浙江省非小細(xì)胞肺癌血液EGFR基因突變檢測專家共識

浙江省抗癌協(xié)會抗癌藥物專業(yè)委員會專家組

●專家解讀

浙江省非小細(xì)胞肺癌血液EGFR基因突變檢測專家共識

浙江省抗癌協(xié)會抗癌藥物專業(yè)委員會專家組

肺癌是目前我國發(fā)病率及死亡率最高的腫瘤，早期診斷、精準(zhǔn)治療、監(jiān)測復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，對提高肺癌的整體治療水平和治療效果尤為重要。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）約占所有肺癌的80%～85%，以表皮生長因子受體（EGFR）為靶點(diǎn)的小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI）為晚期NSCLC的治療帶來了新的曙光；而EGFR基因突變狀態(tài)是決定EGFR-TKI療效最重要的預(yù)測因子，檢測EGFR基因的突變狀態(tài)是決定患者是否能夠應(yīng)用EGFR-TKI治療的先決條件[1]。

腫瘤組織樣本（手術(shù)、活檢、細(xì)胞蠟塊）是檢測晚期NSCLC EGFR突變狀態(tài)最適合的樣本來源。然而并非所有患者都能提供足夠的組織樣本，可通過經(jīng)支氣管鏡、經(jīng)皮肺穿刺活檢或胸腔積液標(biāo)本來進(jìn)行突變檢測，但仍不能覆蓋所有晚期患者[2-3]。在IFUM研究中，僅19%的入組患者能夠到檢測腫瘤EGFR突變狀態(tài)，無法檢測的原因包括：無法活檢，腫瘤組織樣本的質(zhì)量不合格或所含腫瘤細(xì)胞數(shù)量不夠等[4]；組織標(biāo)本存在空間和時間的異質(zhì)性也給腫瘤基因的精準(zhǔn)檢測帶來了極大的挑戰(zhàn)。而近年來的研究顯示存在于外周血中的游離腫瘤DNA（ctDNA）與腫瘤組織基因組DNA具有極為相似的遺傳學(xué)特性[5-6]，且在腫瘤患者中外周血ctDNA含量顯著高于健康人群。數(shù)據(jù)顯示血液EGFR檢測水平已經(jīng)接近組織檢測的水平，配對樣本檢測一致性在60%～95%之間[7]。2014年9月歐洲藥品管理局已批準(zhǔn)可采用ctDNA標(biāo)本來評估EGFR突變狀態(tài)。中國國家食品藥品監(jiān)督管理局（CFDA）在2015年2月也已批準(zhǔn)Gefitinib說明書更新，在推薦所有NSCLC患者的腫瘤組織都應(yīng)進(jìn)行EGFR突變檢測基礎(chǔ)上，補(bǔ)充了如果腫瘤標(biāo)本不可評估，則可使用從血液（血漿）標(biāo)本中獲得的ctDNA。

血液ctDNA EGFR檢測具有無創(chuàng)、便捷、實(shí)時可獲取的特點(diǎn)能在一定程度上幫助解決組織樣本量不足、異質(zhì)性及反復(fù)動態(tài)活檢的問題。但目前血液ctDNA EGFR檢測尚存在臨床應(yīng)用范圍、適用人群、檢測方法等方面標(biāo)準(zhǔn)的不統(tǒng)一，如何有效合理的應(yīng)用血液EGFR檢測已成為臨床上亟待解決的問題。2015年5月，浙江省抗癌協(xié)會抗癌藥物專業(yè)委員會在杭州組織我省相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜曳磸?fù)討論了針對目前血液檢測臨床應(yīng)用的幾個重點(diǎn)問題，并就浙江省NSCLC血液EGFR基因突變檢測的每個問題逐一討論并形成共識，具體如下：

1 哪一種方法更加適合血液樣本的EGFR檢測？

目前已有許多血液EGFR基因突變檢測方法的報(bào)道，如高分辨熔點(diǎn)曲線分析法（HRM）、變性高效液相色譜技術(shù)（DHPLC）、突變擴(kuò)增阻遏系統(tǒng)（ARMS法）、數(shù)字PCR方法等[8-10]。不同血漿游離核酸EGFR檢測方法各有優(yōu)勢和劣勢。

HRM利用不同長度DNA序列具備不同溶解曲線特性，擴(kuò)增后直接運(yùn)行高分辨溶解完成對樣本的突變分析，操作簡單。然而其只能分析純度單一的小片段DNA，并要求有足夠的PCR模板才能得到穩(wěn)定可靠的結(jié)果。DHPLC基于發(fā)生錯配的雜合與完全匹配的純合雙鏈DNA解鏈特征差異分離。但DHPLC不能檢測突變類型，結(jié)果判讀容易出錯，并且多個檢測步驟增加了工作量[11]。數(shù)字PCR在血漿EGFR突變檢測上具有較高的靈敏度和特異度[12-13]，但目前報(bào)道的該方法檢測EGFR突變位點(diǎn)相對有限（19外顯子缺失，21號外顯子L858R突變以及20號外顯子T790M突變），仍處在摸索、累積經(jīng)驗(yàn)階段；其對操作人員和環(huán)境均有較高的要求，未來應(yīng)用于臨床尚需大規(guī)模臨床數(shù)據(jù)驗(yàn)證。以二代測序技術(shù)（NGS）為代表的新技術(shù)擴(kuò)展了基因突變檢測的深度和廣度[14]，但其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用更需要海量數(shù)據(jù)積累。

目前成熟且常用檢測血液EGFR基因突變的方法是ARMS法，相比于腫瘤組織EGFR檢測，該方法檢測血漿EGFR敏感型突變的靈敏度在65%～88%，特異度在90%～100%[15-17]。

專家組推薦：檢測基因突變常用的方法是ARMS法，歐盟批準(zhǔn)用于指導(dǎo)Gefitinib治療的血液檢測方法也是ARMS檢測方法[15-17]。檢測方法必需都進(jìn)行嚴(yán)格的驗(yàn)證及質(zhì)控，檢測試劑須使用經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)的檢測試劑盒。

2 血液EGFR檢測能否替代組織樣本，還是作為一個補(bǔ)充方案？

2.1 血液檢測與組織檢測的一致性 IFUM研究中ctDNA標(biāo)本檢測EGFR突變的高特異度（99.8%）和高靈敏度（65.7%）支持ctDNA可作為NSCLC患者EGFR基因突變檢測的樣本[16]。因此，歐洲藥品管理局2014年9月已批準(zhǔn)可采用ctDNA標(biāo)本評估EGFR突變狀態(tài)，進(jìn)而鑒別出最可能從EGFR-TKI治療中受益的NSCLC患者[18]。Liu等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，與組織樣本相比，血漿EGFR基因突變檢測靈敏度為67.5%，特異度為100%；同時，方法學(xué)比較顯示ARMS方法是檢測血漿中EGFR基因突變的最佳方法，該數(shù)據(jù)與IFUM研究結(jié)果一致。因此，中國國家食品藥品監(jiān)督管理局在2015年2月已批準(zhǔn)Gefitinib說明書更新。IGNITE研究表明幾乎一半的組織陽性患者血漿中可以直接檢測到EGFR突變，NSCLC患者血漿中EGFR突變率腺癌為26.3%，非腺癌為6.9%[19]。

2.2 血液EGFR突變狀況與臨床療效 IPASS研究中日本亞組人群血清ctDNA EGFR突變狀況（ARMS法）與臨床療效的研究數(shù)據(jù)提示，血清ctDNA EGFR突變陽性的患者接受Gefitinib治療較標(biāo)準(zhǔn)化療的無進(jìn)展生存時間（PFS）顯著延長（HR 0.29）[17]。歐洲IFUM研究也提供了在高加索人群基于血漿ctDNA EGFR突變陽性的NSCLC患者（ARMS法）接受Gefitinib治療的療效證據(jù)，在腫瘤組織陽性，腫瘤組織和血漿標(biāo)本均陽性及腫瘤組織陽性而血漿標(biāo)本陰性3組中，其客觀緩解率分別為70%、76.9%、59.5%[16]。在FASTACT2研究中，血漿EGFR突變患者接受Erlotinib與化療聯(lián)合治療的客觀緩解率（74.6%、19.7%）和PFS（HR 0.21）均優(yōu)于單純化療組[20]。國內(nèi)一項(xiàng)230例晚期NSCLC患者的臨床觀察[21]及其他多項(xiàng)臨床研究都顯示血液標(biāo)本的EGFR突變對于預(yù)測靶向藥物治療的臨床獲益與組織突變者高度一致。

專家組推薦：雖然血液檢測與組織樣本檢測一致性在60%～95%之間，血液EGFR檢測靈敏度尚有提升的空間，組織樣本檢測仍然是金標(biāo)準(zhǔn)。血液檢測用于篩選EGFR-TKI適治患者是重要補(bǔ)充，特別是對于沒有合適組織標(biāo)本供突變檢測的患者，可作為組織檢測的補(bǔ)充[16]。

3 EGFR血液檢測適用于哪些NSCLC患者？

血漿游離DNA在腫瘤患者中的含量高于健康人，這為血液檢測奠定了基礎(chǔ)，Wang等[22]研究發(fā)現(xiàn)NSCLC和健康對照外周血中游離DNA含量分別為5.82ng/μl和4.37ng/μl（P＜0.001）。但并非是所有患者都適用于血液EGFR檢測，不同疾病分期患者的血液ctDNA含量是不同的。Bettegowda等[23]比較了不同期別腫瘤中ctDNA的檢出率，結(jié)果顯示Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分別為47%、55%、69%和82%，相關(guān)系數(shù)0.337，這說明ctDNA含量與腫瘤分期相關(guān)。而EGFR的豐度只有在ctDNA達(dá)到一定檢出限時才可以被檢測到，在Ⅲ期以下的患者檢測的靈敏度不高，因此最為適合的是Ⅲ～Ⅳ期患者。

血液檢測可動態(tài)監(jiān)測EGFR基因突變的變化，特別是耐藥突變的出現(xiàn)；Oxnard等[12]用數(shù)字PCR檢測NSCLC患者血漿T790M突變，檢測靈敏度為0.5%～0.05%，特異度為100%，可在影像學(xué)進(jìn)展前16周檢測出血漿T790M突變，并且與19號外顯子缺失突變量呈平行的變化關(guān)系。今年ASCO上Zheng等[24]報(bào)道了EGFR-TKI治療后耐藥的NSCLC患者外周血ctDNA中T790M突變的檢出率為47%，血液T790M的發(fā)現(xiàn)比臨床進(jìn)展提前了中位時間2.2個月。另外，今年ASCO上一項(xiàng)Rociletinib（Co-1686）治療血漿T790M陽性患者療效的研究顯示血液T790M檢測與組織檢測一致性達(dá)到81%，具有良好的靈敏度與特異度。血漿T790M陽性和陰性患者的ORR為53%、39%，無論是血漿T790M陽性還是組織陽性O(shè)RR均為53%，進(jìn)一步驗(yàn)證了血液檢測的穩(wěn)定性[25]。

專家組推薦：初治患者方面，一般篩選條件是較晚期的，最好Ⅲ期以上，鑒于組織檢測為金標(biāo)準(zhǔn)，考慮無組織標(biāo)本情況下再選擇血液檢測。對于經(jīng)治患者（或復(fù)發(fā)、PD），由于原先的組織樣本或前期的EGFR檢測結(jié)果對經(jīng)治后的腫瘤分子病理狀態(tài)缺少實(shí)時參考意義，且很難再取標(biāo)本，即可選擇血液檢測，為患者爭取機(jī)會。早期患者，由于EGFR豐度低以及考慮現(xiàn)有的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，不推薦血液EGFR檢測。但在早期監(jiān)測耐藥突變等臨床研究中，可考慮血液EGFR檢測。

4 血液EGFR檢測的樣本收集和DNA提取

全血中血漿和血清均能分離出ctDNA，但通過和相匹配的血清樣本比較，血漿中EGFR有更高的檢出率[26]。血漿ctDNA通常片段較短，且在血液中濃度通常非常低[27-28]。抽血后延遲血漿分離會導(dǎo)致血細(xì)胞裂解，釋放出基因組DNA（gDNA）至血漿中；大量增加的gDNA會稀釋腫瘤來源的ctDNA，使得突變難以檢出[29]。因此在標(biāo)本的采集、運(yùn)輸及儲存過程中，防止游離DNA的降解是首要考慮的因素；其次，也應(yīng)防止血液中白細(xì)胞的裂解，避免因野生型DNA背景的增加導(dǎo)致ctDNA中的突變DNA無法檢測出。

專家組推薦：為了采集到最佳血漿標(biāo)本用于后續(xù)提取游離DNA及EGFR突變檢測，建議使用如下兩種方法之一采集10ml全血并進(jìn)一步分離血漿：（1）用含有游離DNA保護(hù)劑及防細(xì)胞裂解保護(hù)劑的專用常溫采血管采集全血后輕搖混勻，常溫（6～30℃）放置不超過5～7d；以足夠的離心力將全血充分離心2次，從而分離出不含細(xì)胞成分的血漿，放置于-70℃凍存直至DNA抽提，或直接進(jìn)入DNA抽提步驟。（2）建議用常規(guī)EDTA抗凝管（嚴(yán)禁使用肝素抗凝管）采集全血后，2h內(nèi)以足夠的離心力將全血充分低溫離心兩次[29-30]，分離出不含細(xì)胞成分的血漿，放置-70℃凍存直至DNA抽提，或直接進(jìn)入DNA抽提步驟。為保證ctDNA濃度，建議使用10ml全血分離出的血漿（4～5ml）。ctDNA的提取有很多方法，建議采用國家藥監(jiān)部門批準(zhǔn)的、大容量血漿游離DNA分離試劑盒。

5 EGFR突變檢測質(zhì)控及報(bào)告

為保證檢測結(jié)果的可靠性與報(bào)告的及時性，專家組推薦：EGFR基因突變的檢測須在符合臨床核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)開展，進(jìn)行檢測的操作人員必須是接受過培訓(xùn)且技能熟練的工作人員，持PCR培訓(xùn)合格證上崗，同時需要有質(zhì)量控制和質(zhì)量保證人員進(jìn)行質(zhì)控和監(jiān)督，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。為及時滿足臨床診治需求，建議各分子檢測實(shí)驗(yàn)室從接收標(biāo)本到發(fā)出報(bào)告周期控制在5個工作日以內(nèi)。

血液EGFR檢測的臨床應(yīng)用將會對NSCLC臨床診療策略帶來影響：（1）很多患者無法檢測，初期無法進(jìn)行靶向治療。血液檢測可以擴(kuò)大受益人群，給患者一個受益的機(jī)會。（2）縮短診斷周期：專業(yè)化EGFR分子檢測實(shí)驗(yàn)室，通過建立高效率的分子檢測平臺，優(yōu)化流程，從接收標(biāo)本到發(fā)出報(bào)告周期，建議不超過5個工作日，以及時滿足臨床需求。血液檢測由于其便捷性，診斷周期或可縮短，利于臨床及時制定治療方案。（3）NSCLC患者在TKI治療過程當(dāng)中會發(fā)生耐藥，不少文獻(xiàn)報(bào)道甚至有多次藥物敏感、耐藥交替出現(xiàn)[31]。檢測不同時間的EGFR突變狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)各個時期不同的突變狀態(tài)，進(jìn)行藥物靈敏度的預(yù)測，及時使用合適的藥物。腫瘤不同時期、治療的不同階段，利用便捷的血液檢測，動態(tài)監(jiān)測突變狀態(tài)，調(diào)整治療方案，合適的時間將合適藥物用在合適的患者身上，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療，意義重大。

6 小結(jié)

液體活檢入選2015年十大突破技術(shù)，腫瘤細(xì)胞在凋亡、壞死過程中，會釋放腫瘤DNA至血液中，成為血液用于腫瘤個體化診斷的理論基礎(chǔ)。血液檢測用于篩選EGFR-TKI適治患者是重要補(bǔ)充，特別對于沒有合適組織標(biāo)本供突變檢測的患者，可作為組織檢測的補(bǔ)充[16]；血液檢測可動態(tài)監(jiān)測腫瘤標(biāo)志物變化，特別是耐藥突變的出現(xiàn)[12]；血液檢測用于晚期NSCLC有望實(shí)現(xiàn)，但對于早期NSCLC有待檢測技術(shù)不斷的發(fā)展和進(jìn)步。

對于ctDNA，基于ARMS平臺優(yōu)化后的方法已有較為成熟的步驟應(yīng)用于臨床服務(wù)；而具有高靈敏度的數(shù)字PCR方法目前檢測EGFR突變位點(diǎn)相對有限（19外顯子缺失，21號外顯子L858R突變以及20號外顯子T790M突變）[12-13]。以二代測序技術(shù)（NGS）為代表的新技術(shù)擴(kuò)展了基因突變檢測的深度和廣度[14]，但其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用更需要海量數(shù)據(jù)積累。在未來，期待通過多元化基因檢測平臺及技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，血液EGFR基因突變檢測可實(shí)現(xiàn)從定性到定量檢測、從靜態(tài)至動態(tài)檢測、從單基因到多基因、基因組/外顯子組檢測，從而推動NSCLC精準(zhǔn)靶向治療的不斷進(jìn)步。

浙江省非小細(xì)胞肺癌血液EGFR基因突變檢測專家共識，是在浙江省抗癌協(xié)會抗癌藥物專業(yè)委員會的倡導(dǎo)下，從臨床檢測的角度出發(fā)，結(jié)合我國肺癌患者（約占全球1/3）眾多的現(xiàn)狀，綜合最新的研究數(shù)據(jù)和CFDA批準(zhǔn)的藥物和伴隨診斷方法，供臨床實(shí)踐參考。本專家共識將根據(jù)實(shí)際情況定期更新，期望能為未來進(jìn)一步優(yōu)化EGFR陽性肺癌患者的診斷和治療提供指導(dǎo)。

本版共識專家組成員（按姓氏排序）：陳恩國，浙江大學(xué)附屬邵逸夫醫(yī)院呼吸內(nèi)科；鄧清華，杭州市腫瘤醫(yī)院放療科；胡煒，臺州市中心醫(yī)院放療科；江洪，杭州市第一人民醫(yī)院胸外科；林能明：杭州市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部；盧麗琴，浙江省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科；馬勝林，杭州市第一人民醫(yī)院腫瘤科；潘月龍，杭州市腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科；沈韋羽，寧波醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院胸外科；王利民，杭州市第一人民醫(yī)院呼吸科；王建芳，紹興市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科；謝聰穎，溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放化療科；徐如君，杭州市第一人民醫(yī)院病理科；許頌霄，浙江大學(xué)附屬邵逸夫醫(yī)院病理科；夏冰，杭州市腫瘤醫(yī)院MDT中心；楊新妹，嘉興市第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科；周建英，浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科；張沂平，浙江省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科；趙瓊，浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院肺移植及胸部腫瘤科；張仕蓉，杭州市第一人民醫(yī)院杭州市轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心

執(zhí)筆：張仕蓉（E-mail:shirley4444@gmail.com），馬勝林（E-mail:mashenglin@medmail.com.cn）

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2015-11-25）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

馬勝林，杭州市第一人民醫(yī)院，E-mail：mashenglin@ medmail.com.cn