀粉2.5 g、(NH4)2SO410 g、蔗糖10 g、水1000 mL；

F：玉米淀粉3.0 g、(NH4)2SO410 g、KH2PO415 g、蔗糖10 g、水1000 mL；

G：5×M9, Na2HPO464 g、KH2PO415 g、NaCl 2.5 g、NH4Cl 5.0 g、水1000 mL，取5×M920 mL定容至1000 mL；

H：蛋白胨10 g、酵母浸膏5.0 g、NaCl 10 g、水1000 mL。

將各培養(yǎng)液pH調(diào)至7.0，取40 mL培養(yǎng)液裝入150 mL三角瓶中，滅菌后分別接入2 mL 拮抗菌原液，每處理3瓶，將各處理置于26~28℃、150 r/min的搖床上分別培養(yǎng) 24 h后制備無(wú)菌液，并制成濃度為80 μL/mL的含藥平板，以無(wú)菌水為對(duì)照，測(cè)定抑制率，確定拮抗菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的最佳培養(yǎng)基。

溫度，設(shè)(15±1)℃，(20±1)℃，(25±1)℃，(30±1)℃，(35±1)℃，(40±1)℃，(45±1)℃等7個(gè)溫度處理，3次重復(fù)，其他培養(yǎng)條件及測(cè)定方法同上。

pH， 培養(yǎng)基pH值分別設(shè)置3，4，5，6，7，8，9，10和11(用pH-HJ90B酸度計(jì)測(cè)定)，其他培養(yǎng)條件及測(cè)定方法同上。

相對(duì)供氧量，在150 mL三角瓶中分裝20，40，60，80和100 mL NB培養(yǎng)液，將ZA1原液與NB培養(yǎng)液按1∶20的比例接菌，重復(fù)3次，其他培養(yǎng)條件及測(cè)定方法同上。

培養(yǎng)方式，設(shè)置靜止，間歇振(12 h/d)，全天24 h振蕩3個(gè)處理(振速150 r/min)，其他培養(yǎng)條件及測(cè)定方法同上。

光照，設(shè)置24，12 h/d光照和24 h/d黑暗3個(gè)處理，其他培養(yǎng)條件及測(cè)定方法同上。

發(fā)酵時(shí)間，分別培養(yǎng)24，48，72，96，120，144 和168 h后，利用無(wú)菌液與PDA混合制成濃度25 μL/mL的含藥平板測(cè)定抑菌率，明確抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系。

ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)最佳條件的驗(yàn)證，優(yōu)化前(25℃于pH為7.0的NB培養(yǎng)基中光照振蕩培養(yǎng)48 h，150 mL三角瓶裝液量為40 mL)，制備濃度依次為6.25，12.5，25，50和100 μL/mL含藥平板，以加無(wú)菌水為對(duì)照。經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)后，制備濃度為3.125，6.25，12.5，25和50 μL/mL 的含藥平板，計(jì)算抑菌率和EC50。

1.5　ZA1抑菌粗提物穩(wěn)定性的測(cè)定

熱穩(wěn)定性的測(cè)定：將ZA1的無(wú)菌液分別置于20，30，40，50，60，70，80，90和100℃水浴處理2 h及120℃滅菌2 h，取處理液2 mL配制含藥平板，采用十字交叉法測(cè)定抑制率。

UV穩(wěn)定性測(cè)定：將ZA1 無(wú)菌液分別置于2 mL離心管，進(jìn)行0，5，10，15，20，25，30 min的UV照射，后制成濃度為1.25 μL/mL的含藥平板，采用十字交叉法測(cè)定抑制率。

pH穩(wěn)定性測(cè)定：將ZA1無(wú)菌液的pH分別調(diào)至3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0和11.0， 4℃下保存24 h，其他方法同上。

對(duì)金屬離子的穩(wěn)定性測(cè)定：在無(wú)菌液中分別加入Na+，Mg2+，Cu2+，Mn2+，Zn2+，F(xiàn)e3+和Ag+，使終濃度為10 mmol/L，混勻反應(yīng)2 h后，以無(wú)菌液平板和各離子平板為對(duì)照，其他方法同上。

對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性測(cè)定：于ZA1的無(wú)菌液中分別加入蛋白酶K和胰蛋白酶，使胰蛋白酶的終濃度依次為32，16，8，4，2和0 mg/mL，蛋白酶K 的終濃度依次為40，20，10，5，2.5和0 mg/mL，37℃下反應(yīng)4 h后，制成濃度為20 μL/mL的含藥平板，以無(wú)菌液平板為對(duì)照，其他方法同上。

1.6　數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1　ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)最佳條件的優(yōu)化

2.1.1不同培養(yǎng)基對(duì)ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響ZA1在A，B和D培養(yǎng)液中所產(chǎn)生抑菌物對(duì)馬鈴薯壞疽病的抑制率分別達(dá)80.01%，82.99%和79.56%(圖1)，顯著高于其他培養(yǎng)液(P<0.01)，在C和H培養(yǎng)液中所產(chǎn)生抑菌物對(duì)馬鈴薯壞疽病的抑制率分別是69.79%和53.49%，其他培養(yǎng)液中所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)該病菌的抑制率均未達(dá)到10%，說(shuō)明不同培養(yǎng)液對(duì)ZA1產(chǎn)抑菌物質(zhì)的量有影響， ZA1最佳培養(yǎng)基為B培養(yǎng)液(馬鈴薯200 g、蛋白胨10 g、蔗糖20 g、水1000 mL)。

圖1　培養(yǎng)液對(duì)ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響Fig.1　Effect of ZA1 culture filtrates from different media on growth of P. foveata

2.1.2溫度對(duì)ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響結(jié)果表明，在20℃時(shí)，ZA1所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對(duì)馬鈴薯壞疽病的抑制率達(dá)到了88.50%，通過(guò)對(duì)溫度與抑制率的相關(guān)性分析，擬合得到了六次回歸曲線(圖2)：Y=8.222X-0.006X3+2.598×10-8X6-47.107，相關(guān)系數(shù)R=0.937**，求得ZA1產(chǎn)抑菌物質(zhì)的最佳溫度為17.8℃。

圖2　溫度對(duì)ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響Fig.2　Effect of ZA1 culture filtrates from different temperature on growth of P. foveata

不同字母表示差異顯著，小寫(xiě)：P<0.05；大寫(xiě)：P<0.01。下同。 Different capital and small letters are significantly different at 0.05 and 0.01 level. The same below.

2.1.3pH對(duì)ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響當(dāng)培養(yǎng)液的pH為7時(shí)，ZA1對(duì)馬鈴薯壞疽病的抑制率達(dá)到了82.16%，通過(guò)相關(guān)性分析，擬合得到了六次回歸曲線(圖3)：Y=41.524X-0.397X3+3×10-3X6-90.989，相關(guān)系數(shù)R=0.988**，根據(jù)曲線方程求得ZA1的產(chǎn)抑菌物質(zhì)最佳的pH為6.9，表明中性條件下有利于ZA1抑菌物質(zhì)的積累。

圖3　pH對(duì)ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響Fig.3　Effect of ZA1 culture filtrates from different pH on growth of P. foveata

2.1.4相對(duì)供氧量對(duì)ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響150 mL三角瓶裝液量為20 mL時(shí)，ZA1對(duì)馬鈴薯壞疽病的抑制率為72.23%，通過(guò)相關(guān)性分析，擬合得到了五次回歸曲線(圖4)：Y=89.349-1.292X+9.261×10-5X3-3.863×10-9X5，相關(guān)系數(shù)R=0.981**，求得ZA1的產(chǎn)抑菌物質(zhì)最佳的裝液量為150 mL三角瓶裝20 mL。

圖4　相對(duì)供氧量對(duì)ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響Fig.4　Effect of ZA1 culture filtrates from different oxygen supply on growth of P. foveata

2.1.5培養(yǎng)方式對(duì)ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響ZA1以振動(dòng)的方式培養(yǎng)時(shí)，分泌抑菌物質(zhì)最多，其對(duì)馬鈴薯壞疽病的抑制率可達(dá)76.56%，顯著高于只振動(dòng)培養(yǎng)12 h得到的抑制率68.75%和靜置培養(yǎng)24 h得到的抑制率46.16%(表1)，說(shuō)明ZA1的最佳培養(yǎng)方式為全過(guò)程振動(dòng)培養(yǎng)。

2.1.6光照時(shí)間對(duì)ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響全黑暗培養(yǎng)所得的無(wú)菌液對(duì)馬鈴薯壞疽病的抑制率為69.83%(表1)，顯著高于12和24 h光照的抑制率，說(shuō)明黑暗培養(yǎng)下培養(yǎng)ZA1，有利于抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生。

2.1.7發(fā)酵時(shí)間對(duì)ZA1產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響ZA1經(jīng)96 h的培養(yǎng)所得到的無(wú)菌液抑制率與經(jīng)過(guò)120，144和168 h培養(yǎng)得到的無(wú)菌液抑制效果差異不顯著，抑制率均達(dá)到87.6%以上(圖5)，說(shuō)明ZA1培養(yǎng)到96 h后抑菌物質(zhì)不再隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加。

2.1.8ZA1產(chǎn)抑菌物質(zhì)最佳條件的驗(yàn)證生長(zhǎng)速率法測(cè)定對(duì)馬鈴薯壞疽病的抑制率表明，抑制率與不同濃度的無(wú)菌液之間呈正相關(guān)，所得回歸直線的R=0.995**，差異極顯著，根據(jù)回歸直線求得ZA1無(wú)菌液的EC50=4.588 μL/mL(表2)。 按照最佳條件進(jìn)行培養(yǎng)(最佳培養(yǎng)液：B培養(yǎng)液,馬鈴薯200 g，蛋白胨10 g，蔗糖20 g，水1000 mL；最佳培養(yǎng)溫度：17.8℃；最佳pH：6.3；150 mL三角瓶的最佳裝液量20 mL；最佳培養(yǎng)方式：96 h暗處理振動(dòng)培養(yǎng))。所得的回歸直線R=0.997**，其EC50=0.1228 μL/mL，優(yōu)化后的EC50比優(yōu)化前小37倍，差異極顯著，說(shuō)明條件優(yōu)化后，對(duì)ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的能力有較大的提高。

圖5　培養(yǎng)時(shí)間對(duì)ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響Fig.5　Effect of ZA1 culture filtrates from different culture time on growth of P. foveata

表1　不同培養(yǎng)方式對(duì)ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響

注：不同字母表示差異顯著，小寫(xiě)：P<0.05；大寫(xiě)：P<0.01。下同。

Note: Different capital and small letters are significantly different at 0.05 and 0.01 level. The same below.2.2ZA1抑菌粗提物的穩(wěn)定性測(cè)定

2.2.1熱穩(wěn)定性測(cè)定ZA1無(wú)菌液在90℃時(shí)，其相對(duì)活性達(dá)到76.62%(表3)，表明ZA1抑菌活性物質(zhì)具有耐高溫的性質(zhì)，當(dāng)溫度達(dá)到和超過(guò)100℃后，其相對(duì)活性迅速下降，但沒(méi)有完全喪失，說(shuō)明ZA1的大多數(shù)抑菌活性物質(zhì)不耐100℃及以上的高溫。

2.2.2對(duì)pH的穩(wěn)定性測(cè)定無(wú)菌液在pH為3和11時(shí)，相對(duì)活性達(dá)到92.87%和85.11%(表4)，對(duì)馬鈴薯壞疽病菌的抑制率在50%以上，說(shuō)明ZA1分泌的抑菌物質(zhì)耐酸堿。

2.2.3對(duì)UV的穩(wěn)定性測(cè)定無(wú)菌液經(jīng)UV照射后，其相對(duì)活性均在96%以上，差異不顯著(P>0.05)(表5)，說(shuō)明ZA1的抑菌物質(zhì)對(duì)UV具有穩(wěn)定性。

2.2.4對(duì)金屬離子的穩(wěn)定性測(cè)定抑菌粗提物對(duì)Na+，Mg2+和Mn2+不敏感，相對(duì)活性沒(méi)有變化，對(duì)Zn2+，Cu2+，F(xiàn)e3+和Ag+等重金屬離子較為敏感，相對(duì)活性有所下降，其中對(duì)Ag+最為敏感，但是抑制率仍可達(dá)到77.82%(表6)，其相對(duì)活性下降極顯著，但下降幅度不超過(guò)15%。說(shuō)明ZA1的抑菌物質(zhì)對(duì)Ag+，Cu2+，Zn2+，F(xiàn)e3+等金屬離子不太穩(wěn)定，對(duì)其他金屬離子均具有穩(wěn)定性。

表2　ZA1的無(wú)菌液對(duì)馬鈴薯壞疽病菌的抑制作用

表3　ZA1無(wú)菌液的熱穩(wěn)定性

表4　ZA1的無(wú)菌液對(duì)pH的穩(wěn)定性

表5　ZA1無(wú)菌液的UV穩(wěn)定性

表6　ZA1的無(wú)菌液對(duì)金屬離子的穩(wěn)定性

2.2.5對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性測(cè)定無(wú)菌液經(jīng)不同濃度的蛋白酶K處理后，抑制率和相對(duì)活性在P<0.01水平差異不顯著；經(jīng)不同濃度的胰蛋白酶處理后，抑制率和相對(duì)活性均差異顯著(表7)，說(shuō)明ZA1分泌的抑菌物質(zhì)對(duì)胰蛋白酶較為敏感，即ZA1所分泌的抑菌物質(zhì)中存在抑菌蛋白。

3討論

近年來(lái)，隨著對(duì)抑菌機(jī)制的不斷研究，邢介帥等[10]分離得到的T2可分泌胞外蛋白酶，古麗皮艷等[23]分離得到的NKZ-E能夠分泌幾丁質(zhì)酶；高芬等[17]、連玲麗等[24]純化得到了具有良好穩(wěn)定性的抗菌多肽。說(shuō)明拮抗細(xì)菌主要以胞外分泌型物質(zhì)抑制病原菌的生長(zhǎng)，劉雪等[11]認(rèn)為這類(lèi)物質(zhì)主要有兩種類(lèi)型：大分子的抑菌蛋白和小分子肽類(lèi)。ZA1(B.mojavensis)的無(wú)菌液對(duì)馬鈴薯壞疽病菌的EC50=0.1228 μL/mL，拮抗效果明顯，說(shuō)明ZA1的抑菌物質(zhì)主要是胞外分泌型物質(zhì)。其抑菌粗提物可耐高溫、耐酸堿、對(duì)紫外線穩(wěn)定、且對(duì)蛋白酶的耐受性穩(wěn)定，這與王建綱等[25]認(rèn)為抗菌肽具有的特性一致，說(shuō)明ZA1可能能夠分泌抗菌肽，但對(duì)抗菌肽的分離、純化及結(jié)構(gòu)還需進(jìn)一步研究。ZA1的抑菌粗提物在90℃處理2 h后，相對(duì)活性穩(wěn)定在76.67%，但是100℃下處理2 h后抑菌活性直線下降，說(shuō)明ZA1也可能產(chǎn)生一些大分子的抑菌蛋白，隨著溫度的升高活性降低。由ZA1抑菌粗提物的種種性質(zhì)推測(cè)其可能也會(huì)分泌一些大分子量抑菌蛋白和小分子量的抗菌肽。除此之外， 120℃處理無(wú)菌液2 h后，相對(duì)活性仍達(dá)23.34%，說(shuō)明ZA1胞外分泌的抑菌物質(zhì)中含有耐高溫的抑菌物質(zhì)，此還需進(jìn)一步的研究。

表7　ZA1的無(wú)菌液對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性

ZA1對(duì)馬鈴薯壞疽病菌等馬鈴薯貯藏期的病原菌具有良好的抑制效果，本試驗(yàn)優(yōu)化得到了ZA1的分泌抑菌物質(zhì)最佳的培養(yǎng)條件，培養(yǎng)條件與常規(guī)培養(yǎng)稍有差異，但其積累抑菌物質(zhì)的最佳培養(yǎng)溫度為17.8℃，這與常規(guī)培養(yǎng)存在較大差異，明顯低于李晶等[26]、趙瑞等[27]對(duì)枯草芽孢桿菌TU100和B29產(chǎn)抑菌物質(zhì)的最佳溫度。由于ZA1是高寒草地珠芽蓼內(nèi)生菌，其特殊的生境可能是導(dǎo)致差異存在的原因，究其具體原因還需進(jìn)一步研究。通過(guò)優(yōu)化ZA1產(chǎn)抑菌物質(zhì)的條件及對(duì)抑菌粗提物抑菌活性的初步研究，為ZA1的小試、中試提供技術(shù)支持。

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通訊作者*Corresponding author.

作者簡(jiǎn)介：楊成德(1975-),男,甘肅隴南人，博士。E-mail:yangcd@gsau.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(No.31160122)和草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué))開(kāi)放課題項(xiàng)目(No.CYzs-2011011)資助。

收稿日期：2014-03-04；改回日期：2014-04-21

DOI：10.11686/cyxb2014086http://cyxb.lzu.edu.cn