突觸核蛋白病中α-syn聚集及播散的機(jī)制研究

何一昕　王雪晶　丁雪冰　梁東曉　潘鵬偉　劉丹丹　方艷博　滕軍放

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科　鄭州　450052

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·研究生園地·

突觸核蛋白病中α-syn聚集及播散的機(jī)制研究

何一昕王雪晶丁雪冰梁東曉潘鵬偉劉丹丹方艷博滕軍放△

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科鄭州450052

【關(guān)鍵詞】突觸核蛋白??；a-synuclein；包涵體；聚集；播散

突觸核蛋白病(α-synucleinopathy)是一類以大腦中不同類型α-突觸核蛋白(α-synuclein，簡稱α-syn)陽性包涵體為病理特征的神經(jīng)變性疾病，包括帕金森病、路易體癡呆、多系統(tǒng)萎縮及其他含α-突觸核蛋白病理的少見疾病。其中，帕金森病和路易體癡呆的標(biāo)志是腦干或皮質(zhì)Lewy小體，而多系統(tǒng)萎縮則表現(xiàn)為少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的胞漿包涵體[1]。由于所有這些包涵體的主要成分均為α-突觸核蛋白，因此，α-突觸核蛋白的聚集和播散被認(rèn)為是這些疾病發(fā)生及發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，引起大家廣泛關(guān)注。最近關(guān)于α-突觸核蛋白的研究逐漸增多，很大程度上提升了我們對突觸核蛋白病的發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識。本文中我們重點關(guān)注了近幾年來，對突觸核蛋白病中α-syn聚集及播散機(jī)制的研究進(jìn)展。

1α-突觸核蛋白聚集體形成的機(jī)制

大家已廣泛接受神經(jīng)元內(nèi)α-突觸核蛋白包涵體具有神經(jīng)毒性，α-syn的異常聚集是包涵體形成的關(guān)鍵步驟[2]。了解導(dǎo)致α-突觸核蛋白聚集的機(jī)制是解釋突觸核蛋白病發(fā)病的一個重要環(huán)節(jié)，并可能據(jù)此預(yù)防或抑制異常聚集體形成以促進(jìn)新療法的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)[3]，在突觸核蛋白病中，有不同溶解度和不同分子量的α-syn聚集體。另外，A30P、E46K和A53T突變的存在也加速異常蛋白聚集形成纖維，提示影響α-syn內(nèi)在結(jié)構(gòu)的突變可導(dǎo)致其聚集增強(qiáng)[4]。越來越多的證據(jù)表明，包括翻譯后修飾和選擇性剪切等復(fù)雜機(jī)制的事件也與疾病相關(guān)[5]。目前為止，多種α-突觸核蛋白聚集機(jī)制已被提出。

1.1野生型α-突觸核蛋白的自身聚集α-突觸核蛋白生理狀態(tài)下主要以無結(jié)構(gòu)或α-螺旋結(jié)構(gòu)的形式存在，在腦組織中存在的主要生理形式是非折疊的單體形式[6]，在其單體形式時是不穩(wěn)定的，可自我組裝形成較穩(wěn)定的部分折疊的蛋白，導(dǎo)致可溶性寡聚體形成，之后進(jìn)一步組裝形成富含β-片層的不溶性淀粉樣纖維[7]，上述過程在蛋白過量或應(yīng)激條件下明顯增強(qiáng)，導(dǎo)致錯誤構(gòu)象蛋白積累。富含β-片層錯誤構(gòu)象的異常折疊蛋白能夠作為模板繼續(xù)引發(fā)更多正常構(gòu)象的蛋白聚集。越來越多的研究證實，α-syn非纖維化二聚體或寡聚體是形成纖維聚集體或Lewy小體的中間媒介[8]。

在突觸核蛋白病中，含112個氨基酸的截短型α-syn(AS112)比含 140個氨基酸的全長型α-syn明顯較多[9]。這種C端截短型的α-syn是α-syn的一種最主要的選擇性剪切異構(gòu)體，它保存了完整的膜蛋白和蛋白質(zhì)結(jié)合域，是一種膜結(jié)合特性增強(qiáng)的聚集傾向較強(qiáng)的亞型，比全長蛋白更易聚集。在聚集早期，小部分與胞膜結(jié)合的α-syn募集了豐富的胞質(zhì)內(nèi)α-syn，并使其靶向至AS112的膜-蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域，這是早期聚集步驟中的一個關(guān)鍵要素[5，9]。

對皮質(zhì)路易小體的形成進(jìn)行免疫顯微鏡觀察，根據(jù)其形態(tài)學(xué)變化可分為不同階段。第1階段，細(xì)胞質(zhì)中顆粒狀α-syn在神經(jīng)細(xì)胞體中積累，隨后細(xì)絲狀α-syn的加入進(jìn)入第2階段。第3階段，α-syn積累組成密集的顆粒細(xì)絲狀產(chǎn)生典型的圓形LBS。階段4的特點是樹突的參與。在階段5路易小體變形并形成松散的邊緣。最后，在階段6路易小體發(fā)生降解，表現(xiàn)為松散的絲狀元件，α-syn免疫反應(yīng)性下降。大腦輕微的路易小體病理表現(xiàn)為新皮質(zhì)中第1到第2階段的病理改變，而嚴(yán)重的LB病理表現(xiàn)為邊緣皮層中第5到6階段的病理改變[10]。

在對α-syn聚集形成包涵體的研究發(fā)現(xiàn)，多種蛋白可能與其相關(guān)，但具體分子機(jī)制未完全清楚。在突觸核蛋白病中包涵體形成的一個常見的早期事件為α-syn/rab3a的結(jié)合，借助rabphilin蛋白使α-syn與rab3a間接連接，而在正常大腦中未發(fā)現(xiàn)，提示rab3a可能在包涵體形成過程中起一定作用[11]。另一個包涵體的常見成分是氧化應(yīng)激相關(guān)的泛素結(jié)合蛋白p62，它的免疫染色模式與泛素很相似，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)p62與泛素化蛋白的集合增強(qiáng)聚集過程相關(guān)[12]。在PD的腦干路易小體中，α-syn結(jié)合蛋白synphilin-1位于路易小體致密核心的絲狀及環(huán)狀結(jié)構(gòu)中，可與E3泛素連接酶doffin物理連接并被泛素化，之后可與α-syn相互作用形成核心，促進(jìn)α-syn的聚集和泛素化[13]。

體外研究發(fā)現(xiàn)，α-突觸核蛋白的自我低聚可以通過蛋白分子增加、膜的存在而啟動，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)可通過添加金屬離子、三氟乙醇、組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)、肝素或硫酸化糖胺聚糖、氧化應(yīng)激、降低pH值、抑制蛋白酶體等方法誘導(dǎo)其聚集[2]。

1.2突變型α-突觸核蛋白的聚集機(jī)制雖然α-突觸核蛋白基因突變在PD中較少見，但與家族性PD的常染色體顯性遺傳相關(guān)，有助于闡明α-突觸核蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積累的分子機(jī)制。

與家族性PD相關(guān)的最常見點突變?yōu)锳53T、A30P、E46K突變，其突變位點均發(fā)生于包含4個不完全重復(fù)序列的氨基端(1-60)[14]，此區(qū)域易形成α-螺旋結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是介導(dǎo)蛋白質(zhì)-膜、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的區(qū)域，此區(qū)域的突變因其重復(fù)序列改變易形成β-片層結(jié)構(gòu)而容易聚集。另外，α-突觸核蛋白A53T點突變增強(qiáng)了多巴胺誘導(dǎo)的氧化損傷，有助于囊泡內(nèi)多巴胺儲存和胞質(zhì)中多巴胺的積累，促進(jìn)氧化應(yīng)激和代謝功能損傷，這些均可以提高α-突觸核蛋白聚集傾向[15]。A30P突變通過破壞α-突觸核蛋白與突觸小泡和脂筏的相互作用，導(dǎo)致α-突觸核蛋白遠(yuǎn)離突觸前神經(jīng)終端，脂質(zhì)膜結(jié)合缺陷，增強(qiáng)和加速α-突觸核蛋白的聚集并形成纖維[16]。E46K突變可能會導(dǎo)致與磷脂的結(jié)合增加，并增加纖維組裝速度[17]。

α-syn的SNCA基因三倍體突變可導(dǎo)致遺傳性早發(fā)性帕金森病癡呆，而SNCA二倍體突變也已經(jīng)在家族性帕金森病中被報道。SNCA二倍體類似原發(fā)性帕金森病，遲發(fā)性，進(jìn)展緩慢，少伴癡呆，相比之下，SNCA三倍體為早期發(fā)病，進(jìn)展迅速且多伴癡呆[18]。這些研究結(jié)果進(jìn)一步支持，PD表型的嚴(yán)重程度與α-syn基因超量拷貝數(shù)有直接的關(guān)系。

點突變或基因倍增的α-syn寡聚體生成速度均加快，α-syn中的NAC區(qū)易形成β片層，為纖維形成提供成核部位，加速α-syn聚集。

1.3α-突觸核蛋白的翻譯后修飾

1.3.1α-突觸核蛋白的磷酸化：幾乎所有的突觸核蛋白病中都可檢測到α-syn磷酸化水平的升高，在體內(nèi)可觀察到由酪蛋白激酶CK-1、CK-2介導(dǎo)的α-突觸核蛋白129位絲氨酸特異性和廣泛性的磷酸化[19]，提示廣泛的α-syn磷酸化可能是一個重要的致病事件，可能是包涵體形成的一個必要的步驟。突觸核蛋白病中超過90%的不溶性α-syn是磷酸化的，而正常α-syn中磷酸化的只有約4%，更加支持了這一假說。體外實驗也證實這種翻譯后磷酸化修飾的蛋白質(zhì)體可促進(jìn)纖維的形成。這個位點的α-突觸核蛋白磷酸化是受到生理刺激，包括應(yīng)激，特別是增加紋狀體刺激后產(chǎn)生[20]，這暗示選擇性紋狀體刺激敏感性可能在突觸核蛋白病發(fā)病機(jī)制中起作用。

PD中的α-突觸核蛋白磷酸化局限于顳葉，而在DLB中更為廣泛，影響額葉和頂枕葉。在突觸核蛋白病的轉(zhuǎn)基因動物模型，α-突觸核蛋白基因突變體出現(xiàn)更大程度的磷酸化，尤其是A53T突變體，其次是A30P突變體，更進(jìn)一步提示α-syn的廣泛磷酸化可能促進(jìn)蛋白的聚集。

α-突觸核蛋白125位酪氨酸殘基可以被酪氨酸蛋白激酶Src家族，包括Src、Fyn以及p72syk磷酸化[21]。由于一些激酶的磷酸化作用(如Fyn)參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的過程，在細(xì)胞分化、生存和可塑性中起作用，可能為磷酸化α-突觸核蛋白參與了這些神經(jīng)細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

1.3.2α-突觸核蛋白的硝化：硝化是另一個與α-突觸核蛋白聚集相關(guān)的修飾，對α-突觸核蛋白酪氨酸殘基的硝化是也通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的[22]。對α-突觸核蛋白125位的酪氨酸殘基的硝化易導(dǎo)致α-突觸核蛋白二聚化，而對39位酪氨酸殘基的硝化導(dǎo)致脂質(zhì)囊泡的結(jié)合減少，從而提高α-突觸核蛋白分子的聚合能力。

1.3.3α-突觸核蛋白的泛素化：突觸核蛋白病中，蛋白包涵體可與抗泛素抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，提示其中的α-syn蛋白被泛素化修飾[23]。包涵體中α-syn蛋白的泛素化形式是單-泛素化和寡-泛素化的形式，而不是與蛋白酶體降解相關(guān)聯(lián)的多泛素化形式，提示α-syn的泛素化修飾可能也在其聚集過程中起一定作用。

2突觸核蛋白病中α-突觸核蛋白異構(gòu)體播散的機(jī)制

為了使一種致病物質(zhì)從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞，并損傷受體細(xì)胞，病原體必須離開宿主細(xì)胞，到達(dá)受體細(xì)胞后，病原體必須穿過細(xì)胞膜以進(jìn)入細(xì)胞，才能引起細(xì)胞應(yīng)激或損傷受體細(xì)胞。研究表明，α-syn能夠完成上面列出的所有步驟，因此可以從一個細(xì)胞傳播到另一個細(xì)胞，遍及整個神經(jīng)系統(tǒng)。根據(jù)Braak等對不同病程PD患者的研究發(fā)現(xiàn)，在PD的不同病程階段，α-突觸核蛋白按照特定的順序在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)播散，為 α-syn在神經(jīng)系統(tǒng)中通過朊蛋白樣作用機(jī)制播散而導(dǎo)致發(fā)病的假說提供了一定理論依據(jù)。

2.1神經(jīng)元釋放α-突觸核蛋白的機(jī)制α-syn可以通過胞吐作用離開細(xì)胞。最初，我們發(fā)現(xiàn)，在腦脊液、血漿、唾液[24]中可檢測出來多種形式的α-syn，提示存在一種分泌過程。過表達(dá)α-syn的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和大鼠原代皮層元可分泌出單體和聚合形式的α-突觸核蛋白，并且這種分泌過程被低溫抑制，提示此過程為胞吐作用[25]。α-syn可定位到腔內(nèi)囊泡中，進(jìn)一步支持了胞吐的作用，而經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體依賴途徑可能不參與此過程。細(xì)胞應(yīng)激，如血清剝奪、溶酶體酶抑制劑和過氧化氫等，可促進(jìn)囊泡對α-syn的轉(zhuǎn)移和隨后的釋放。囊泡中獲得的α-syn比細(xì)胞中形成的α-syn顯示更多的氧化修飾，表明神經(jīng)元優(yōu)先釋放受損、有聚集傾向的α-syn[25]。

外泌體(exosomes)可能是突觸蛋白病中α-syn由細(xì)胞釋放的另一個途徑。外泌體是一種直徑為30～100 nm的小囊泡，起源于細(xì)胞內(nèi)吞系統(tǒng)的晚期胞內(nèi)體，可包含部分細(xì)胞漿，與細(xì)胞膜相融合釋放到細(xì)胞外。在其他神經(jīng)退行性疾病中，已經(jīng)證明其能夠傳播致病的朊蛋白、β-淀粉樣蛋白聚集體和磷酸化tau蛋白。研究，已發(fā)現(xiàn)，含有α-syn的外泌體可被神經(jīng)元細(xì)胞釋放至細(xì)胞間隙，并被其他神經(jīng)元攝取，并在其內(nèi)形成陽性包涵體[26]。研究表明，包含α-突觸核蛋白的外泌體的分泌依賴于鈣離子的刺激。這種蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移過程可被囊泡外膜保護(hù)以免于胞外酶的損害。如果沒有外泌體外膜的保護(hù)，蛋白被降解的風(fēng)險將明顯增加，已經(jīng)證實基質(zhì)金屬蛋白酶3可降解重組α-syn 和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分泌的α-syn[27]。另外，死亡細(xì)胞的裂解并排出其內(nèi)容物到細(xì)胞外空間可能導(dǎo)致不可控制的α-syn釋放。

2.2神經(jīng)元攝取α-突觸核蛋白的機(jī)制α-syn已被證明可直接與脂類和細(xì)胞膜反應(yīng)。因此，細(xì)胞外α-syn蛋白能夠直接與細(xì)胞外膜聯(lián)系反應(yīng)并相結(jié)合[28]。最簡單的方式是單體α-syn被動擴(kuò)散通過細(xì)胞膜，這個過程對低溫和內(nèi)吞作用的抑制不敏感，由于α-syn存在特別的疏水特性，此過程很可能僅被少量胞外蛋白限制。另外，結(jié)合到細(xì)胞膜外部的脂質(zhì)或蛋白質(zhì)的α-syn蛋白也可以通過膜蛋白的持續(xù)更新以非特異性的方式進(jìn)入細(xì)胞。在HeLa細(xì)胞和酵母中，α-syn可與脂筏連接，脂筏處的蛋白質(zhì)和脂類亞群較集中，從而在細(xì)胞表面產(chǎn)生信號平臺[29]。α-syn與脂筏中的一個重要組成部分——神經(jīng)節(jié)苷脂GM1的反應(yīng)，調(diào)節(jié)α-syn募集到這些結(jié)構(gòu)[30]。神經(jīng)元細(xì)胞這種脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞作用可調(diào)節(jié)原代神經(jīng)原細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞對細(xì)胞外α-syn的內(nèi)化。

而細(xì)胞對低聚和纖維狀α-syn的攝取與單體的α-syn不同，通過更經(jīng)典的內(nèi)吞過程進(jìn)入細(xì)胞。對寡聚體和纖維狀的α-syn的攝取過程可被低溫和動力抑制劑減弱，使用胰蛋白酶處理細(xì)胞表面，以去除潛在的內(nèi)吞受體蛋白，可抑制α-syn的吸收[31]。細(xì)胞外α-syn增多時，細(xì)胞攝取α-syn的能力可能增強(qiáng)，因為其可以通過攝入α-syn并將其降解掉以減少潛在的細(xì)胞外α-syn負(fù)荷的毒性。但只有當(dāng)細(xì)胞處于健康狀態(tài)以足夠降解和清除致病性蛋白時，這種吸收和降解機(jī)制才能有效地工作，而一旦細(xì)胞受損，不足以清除α-syn蛋白時，導(dǎo)致其在細(xì)胞中聚集而致病。

如前所述，α-syn可通過外泌體釋放到細(xì)胞間隙，在細(xì)胞間轉(zhuǎn)運，并可通過內(nèi)吞作用、受體-配體結(jié)合或與其他細(xì)胞的外膜融合等方式，將其內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到新的細(xì)胞中，不但能夠介導(dǎo)遠(yuǎn)距離的α-syn的轉(zhuǎn)運，還可介導(dǎo)其他蛋白質(zhì)、mRNA及micRNA等的轉(zhuǎn)運，是細(xì)胞間通信的有效途徑。

隧道納米管(TNTs)也可參與α-syn的傳播。隧道納米管存在于哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，是細(xì)胞間介導(dǎo)細(xì)胞訊息傳遞的一種線狀膜性管道，由細(xì)胞膜和以F-actin為主的細(xì)胞骨架成分構(gòu)成，處于形成和斷裂的動態(tài)持續(xù)變化狀態(tài)中，可以介導(dǎo)遠(yuǎn)距離的物質(zhì)交換和運輸，如小分子、細(xì)胞器和囊泡的交換。已證明TNTs能在小鼠神經(jīng)元間傳遞朊蛋白(PrPSc)，隨后研究發(fā)現(xiàn)，隧道納米管中存在α-syn[32]，提示α-syn也可通過TNTs被神經(jīng)元攝取，進(jìn)而在神經(jīng)元間播散。

另外，Braak假說提示存在遠(yuǎn)距離傳播α-syn的方式，軸突運輸可以參與錯誤折疊的α-syn不同腦區(qū)之間的轉(zhuǎn)移。α-syn沿軸突的順行或逆行運輸，主要通過軸突運輸?shù)穆煞?、?qū)動蛋白和動力蛋白介導(dǎo)，有助于α-syn沿軸突的雙向運動。另外，微流體培養(yǎng)系統(tǒng)證明α-syn可在軸突末梢釋放和攝取，提示跨突觸的細(xì)胞到細(xì)胞的傳輸。

3總結(jié)及展望

蛋白質(zhì)異常聚集仍然是研究神經(jīng)退行性疾病的重要主題，α-syn在細(xì)胞中的聚集和細(xì)胞間的播散是突觸核蛋白病發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)，其機(jī)制較復(fù)雜，到現(xiàn)在仍未完全清楚，了解其分子機(jī)制有助于對此類疾病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)一步的認(rèn)識。更重要的是，可能根據(jù)其聚集及播散路徑研發(fā)針對性的治療方案，如靶向細(xì)胞外α-syn的免疫治療可導(dǎo)致免疫系統(tǒng)對細(xì)胞外傳播的α-syn種子的去除，可能延緩α-syn在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的播散。另外，對α-syn聚集體的特異性抑制劑的研究可能有重要意義，體外實驗證實，特異性結(jié)合α-syn負(fù)責(zé)自身聚集的區(qū)域的短肽可阻止試管中α-syn的寡聚化和纖維化[33]。由此看來，對α-syn聚集播散機(jī)制及其影響因素的研究可為疾病的預(yù)防及治療提供更有效的方法與建議，以延緩疾病的進(jìn)展。

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(收稿2015-04-15 修回2015-12-20)

【中圖分類號】R741

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)04-0077-03

通訊作者：△滕軍放，主任醫(yī)師、教授、碩士及博士生導(dǎo)師，鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院綜合醫(yī)學(xué)部主任，神經(jīng)內(nèi)二科主任，中國醫(yī)師協(xié)會河南分會神經(jīng)內(nèi)科專業(yè)協(xié)會會長，E-mail：tjf.6666@yahoo.com.cn