牛羊包蟲(chóng)病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的研究進(jìn)展

孫 雨，王曉英，董 浩，曲 萍，胡冬梅，趙柏林，石 慧，宋曉暉

（中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京102600）

專論與綜述

牛羊包蟲(chóng)病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的研究進(jìn)展

孫 雨，王曉英，董 浩，曲 萍，胡冬梅，趙柏林，石 慧，宋曉暉

（中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京102600）

包蟲(chóng)病是由寄生于犬、狼、狐貍等動(dòng)物小腸的棘球絳蟲(chóng)中絳期（棘球蚴）感染中間宿主而引起的一種嚴(yán)重的人與動(dòng)物共患寄生蟲(chóng)病。其確診除需要常規(guī)的臨床診斷外，還依賴于血清學(xué)、分子生物學(xué)以及影像學(xué)等實(shí)驗(yàn)室診斷方法。文章從包蟲(chóng)病的流行病學(xué)特點(diǎn)、細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的結(jié)構(gòu)及生活史、包蟲(chóng)病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和診斷技術(shù)進(jìn)行綜述，并對(duì)實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)確診包蟲(chóng)病的前景進(jìn)行了展望，以期為包蟲(chóng)病的臨床快速診斷和深入研究提供一定的參考。

包蟲(chóng)病；流行病學(xué)；實(shí)驗(yàn)室診斷

包蟲(chóng)?。╤ydatidosis）是由棘球絳蟲(chóng)的幼蟲(chóng)寄生于人及牛羊豬等多種哺乳動(dòng)物的肝、肺等內(nèi)臟器官，成蟲(chóng)寄生于犬、狼、狐等食肉動(dòng)物腸道所致的人畜共患寄生蟲(chóng)病［1］。包蟲(chóng)病呈全球性分布，尤其以放牧或半農(nóng)半牧為主要畜牧業(yè)生產(chǎn)方式的國(guó)家為主。該寄生蟲(chóng)的蚴體生長(zhǎng)力強(qiáng)，體積大，不僅壓迫周圍組織使之萎縮和功能障礙，還易造成繼發(fā)感染，如果蚴體包囊破裂，可以引起過(guò)敏反應(yīng)，甚至導(dǎo)致死亡，嚴(yán)重威脅公共安全和畜牧業(yè)生產(chǎn)，影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展［2］。我國(guó)政府高度重視包蟲(chóng)病的防控工作，農(nóng)業(yè)部將其列為二類動(dòng)物疫病，衛(wèi)生部將其列入丙類傳染病。包蟲(chóng)病防治工作目前存在防控手段單一、流行區(qū)域流行形勢(shì)復(fù)雜、缺乏防控技術(shù)規(guī)范等問(wèn)題，已經(jīng)

成為一個(gè)世界性的難題。2010年，農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部等14個(gè)部委聯(lián)合印發(fā)了《防治包蟲(chóng)病行動(dòng)計(jì)劃（2010—2015年）》，極大地推動(dòng)了我國(guó)包蟲(chóng)病防控工作進(jìn)展。但由于包蟲(chóng)病流行區(qū)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展水平相對(duì)滯后，地理環(huán)境復(fù)雜，自然條件惡劣，宗教習(xí)俗多樣，農(nóng)牧民群眾科學(xué)文化知識(shí)普及率較低，防治機(jī)構(gòu)和隊(duì)伍不健全，動(dòng)物宿主種類多、數(shù)量大、分布廣、管理難度大等因素，我國(guó)包蟲(chóng)病防控工作仍然面臨諸多困難和巨大挑戰(zhàn)。本文從包蟲(chóng)病流行特點(diǎn)、細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的結(jié)構(gòu)及生活史、包蟲(chóng)病的檢測(cè)和診斷技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為包蟲(chóng)病的臨床快速診斷和深入研究提供一定的參考。

1　病原特征

1.1病原分類

包蟲(chóng)又名棘球絳蟲(chóng)（Echinococcu spp.），在分類上屬于帶科（Taeniidae）、棘球?qū)伲‥chinococcus）。棘球?qū)侔?個(gè)種，即細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)（E.granulosus）、多房棘球絳蟲(chóng)（E.multilocularis）、石渠棘球絳蟲(chóng)（E.shiquius）、少節(jié)棘球絳蟲(chóng)（E.oligarthtus）和福氏棘球絳蟲(chóng)（E.vogeli），我國(guó)以前3個(gè)種較為多見(jiàn)［3-9］。其中對(duì)人畜危害最嚴(yán)重的為細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)，可分為多個(gè)基因型，包括羊種（G1、G2）、牛種（G3、G5）、馬種（G4）、駱駝種（G6）、豬種（G7）及G8，以及在波蘭的豬上發(fā)現(xiàn)的第9基因型（G9）和在歐亞的馴鹿上發(fā)現(xiàn)的第10基因型（G10）。在我國(guó)主要流行細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)G1基因型［10-13］。

1.2病原的基本形態(tài)特征

棘球絳蟲(chóng)的成蟲(chóng)長(zhǎng)度2～7 mm，由頭節(jié)和3～4個(gè)節(jié)片組成。頭節(jié)上有4個(gè)吸盤(pán)，頂突上有36～40個(gè)小鉤。成蟲(chóng)的孕節(jié)內(nèi)含有一套雌雄同體的生殖器官，生殖孔位于節(jié)片側(cè)緣的后半部。孕節(jié)的長(zhǎng)度遠(yuǎn)大于寬度，約占蟲(chóng)體長(zhǎng)度的一半，并有多對(duì)子宮側(cè)枝，內(nèi)部充滿蟲(chóng)卵。包蟲(chóng)的蚴體為包囊狀構(gòu)造，內(nèi)含液體。棘球蚴的形狀常常因寄生部位的不同而有變化，一般近似球形，直徑5～10 mm。棘球蚴的囊壁分為兩層：外層為乳白色的角質(zhì)層，內(nèi)層為胚層，又稱生發(fā)層，前者由后者分泌而成。胚層向囊腔芽生出成群的細(xì)胞，這些細(xì)胞空腔化后形成一個(gè)小囊，并長(zhǎng)出一個(gè)小蒂與胚層相連。這些小囊能夠生成數(shù)量不等的原頭蚴，因此這些小囊又被稱為育囊或者生發(fā)囊［1］。

2　流行病學(xué)特征

2.1傳染來(lái)源與傳播途徑

人、綿羊、山羊和牛等中間宿主的感染多因直接接觸犬和狐貍，經(jīng)口感染蟲(chóng)卵，或因吞食被蟲(chóng)卵污染的水、草、食物和蔬菜等而感染；工人在處理和加工狐貍與狼的皮毛時(shí)也容易感染該病。犬科動(dòng)物主要是食入了帶有棘球蚴的動(dòng)物內(nèi)臟組織器官而感染該病。人感染包蟲(chóng)病主要是通過(guò)消化道傳入，也有報(bào)道稱蟲(chóng)卵能與塵?；旌想S風(fēng)通過(guò)呼吸道傳入人體內(nèi)［14-16］。該病還可以通過(guò)破損的皮膚以及胎盤(pán)感染給人。我國(guó)甘肅曾報(bào)道過(guò)陰道包蟲(chóng)病的病例，在衛(wèi)生習(xí)慣不良的情況下，蟲(chóng)卵帶入陰道被分泌物消化，在經(jīng)細(xì)微損傷直接植入陰道粘膜下，逐漸形成了陰道包蟲(chóng)?。?］。

2.2易感宿主

人、綿羊、山羊、牛和豬等家畜均是較敏感的中間宿主，其中人和綿羊較為易感。該病寄生于動(dòng)物內(nèi)臟器官和全身臟器中，尤其寄生于肝和肺臟，犬和犬科動(dòng)物是該病的終末宿主，寄生于小腸［17］。

2.3棘球絳蟲(chóng)的生活史

棘球絳蟲(chóng)寄生于犬、狼、狐貍的小腸，蟲(chóng)卵和孕節(jié)隨終末宿主的糞便排出體外，中間宿主隨污染的牧草和飲水吞食蟲(chóng)卵后而感染。蟲(chóng)卵內(nèi)的六鉤蚴進(jìn)入中間宿主體內(nèi)后在消化道孵出，鉆入腸壁，隨血流或淋巴散布到體內(nèi)各處，以肝和肺內(nèi)最為常見(jiàn)。在中間宿主機(jī)體內(nèi)，蟲(chóng)卵經(jīng)過(guò)6～12個(gè)月的生長(zhǎng)可成為具有感染性的棘球蚴。犬、狐貍等終末宿主吞食了含有棘球蚴的臟器后即得到感染，經(jīng)過(guò)40～50 d發(fā)育為細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)，成蟲(chóng)在犬、狐貍等動(dòng)物體內(nèi)的壽命為5～6個(gè)月［18-20］。

2.4流行與分布

包蟲(chóng)病呈全球性分布，尤其以畜牧業(yè)（如羊、牛等）為主的國(guó)家較為嚴(yán)重。中國(guó)、蒙古、土耳其、土庫(kù)曼斯坦、敘利亞、黎巴嫩、阿根廷、巴西、智利、澳大利亞、新西蘭以及非洲一些國(guó)家均是包蟲(chóng)病的重要流行國(guó)家［21］。其中對(duì)畜牧業(yè)危害最為嚴(yán)重的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)有著不同的基因型，包括羊種（G1、G2）、牛種（G3、G5）、馬種（G4）、駱駝種（G6）、豬種（G7）及G8，第9基因型（G9）在波蘭的豬上發(fā)現(xiàn)，第10基因型（G10）在歐亞的馴鹿上發(fā)現(xiàn)［22］。羊種G1蟲(chóng)株目前是最易感染人的，也是世界上分布最廣的，其在羊上的高感染率表明其也是感染人的基因變異型，與人間在摩洛哥、突尼斯、肯尼亞、哈薩克斯坦、阿根廷及中國(guó)西部的高流行性一致［23］。我國(guó)是人畜棘球蚴病高發(fā)國(guó)家之一，主要由細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)引起。目前在我國(guó)有10種有蹄家畜均有不同程度的感染：綿羊、山羊、牦牛、黃羊、水牛、駱駝、馬、驢、騾以及豬，其中綿羊受感染的程度最為嚴(yán)重，受威脅最大。自1905年我國(guó)青島首次報(bào)道人體棘球蚴病以來(lái)，現(xiàn)已在23個(gè)省、自治區(qū)和直轄市發(fā)現(xiàn)原發(fā)的人和動(dòng)物棘球蚴病，其中新疆、青海、甘肅、四川、寧夏、內(nèi)蒙古和西藏呈嚴(yán)重的地方性流行，為我國(guó)棘球蚴病高發(fā)區(qū)。我國(guó)包蟲(chóng)病的流行區(qū)人群平均患病率1.08%，囊型包蟲(chóng)病病灶出現(xiàn)突然破裂，可致過(guò)敏性休克而死亡，而未經(jīng)治療的泡型包蟲(chóng)病患者10年病死率高達(dá)94%，被稱為“蟲(chóng)癌”［24］。

3　實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)

3.1酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是近幾年關(guān)注較多的一種檢測(cè)包蟲(chóng)病的方法，并有可能取代皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)，用于樣品的大規(guī)模初篩檢測(cè)［25］。對(duì)中間宿主開(kāi)展免疫診斷時(shí)，可用囊液、抗原B（AgB）、粗提原頭節(jié)蛋白為包被抗原進(jìn)行ELISA檢測(cè)。尤其是抗原AgB具有非常好的免疫原性，能夠識(shí)別出80%包蟲(chóng)病患病動(dòng)物，同時(shí)它在調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)中也具有很重要的作用。目前使用的檢測(cè)包蟲(chóng)病的ELISA方法大多為間接ELISA方法，其優(yōu)點(diǎn)是快速、簡(jiǎn)便、可用于大規(guī)模定性檢測(cè)。但由于AgB抗原具有明顯的變異和多態(tài)性。同時(shí)差異分子生物學(xué)結(jié)果顯示，AgB在寄生蟲(chóng)生活史的不同階段的表達(dá)存在差異，所以AgB作為抗原包被用于ELISA檢測(cè)動(dòng)物血清，其敏感性較差，還需檢測(cè)方法輔助進(jìn)行確證［26］。

3.2皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)

皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)是一種速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，用于檢測(cè)包蟲(chóng)病時(shí)操作簡(jiǎn)單，并且可在短時(shí)間內(nèi)觀察結(jié)果，一般認(rèn)為其陽(yáng)性檢出率可達(dá)90%以上，但特異性較低，不同寄生蟲(chóng)病之間有明顯的交叉反應(yīng)。因此，皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)不能作為確診的依據(jù)，也不宜用于療效考核，只能在流行區(qū)對(duì)可疑患病動(dòng)物起過(guò)篩作用［27］。

3.3免疫PCR法

免疫PCR法（immuno-PCR）是利用抗原抗體反應(yīng)的特異性和PCR擴(kuò)增反應(yīng)的極高靈敏性而建立的一種微量抗原檢測(cè)技術(shù)。免疫PCR是在ELISA的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的新方法，用PCR擴(kuò)增代替ELISA的酶催化底物顯色［20］。PCR具有很強(qiáng)的放大能力，其可以定量地檢測(cè)DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特異性，因此，將與抗原結(jié)合的特異抗體通過(guò)連接分子與DNA結(jié)合，再經(jīng)PCR擴(kuò)增，由此定量檢測(cè)抗原使敏感性高于ELISA和RIA。這種方法比酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和酶免疫法（ELA）等傳統(tǒng)方法更靈敏。Immuno-PCR識(shí)別一抗和二抗的靈敏度高達(dá)108。Immuno-PCR由待測(cè)抗原、生物素化抗體、親和素 （連接分子）、生物素化DNA、PCR擴(kuò)增5部分構(gòu)成。目前主要用于檢測(cè)腫瘤、細(xì)胞因子、神經(jīng)內(nèi)分泌活性多肽、微生物抗原、各種活性酶、衣原體和各種寄生蟲(chóng)等微量抗原。該方法用于包蟲(chóng)病診斷的優(yōu)點(diǎn)是可以提高其診斷的特異性和敏感性。缺點(diǎn)是該方法尚處于研究階段，配套試劑尚缺乏，在檢測(cè)寄生蟲(chóng)領(lǐng)域也屬于摸索階段，試驗(yàn)的條件、優(yōu)化方法和程序需要進(jìn)一步完善。

3.4環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換型DNA聚合酶（Bst DNApolymerase）在恒溫65℃左右保溫幾十分鐘快速進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法。該技術(shù)已開(kāi)始廣泛應(yīng)用于各種病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等引起的疾病檢測(cè)，以及進(jìn)出口快速診斷中，并得到了世界上許多國(guó)家的認(rèn)同［28］。LAMP方法在檢測(cè)包蟲(chóng)病方面的優(yōu)勢(shì)除了高特異性、高靈敏度外，操作十分簡(jiǎn)單，對(duì)儀器設(shè)備要求低，一臺(tái)水浴鍋或恒溫箱就能實(shí)現(xiàn)反應(yīng)，結(jié)果的檢測(cè)也很簡(jiǎn)單，不需要像PCR那樣進(jìn)行凝膠電泳，反應(yīng)的結(jié)果通過(guò)肉眼觀察白色渾濁或綠色熒光的生成來(lái)判斷，簡(jiǎn)便快捷，適合基層快速診斷。其缺點(diǎn)是該方法靈敏度非常高，一旦開(kāi)蓋容易形成氣溶膠污染，加上目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室不能嚴(yán)格分區(qū)，假陽(yáng)性問(wèn)題比較嚴(yán)重，建議在進(jìn)行試劑盒的研發(fā)過(guò)程中采用實(shí)時(shí)渾濁儀，不要把反應(yīng)后的PCR管打開(kāi)。同時(shí)該方法對(duì)引物設(shè)計(jì)要求也比較高。

3.5抑制差減雜交法

抑制差減雜交（suppression subtractive hybridization，SSH）技術(shù)是基于抑制PCR和差減雜交技術(shù)建立的簡(jiǎn)單有效的方法，通過(guò)一次差減雜交可使低豐度的序列（mRNA）得以高于1 000倍的富集，有效地選擇性擴(kuò)增目標(biāo)序列，同時(shí)抑制非目標(biāo)序列的擴(kuò)增，因此在分離基因特別是分離低豐度差異表達(dá)基因方面具有更廣闊的應(yīng)用前景［20］。在轉(zhuǎn)錄水平上研究基因表達(dá)的技術(shù)，具有穩(wěn)定、高效、可靠的特點(diǎn)，可對(duì)生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老、死亡等生命過(guò)程及生物或非生物逆境脅迫對(duì)生物所造成的影響等進(jìn)行全面、系統(tǒng)的分析。該方法便于應(yīng)用在尋找與寄生蟲(chóng)不同發(fā)育階段相關(guān)的差異表達(dá)基因和與寄生蟲(chóng)抗藥性相關(guān)的差異表達(dá)基因，以及其他相關(guān)基因的研究，如與不同蟲(chóng)株、不同宿主或性別差異相關(guān)的基因［29］。在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中，可通過(guò)此技術(shù)得到不同發(fā)育期差異表達(dá)的基因，并將這些基因用于診斷和防治包蟲(chóng)病。該方法是一種高效鑒定和分離克隆差異表達(dá)基因的新技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是高效、便捷和假陽(yáng)性率低，在檢測(cè)包蟲(chóng)病方面有一定的應(yīng)用前景。但是，目前在寄生蟲(chóng)學(xué)研究中的應(yīng)用不是很多，因?yàn)镾SH方法一般只用于兩個(gè)樣品的差異比較分析，對(duì)于多個(gè)樣品則無(wú)能為力，這在很大程度上限制了它的應(yīng)用。

3.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time，QPCR）技術(shù)是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。該方法在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累計(jì)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，最后通過(guò)特定數(shù)學(xué)原理對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析［20，30］。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。目前實(shí)時(shí)熒光定量PCR法主要包括熒光嵌合法和熒光探針?lè)▋煞N。該方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食源微生物、食品過(guò)敏源、轉(zhuǎn)基因、乳品企業(yè)微生物等檢測(cè)領(lǐng)域。國(guó)內(nèi)外寄生蟲(chóng)領(lǐng)域的學(xué)者也開(kāi)始使用該方法檢測(cè)包蟲(chóng)病。該方法的優(yōu)點(diǎn)是實(shí)時(shí)定量檢測(cè)寄生蟲(chóng)體基因核酸，具有比化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨、蛋白芯片等免疫學(xué)方法更獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)；其缺點(diǎn)是對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器與實(shí)驗(yàn)室條件要求較高，成本較貴，在獸醫(yī)基層包蟲(chóng)病防治過(guò)程中推廣較難。

4　研究展望

在世界范圍內(nèi)，包蟲(chóng)病仍是引起家畜發(fā)病和死亡的重要原因之一。目前，分子生物學(xué)和免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，尤其是ELISA方法以及PCR方法的不斷改進(jìn)，為包蟲(chóng)病診斷新技術(shù)的建立提供了機(jī)遇，也促使包蟲(chóng)病患畜的早期診斷與發(fā)現(xiàn)有了重大突破。但是現(xiàn)有的包蟲(chóng)病診斷技術(shù)中，病原的分離培養(yǎng)十分繁瑣和困難，血清學(xué)診斷存在較多的假陽(yáng)性現(xiàn)象，抑制差減雜交操作過(guò)程繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)、要求高。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)、免疫PCR技術(shù)以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR等檢測(cè)技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，若能將這些技術(shù)應(yīng)用到包蟲(chóng)病的診斷上，將會(huì)對(duì)該病的診斷和控制發(fā)揮重要的作用。鑒于包蟲(chóng)病的生活史和流行范圍以及宿主眾多，徹底消除該病的傳播還很困難，應(yīng)使用適合的方法及時(shí)準(zhǔn)確地進(jìn)行檢測(cè)，從而為包蟲(chóng)病的預(yù)防和控制提供依據(jù)。所以加強(qiáng)檢測(cè)與監(jiān)測(cè)、定期驅(qū)蟲(chóng)、控制傳染源、阻斷流行環(huán)節(jié)，對(duì)控制與減少地方性包蟲(chóng)病的流行具有非常重要的作用。

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Research Progress in the Epidemiological Characteristics and Diagnosis Technology of Hydatidosis

Sun Yu，WangXiaoying，SongXiaohui，et al
（China Animal Disease Control Center，Beijing102600，China）

Hydatidosis is a serious zoonosis，which is parasitic on animals such as dogs，wolf and fox in the small intestine. Diagnosis methods ofhydatidosis include clinical symptoms，while a final diagnosis is depended on laboratorydiagnostic methods，such as serological diagnosis，imaging diagnosis，and molecular biological diagnosis.In order to provide some reference for the clinical rapid diagnosis and deep research of hydatidosis，the epidemiological features of hydatidosis，structure and life history of echinococcus，the laboratory tests and diagnostic technology of hydatidosis were reviewed in this paper.In addition，the prospects for the diagnosis ofhydatidosis in laboratorywere discussed at the end ofthe article.

hydatidosis；epidemiology；laboratorydiagnosis

S852.7

A

2095-3887（2016）01-0049-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.01.014

2015-10-12

農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與防治項(xiàng)目

孫雨，男，獸醫(yī)師，博士，主要從事人畜共患病預(yù)防控制研究。

宋曉暉，女，高級(jí)獸醫(yī)師，博士，主要從事草食動(dòng)物疫病預(yù)防控制研究。