和田羊抗苦馬豆素抗體間接ELISA檢測方法的建立

王 帥　陳根元　賈琦珍　胡建軍

(塔里木大學動物科學學院/新疆生產(chǎn)建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室， 新疆 阿拉爾 843300)

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和田羊抗苦馬豆素抗體間接ELISA檢測方法的建立

王 帥陳根元賈琦珍胡建軍*

(塔里木大學動物科學學院/新疆生產(chǎn)建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室， 新疆 阿拉爾 843300)

摘要建立特異性強、敏感性高的和田羊血清抗苦馬豆素(Swainsonine，SW)抗體ELISA檢測方法。利用自行制備的人工抗原SW-BSA(牛血清白蛋白)免疫接種和田羊，獲得SW抗血清后以間接ELISA法檢測血清抗體效價，通過分析包被抗原種類、濃度，血清稀釋度等指標對檢測數(shù)據(jù)的影響，選擇最適條件，確定檢測方法。試驗表明，以質量濃度為10 μg/mL 的SW-卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)抗原作為包被抗原，4 ℃下包被過夜，質量濃度為20 g/L的明膠封閉，酶標二抗的最佳稀釋比為1/1 600，試驗條件為37 ℃溫育1 h；樣品血清最佳稀釋比為1/80，試驗條件為37 ℃溫育2 h，底物最佳顯色時間為30 min。建立的抗SW抗體ELISA檢測方法，特異性強、穩(wěn)定性高，為進一步研究SW人工抗原的免疫原性等奠定了基礎。

關鍵詞苦馬豆素； 抗苦馬豆素抗體； ELISA檢測

瘋草(Locoweed)是豆科棘豆屬(Oxytropis)、黃芪屬(Astragalas)和苦馬豆屬(Sphaerophysa)等有毒植物的總稱，是世界范圍內(nèi)對草地畜牧業(yè)危害最嚴重的毒草。具有返青早、抗逆性強、根系發(fā)達、繁殖系數(shù)高等特點，冬末春初牧草缺乏時放牧家畜經(jīng)常因饑餓而被迫采食，從而導致中毒甚至死亡。其中對外來引進物種的種畜、孕畜危害尤為嚴重[1]?？囫R豆素(Swainsonine，SW)是一種多羥基吲哚里西啶生物堿，國內(nèi)外研究認為其是瘋草的主要毒性成分，可造成機體細胞空泡變性，導致內(nèi)質網(wǎng)斷裂、線粒體損傷等病理性變化[2]。但瘋草生物量大，營養(yǎng)成分也較為豐富，王帥[3]等研究發(fā)現(xiàn)瘋草小花棘豆的粗蛋白、氨基酸及微量元素組成與優(yōu)質紫花苜蓿(Medicago sativa)相近；而家畜少量采食瘋草時增膘也表明了瘋草具有一定的應用價值。如能將占西部草原30%以上的瘋草合理利用，可有效促進新疆草原畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

和田羊是新疆南疆地區(qū)的主要放牧品種，對本區(qū)的荒漠性氣候有較好的適應性，具有耐粗飼、耐熱等特點，目前已占本區(qū)綿羊存欄總數(shù)的70. 97%以上。近年來，和田羊小花棘豆中毒已成為本區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展面臨的嚴重問題[4]?，F(xiàn)有研究認為將SW與大分子載體蛋白(如BSA)偶聯(lián)成人工抗原(SW-BSA)，然后將其免疫家畜，誘導家畜產(chǎn)生抗SW抗體，可在一定程度上防治家畜的瘋草中毒。王帥等[5,6]利用SW人工抗原免疫接種家兔，以小花棘豆作為攻毒飼草進行試驗，發(fā)現(xiàn)該方法具有一定的保護效果。但SW免疫原性的分析和免疫效果的確定有賴于其抗體的準確檢測。ELISA法因具有快速、敏感、準確等優(yōu)點而得到廣泛應用，童德文[7]等以SW為包被抗原進行檢測，發(fā)現(xiàn)SW因分子量小存在與酶標板結合弱的問題，不利于試驗結果的穩(wěn)定性和精密性。有鑒于此，本試驗以和田羊抗SW血清為試驗材料，通過重新篩選包被抗原，優(yōu)化測定條件，以期建立和田羊抗SW抗體的特異性ELISA檢測方法，為和田羊安全利用瘋草奠定基礎。

1材料和方法

1.1試驗材料、試劑與儀器

SW、SW與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)抗原SW-BSA、SW與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)抗原SW-OVA、SW與人血清白蛋白(HSA)偶聯(lián)抗原SW-HSA均由兵團塔里木畜牧科技重點實驗室制備；山羊抗SW陽性血清，西北農(nóng)林科技大學饋贈；3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB，CAS: 54827-17-7)，購自美國Amresco公司；弗氏不完全佐劑(FAI)，弗氏完全佐劑(FAC)，均購自德國Sigma；羊IgG，HRP-兔抗羊IgG抗體，均購自北京普利萊基因技術有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

和田羊6只，年齡2歲左右，體重(28±1. 2kg)，購自和田地區(qū)策勒縣。

全波長酶標儀(美國Bio-Tek公司PowerWave XS)；智能生化培養(yǎng)箱(江蘇金壇醫(yī)療儀器廠SPX250)，精密電子天平(德國Sartorius BS124)；高速冷凍離心機(法國Jouan公司MR231)；超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司Direct-Q3)。

1.2和田羊抗SW血清的制備

將和田羊隨機分為陰性對照組(1只)和SW-BSA免疫組(5只)，參考王帥等[8]的研究進行基礎免疫和加強免疫，其中基礎免疫使用FAC，首免和加強免疫均使用佐劑和生理鹽水的混合液乳化人工抗原SW-BSA，免疫程序見表1。對照羊僅注射佐劑與生理鹽水的混合液，第三次加強免疫7 d后，所有試驗羊頸靜脈采血，分離血清，-20 ℃保存。

表1　免疫組的免疫時間和免疫劑量

1.3間接ELISA的操作

以0. 1 mol/L的碳酸鹽緩沖液為包被緩沖液，將包被抗原稀釋至10 μg/mL，每孔加100 μL，4℃包被過夜；棄去包被液，洗滌3次后拍干，每孔再加封閉劑(20 g/L明膠)200 μL，37℃孵育；棄去封閉劑，洗滌3次后拍干，每孔加血清100 μL，37℃孵育；棄去血清，洗滌3次后拍干，每孔加HRP-兔抗羊IgG 100 μL，37℃孵育；棄去酶標二抗，洗滌3次后拍干，每孔加底物溶液(TMB-H2O2)100 μL，37 ℃孵育，終止液為2 mol/L的硫酸溶液。同時設置陽性對照孔(SW陽性血清)、陰性對照孔(陰性對照組羊血清)和空白對照孔(PBS液)，檢測陰性對照孔OD450值(N)與待測樣品孔OD450值(P)，以P/N≧2. 1判定樣品為陽性[9]。

1.4酶標抗體最適稀釋度的選擇

制備質量濃度為100 ng/mL的羊IgG工作液以取代包被抗原，按照1.3中操作進行ELISA檢測，將HRP-兔抗羊IgG按照1/100，1/200，1/400，1/800，1/1 200，1/1 600，1/2 400和1/3 200的比例分別進行稀釋。取OD450值最接近1. 0時的酶標二抗稀釋度作為工作濃度。

1.5待檢血清稀釋倍數(shù)的選擇

使用包被緩沖液將待檢血清按照1/20，1/40，1/80，1/160，1/320和1/640的稀釋度分別進行ELISA檢測。血清最適稀釋倍數(shù)的選擇標準同上。

1.6包被抗原及最適濃度的選擇

以棋盤滴定法選擇SW-OVA、SW-HSA和SW分別作為包被抗原的工作濃度，使用包被緩沖液將三種抗原分別稀釋為100，10，1，0. 1和0. 01μg/mL共5個質量濃度梯度，分別包被過夜，以PBS為空白對照，通過ELISA檢測，計算P/N值，確定最適包被抗原及最佳濃度。

1.7抗原最佳包被條件的選擇

抗原包被條件分別設置為4 ℃過夜、37 ℃孵育1 h、37 ℃孵育2 h和37 ℃孵育4 h，通過ELISA檢測，計算P/N值，確定抗原最佳包被條件。

1.8血清最佳反應時間的選擇

將陽性血清反應時間分別設置為0. 5 h、1 h、1. 5 h和2 h，通過ELISA檢測，計算P/N值，確定血清最佳反應時間。

1.9酶標二抗最佳反應時間的選擇

將酶標二抗反應時間分別設置為0. 5 h、1 h、1. 5 h和2 h，通過ELISA檢測，計算P/N值，確定酶標二抗最佳反應時間。

1.10底物最佳顯色時間的選擇

將顯色時間分別設置為10 min、15 min、20 min、25 min和30 min，通過ELISA檢測，計算P/N值，確定底物最佳顯色時間。

1.11ELISA檢測和田羊血清的重復性試驗

應用單項試驗測定的最佳條件，對免疫組和田羊血清樣品進行ELISA檢測，并計算檢測結果的批間變異系數(shù)(CV)。

2結果與分析

2.1酶標抗體最適稀釋度的確定

由表2可知，當P/N值≧2. 1時，OD450值最接近1的酶標二抗稀釋度為1/1 600，故選擇1/1 600為ELISA檢測酶標抗體工作濃度。

表2　酶標抗體最適稀釋度的確定(n=12)

2.2血清稀釋倍數(shù)的確定

由表3可知，當P/N值≧2. 1時，OD450值最接近1的血清稀釋度為1/80，故選擇1/80為ELISA檢測血清最適稀釋倍數(shù)。

表3　待檢血清最適稀釋度的確定(n=12)

2.3包被抗原及最適濃度的確定

由表4可知，質量濃度為10 μg/mL的SW-OVA的P/N值顯著大于其余各組，試驗結果表明SW-OVA作為包被抗原的敏感性明顯高于其它抗原，因此選擇10 μg/mL的SW-OVA作為ELISA檢測的抗原包被濃度。

表4　包被抗原及最適工作濃度的確定(P/N值，n=3)

2.4抗原最佳包被條件的確定

由表5可知，當P/N值≧2. 1時，OD450值最接近1的包被條件為4 ℃過夜，故選擇4 ℃過夜作為ELISA檢測的抗原包被條件。

表5　抗原最佳包被條件的確定(n=12)

2.5血清最佳反應時間的確定

由表6可知，當P/N值≧2. 1時，OD450值最接近1的血清反應時間為2 h，故選擇2 h作為ELISA檢測的血清反應時間。

表6　血清最佳反應時間的確定(n=12)

2.6酶標二抗最佳反應時間的確定

由表7可知，當P/N值≧2. 1時，OD450值最接近1的酶標二抗反應時間為1 h，故選擇1 h作為ELISA檢測的酶標二抗反應時間。

表7　酶標二抗最佳反應時間的確定(n=12)

2.7底物最佳顯色時間的確定

由表8可知，當P/N值≧2. 1時，OD450值最接近1的底物顯色時間為30 min，故選擇30 min作為ELISA檢測的底物顯色時間。

表8　底物最佳顯色時間的確定(n=12)

2.8ELISA檢測和田羊血清的重復性試驗結果

重復性試驗結果見表9，試驗和田羊血清抗體ELISA檢測值的CV值為0. 21%～0. 56%，表明測定結果具有較好的重復性和穩(wěn)定性。試驗建立的SW抗體間接ELISA檢測方法：以10 μg/mL 的SW-OVA作為包被抗原，于4 ℃包被過夜， 封閉劑為20 g/L的明膠，待檢血清稀釋倍數(shù)為1/80，最佳反應時間為37 ℃2 h，酶標抗體的工作濃度為1/1 600，最佳反應時間為37 ℃1 h，底物溶液最佳顯色時間為30 min。具有較好的重復性和穩(wěn)定性。

表9　抗SW抗體間接ELISA檢測的重復性試驗(n=3)

3討論

我國現(xiàn)有黃芪屬植物278種，棘豆屬植物120余種，苦馬豆素植物1種，其中新疆分布黃芪屬植物81種，約占全國總種數(shù)的29%；棘豆屬植物97種，約占中國總種數(shù)的81%，苦馬豆屬植物1種[10]。據(jù)報道新疆黃芪屬、棘豆屬和苦馬豆屬植物確定含有SW的共20種，其中優(yōu)勢種8種，分布面積已超過100萬公頃，并且每年還在以3. 3%～3. 5%的速度蔓延[11]。瘋草對新疆牧區(qū)草原畜牧業(yè)的危害極為嚴重，現(xiàn)已引起了各級政府和科研工作者的廣泛關注。

通過免疫學方法接種放牧家畜，使其產(chǎn)生特異性抗體，從而在采食瘋草時獲得保護是目前的研究熱點，其中抗SW抗體的準確檢測是評價免疫效果的重要依據(jù)。童德文等[7]、陳根元等[12]分別建立了抗SW抗體的間接血凝檢測方法和瓊脂糖擴散檢測方法，均對抗SW抗體進行了定量檢測。但間接血凝檢測需預先使用SW對羊的紅細胞進行致敏，而致敏后的紅細胞保存期不超過7 d，不利于試驗結果的穩(wěn)定性和重復性；而瓊脂糖凝膠的機械強度差，又容易被細菌污染，極易影響測定結果。另外如免疫熒光技術和放射免疫測定等方法均需要特定的設備，不易推廣。ELISA檢測具有敏感、快速、準確、成本較低等優(yōu)點，無疑是抗SW抗體測定的最佳選擇。

ELISA檢測方法的特異性首先取決于包被抗原的種類與純度。童德文等[7]直接使用SW為包被抗原對家兔血清中的抗SW抗體進行了ELISA檢測，但其特異性和敏感性均較差。這是因為包被抗原與酶標板的吸附結合主要依靠抗原蛋白的疏水基團與固相載體表面的相互作用，易受蛋白質等電點、分子量和質量濃度等的影響。SW分子量小，僅為173，極難與酶標板結合，需通過與蛋白載體偶聯(lián)后才能包被抗原[13]。王愛華等[14]報道SW為包被抗原進行ELISA測定時陰性對照時的OD450值偏高，可能與SW同酶標板的結合較弱，易于脫落有關；也有可能是SW直接吸附后其抗原決定簇不能充分暴露，影響了與相應抗體的結合。本試驗分別以不同質量濃度的SW、SW-OVA和SW-HSA作為包被抗原進行檢測，表明質量濃度為10 μg/mL的SW-OVA包被效果最好，重復性試驗表明以SW-OVA作為包被抗原提高了ELISA檢測的穩(wěn)定性和敏感性。另外ELISA檢測的準確性還取決于包被抗原與免疫抗原的交叉性。OVA、BSA和HSA均為抗原制備的常見載體，三者間具有較低的抗原交叉性，其中以OVA為載體的人工抗原常被用作包被抗原以檢測BSA載體抗原的抗體[15]。本研究選用SW-OVA作為包被抗原，避免了測定中可能出現(xiàn)的交叉反應，證明建立的方法，具有較高的準確性和特異性。

總之，本試驗通過對SW-BSA免疫和田羊血清的測定，建立了特異性和穩(wěn)定性強、敏感度高的抗SW抗體間接ELISA測定方法。操作程序如下：包被抗原為10 μg/mL的 SW-OVA，每孔加入100 μL后于4 ℃包被過夜，選用20 g/L的明膠為封閉劑，樣品血清稀釋倍數(shù)為1/80，最佳反應程序為37 ℃孵育2 h，酶標抗體的工作濃度為1/1 600，最佳反應程序為37 ℃孵育1 h，底物溶液最佳顯色時間為30 min，終止液為2 mol/L的硫酸溶液。

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Establishment Detection Method of Indirect Enzyme-linked Immun

osorbent Assay of Anti-Swainsonine Antibody in Hetian Sheep

Wang ShuaiChen GenyuanJia QizhenHu Jianjun*

(College of Animal Science/ Key laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology,

XinJiang Production & Construction Corps, Alar, XinJiang 843300)

AbstractThe purpose of this experiment was to establish an detection methods of indirect enzyme-linked immunosorbent assay to determine the level of antibody against SW with high sensibility and specificity. The Hetian sheep SW antiserum was prepared by inoculating with home-made SW-BSA. SW antiserum was used to detect serum antibody titer by indirect ELISA method using different coating antigen, then to analyze the optimal conditions of the established indirect ELISA, such as type and concentration of coating antigen, different serum dilution, determine best method. The results showed that using SW-OVA as coating antigen was better than any other, the optimal conditions of the method were as follows: the density of coating antigen(SW-OVA) was 10 μg/mL, the reaction time was 12 h and reaction temperature was 4 ℃;the impacting medium gelatine of 20 g/L, the working concentration of enzyme labeled antibody was 1/1 600, the reaction time was 1 h and reaction temperature was 37 ℃; the serum dilution was 1/80, the reaction time was 2 h and reaction temperature was 37 ℃;the reaction time was 30 min for substrate colouration. This method was verified with high specificity and stability via the determination of the antibody anti- SW in serum of Hetian sheep, thus providing a basic method for further research of SW artificial antigen.

Key wordsswainsonine; antibody anti- swainsonine; Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

中圖分類號：S854.4

文獻標識碼：ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2015.04.004

文章編號：1009-0568(2015)04-0025-07

通訊作者*為E-mail：hjjhpm@163.com

作者簡介：王帥(1984-)，男，實驗師，碩士，研究方向為動物中毒病與毒理學。E-mail：wangshuaidky@126.com

基金項目：國家自然科學基金(31460678,31160497); 新疆生產(chǎn)建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室開放課題(HS201207)。

收稿日期：2015-04-08