腫瘤壞死因子-α調節(jié)外周血T細胞在動脈粥樣硬化的臨床研究

李凱 李楠

·實驗研究·

腫瘤壞死因子-α調節(jié)外周血T細胞在動脈粥樣硬化的臨床研究

李凱 李楠

目的研究分析主動脈腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和外周血自然調節(jié)T細胞在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用,探討其免疫調節(jié)機制。方法60只健康雄性4周齡SD大鼠,隨機分為早期動脈粥樣硬化組(早期組)、晚期動脈粥樣硬化組(晚期組)和健康對照組,各20只。采用腹腔注射維生素D3針劑6×105IU/kg聯(lián)合高脂高糖飲食建立大鼠動脈粥樣硬化模型,其中早期組高脂高糖喂養(yǎng)時間為8周,晚期組為16周。于喂養(yǎng)結束時,腹主動脈采血,以流式細胞儀檢測CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例。大鼠脫頸處死,取主動脈根部做病理切片,并以免疫組化檢測TNF-α表達。結果早期組大鼠CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例為(1.22±0.34)%,晚期組為(2.62±0.47)%,對照組為(2.65±0.52)%。早期組大鼠CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例低于對照組和晚期組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。晚期組大鼠于主動脈根部可見粥樣硬化,早期組可見纖維斑塊,而對照組未見斑塊形成。早期組大鼠主動脈TNF-α表達水平與晚期組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),但均顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結論動脈粥樣硬化不同時期外周血自然調節(jié)T細胞比例的差異可能與主動脈TNF-α的調節(jié)作用有關。

動脈粥樣硬化；自然調節(jié)性T細胞；腫瘤壞死因子-α；大鼠

動脈粥樣硬化主要以脂質代謝異常為病變基礎,是心腦血管病變的主要原因［1］。動脈粥樣硬化的產生是動脈內膜的一個慢性炎癥過程,受累動脈病變從內膜開始,逐步發(fā)生復合糖類和脂質積聚、血栓形成、出血,最終纖維組織增生［2］。目前認為,動脈硬化的炎性病變過程受機體免疫調節(jié)作用主導。CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞是自然調節(jié)性T細胞的關鍵組成部分,其在胸腺中產生,對抑制自身免疫反應和維持機體免疫穩(wěn)態(tài)有重要作用［3,4］,也是一種重要的免疫抑制細胞。而TNF-α具有免疫抑制和促炎雙重效應,是一種多效性細胞因子,其生物學功能由TNF-α受體1和受體2介導,可對自然調節(jié)T細胞進行調節(jié),進而可能在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中具有一定作用。本文即對其免疫調節(jié)作用進行探討。

1 材料與方法

1.1材料 選取健康雄性4周齡SD大鼠60只,購自河南省實驗動物中心,平均體重(200.0±10.0)g。適應性喂養(yǎng)1周后,將動物隨機分為早期動脈粥樣硬化組(早期組)、晚期動脈粥樣硬化組(晚期組)和健康對照組,每組20只。于濕度55%、室溫22℃條件下按組分籠飼養(yǎng),并給予充足飲食、自然光照。

1.2實驗儀器 無損傷流式細胞儀購自日本On-chip 公司,圖像分析系統(tǒng)購自江蘇世泰實驗器材有限公司,萊卡刀片(LEICA 819)購自德國Leica公司,HD-300系列生物組織智能脫水機購自湖北慧達儀器有限公司,全自動快速立式洗板機購自基波科技,-80℃超低溫冰箱購自新飛公司,GS-3001D型空氣加濕器購自珠海格力電器集團,LD5-2A低速離心機購自北京雷勃爾離心機有限公司。

1.3試劑藥品 丙基硫氧嘧啶片購自北京飛鶴藥業(yè)公司,維生素D3注射液購自哈藥集團制藥三廠,淋巴細胞分離液購自上海凱創(chuàng)生物技術有限公司,抗鼠CD4FITC、抗鼠CD25PE、抗鼠Foxp3APC購自南京建成生物技術研究所,兔抗人、大鼠、小鼠TNF-α多克隆一抗購自北京索萊寶科技有限公司,即用型SABC-POD(兔IgG)試劑盒購自生興生物技術(南京)有限公司。

1.4實驗造模 早期組和晚期組大鼠給予腹腔注射維生素D3針劑,劑量6×105IU/kg。同時給予高脂高糖飼料：76.3%基礎飼料、10%豬油、5%蛋黃粉、5%白糖、3%膽固醇、0.5%豬膽鹽、0.2%丙基硫氧嘧啶。飼養(yǎng)時間：早期組喂養(yǎng)時間為8周,晚期組為16周。并于飼養(yǎng)第1、2、3周各腹腔補充注射維生素D3針劑1×105IU/kg。對照組給予普通飼料喂養(yǎng)。

1.5標本采集 其中于喂養(yǎng)結束時,腹主動脈采血置于抗凝管,以流式細胞儀檢測CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例。大鼠脫頸處死,取主動脈根部做病理切片,并以免疫組化檢測TNF-α表達。

1.6流式細胞儀檢測方法 取1.5 ml血液標本+1.5 ml 磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋并吹打均勻,然后取3 ml淋巴細胞分離液置于15 ml離心管,并將上述稀釋液沿管壁緩慢加入。離心,1500 r/min,20 min。取淋巴細胞層,加等量PBS,離心,1000 r/min,4 min,取沉淀。以移液器加入抗鼠CD4FITC、抗鼠CD25PE4 μl,室溫避光20 min后,加固定/破膜液,置于4℃冰箱孵育30 min。再次加入2 ml破膜緩沖液,離心,1000 r/min,4 min,棄上清液。加4 μl抗鼠Foxp3APC,充分混勻,室溫環(huán)境下孵育30 min。離心,1000 r/min,4 min,棄上清液,流式細胞儀分析。

1.7HE染色和免疫組化 HE染色：取各組大鼠主動脈根部標本,石蠟包埋,超薄切片,二甲苯5-10 min脫蠟、水化,行HE染色,光鏡下觀察標本形態(tài)變化。免疫組化：全自動生物組織石蠟包埋機及石蠟組織切片機分別給予包埋、切片,厚度為4 μm。二甲苯5～10 min脫臘。l00%乙醇2 min→90%乙醇2 min→80%乙醇2 min→70%乙醇2 min降梯度脫水。蒸餾水洗去乙醇,10 min以脫水。3%H2O2室溫孵育10 min,加5% BSA封閉液,枸櫞酸鹽緩沖液抗原熱修復2 min。將兔抗人、大鼠、小鼠TNF-α多克隆一抗1：50稀釋加入,4℃過夜。標記山羊抗兔IgG,室溫環(huán)境下孵育30 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)測定平均灰度值。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件進行數據統(tǒng)計分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示,采用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1流式細胞儀檢測結果 早期組大鼠CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例為(1.22±0.34)%,晚期組為(2.62±0.47)%,對照組為(2.65±0.52)%。早期組大鼠CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例低于對照組和晚期組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),對照組與晚期組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.2HE染色及免疫組化 HE染色：光鏡下早期組主動脈可見隆起于動脈內膜表面的斑塊形成,處于纖維斑塊期,此為早期斑塊,表層為纖維結締組織。晚期組可見肌纖維崩解壞死產物及纖維帽下脂質增多,為粥樣斑塊期。對照組大鼠主動脈內膜光滑,未見斑塊。TNF-α表達：早期組TNF-α平均灰度值為(89.53±5.83),晚期組為(92.42±4.96),對照組為(158.56±9.75)。早期組大鼠主動脈TNF-α表達水平與晚期組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),但均顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3 討論

動脈粥樣硬化是動脈內膜的一個慢性炎癥過程,機體的免疫調節(jié)機制可能在其發(fā)生發(fā)展過程中具有一定作用。TNF-α來源廣泛,平滑肌細胞、內皮細胞、各種免疫細胞以及成纖維細胞等均可產生。TNF-α與機體的炎性反應有關,其表達上調被認為是炎癥反應的基準。自然調節(jié)T細胞可減弱樹突細胞抗原提呈作用,并抑制Th1/Th17介導的炎癥反應,進而具有抗動脈粥樣硬化的作用［5］。根據自然調節(jié)T細胞來源,可將其分為誘導性調節(jié)性T 細胞和n調節(jié)性T 細胞。當TNF-α作用于血管內皮細胞可引起一系列炎性反應,進而造成血管損傷和血栓形成［6］。目前發(fā)現,TNF-α可通過受體激活自然調節(jié)T細胞,調節(jié)炎性反應。

本研究顯示,早期組大鼠CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例低于對照組和晚期組(P＜0.05)。而在免疫組化和HE染色顯示,早期組處于纖維斑塊期,晚期組可見肌纖維崩解壞死產物及纖維帽下脂質增多,為粥樣斑塊期。對照組大鼠主動脈內膜光滑,未見斑塊。且早期組大鼠主動脈TNF-α表達水平與晚期組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),但均顯著高于對照組(P＜0.05)。結果顯示,動脈粥樣硬化早、晚期CD4+CD25+Foxp3+T細胞水平的變化可能與TNF-α調節(jié)有關。推測其機制可能為在動脈粥樣硬化病變早期,TNF-α作用下,自然調節(jié)T細胞對Teffs抑制活性減弱,進而引起Teffs明顯增殖,導致外周自然調節(jié)T細胞相對減少［7］。在病變晚期,TNF受體對保留自然調節(jié)T細胞對炎癥反應發(fā)揮負反饋調節(jié),引起外周血CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞比例升高,上述機制可抑制局部炎癥發(fā)展,為機體免疫調節(jié)的一種重要負反饋機制。

［1］李小林,王博遠,程偉寧,等.HSP60口服耐受誘導調節(jié)T細胞Foxp3去甲基化抑制動脈粥樣硬化.中國免疫學雜志,2016,32(5): 633-635,639.

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10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.17.191

2016-07-28］

454001 河南理工大學第一附屬醫(yī)院(焦作市第二人民醫(yī)院)檢驗科(李 凱)；鄭州大學第一附屬醫(yī)院檢驗科(李楠)