正交試驗法優(yōu)選真武湯的微波提取工藝

任　燕何興會.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川　成都　60075; .貴州大學(xué)，貴州　貴陽　55005

正交試驗法優(yōu)選真武湯的微波提取工藝

任燕1何興會2
1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都610075; 2.貴州大學(xué)，貴州貴陽550025

【摘要】目的:優(yōu)選出真武湯的微波提取最佳工藝.方法:采用微波提取方法，通過單因素實驗和正交實驗兩者結(jié)合考察了乙醇提取濃度、提取時間、微波火力、料液比對真武湯中芍藥苷得率的影響，從而優(yōu)選出最優(yōu)提取工藝.結(jié)果:真武湯提取工藝最佳條件為:乙醇濃度為60%，微波時間為3min，微波火力中高火，料液比為1∶10.結(jié)論:本研究將為真武湯的劑型開發(fā)等進一步研究奠定基礎(chǔ).

【關(guān)鍵詞】真武湯;芍藥苷;微波提取;正交實驗

Optimization Microwave Extracting Process of Zhenwu decoction by Orthogonal Test

REN Yan1，HE Xing－h(huán)ui2

1. Chengdu University of TCM，chengdu 610075，China; 2. Guizhou university，Guiyang 550025，China

Abstract:ObjectiveTo optimize the best microwave extraction process of Zhenwu decoction．MethodsUsing microwave extraction method and combining the single factor experiment with orthogonal experiment，explorating the effects of the ethanol concentration，extraction time，the extraction microwave power and material liquid ratio of Zhenwu decoction，through inspecting the quality of paeoniflorin in extracts of Zhenwu decoction，thus to select the optimum extraction method．ResultsZhenwu decoction extraction conditions were: ethanol concentration degree is 60%，the microwave time is 3 min，the high fire microwave firepower，the ratio of material to liquid is 1∶10．ConclusionThe experiment will lay the foundation for further study on dosage form development of Zhenwu decoction．

Key words:Zhenwu decoction; paeoniflorin; microwave extraction; orthogonal experiment

真武湯出自《傷寒論》，系張仲景針對少陰腎陽虧虛，氣不化水，水氣內(nèi)停而設(shè).全方由炮附子、白術(shù)、茯苓、生姜、芍藥等五味藥組成，具有扶陽抑陰、化氣行水的效果，適用于脾腎陽虛、水氣內(nèi)停等證，為溫陽利水之經(jīng)典方.后世醫(yī)家對本方進行了較為系統(tǒng)的研究，目前已突破了水病的范圍，用本方治療多個系統(tǒng)的疾病，如:慢性支氣管炎、肺氣腫、肺心病、風(fēng)心病、冠心病、充血性心力衰竭、慢性胃腸炎、肝硬化腹水、慢性腎炎、內(nèi)耳性眩暈、血栓閉塞性脈管炎等疾病，療效令人滿意.該方雖應(yīng)用很廣，但對該方的提取工藝還未見有研究，從而也制約該方的制劑開發(fā)，故本文通過單因素及正交試驗對真武湯的提取工藝作初步研究，以期能為開發(fā)該方新制劑奠定一定基礎(chǔ).

1　儀器和試劑

1. 1儀器WP700L17微波爐;電子天平(北京賽多利斯天平有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠); UV －VIS分光光度計(UV－2450，日本島津公司);高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司);數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海浦東光學(xué)儀器廠).

1. 2材料芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品鑒定所);所用試劑均為分析純;中藥材炮附子、白術(shù)、茯苓、芍藥購于貴陽市藥材公司，生姜購于菜市場;炮附子、白術(shù)、茯苓、芍藥用粉碎機粉碎得藥材粗顆粒;生姜切塊，備用.

2　方法

2. 1芍藥苷含量得率的測定方法

2. 1. 1標(biāo)準(zhǔn)品的制備精密稱取100℃干燥恒重的芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品4. 8mg于25ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得0. 1920mg/ml標(biāo)準(zhǔn)儲備液.精密量取0. 5、0. 7、0. 9、1. 1、1. 3、1. 5ml分別置于10ml容量瓶中，編號為1、2、3、4、5、6，加入甲醇定容至10ml，搖勻，甲醇做空白對照.

2. 1. 2芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將配制好的對照品溶液進行波長確定，選出最大波長，最后確定最大波長為230nm.在230nm波長處測定吸光度，以濃度對吸收值做線性回歸，得出回歸方程: Y =30. 007X－0. 0273，R2=0. 9994，其中X是芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，Y是吸光度值.

2. 1. 3供試品的制備準(zhǔn)確稱取按真武湯復(fù)方處方準(zhǔn)備好的藥材量的1/3(既茯苓3. 00g，芍藥3. 00g，生姜3. 00g，白術(shù)2. 00g，炮附子1. 40g)至250ml錐形瓶中，精密加入一定濃度的乙醇溶液后置微波爐中提取，冷卻后補足失去的乙醇量，濾過，精確量取一定濾液(V)，蒸發(fā)至近干，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，并定容至刻度，即得供試品溶液.

2. 1. 4芍藥苷得率測定取供試品溶液于230nm波長處測定吸光度值，然后帶入所得線性回歸方程中計算，即可得樣品中芍藥苷的濃度，經(jīng)進一步計算就得其得率.芍藥苷得率的計算公式:得率= X×100×(25/V)×10－3/W*100%，式子中X為樣品液中芍藥苷的濃度(mg/ml)，V為精確量取蒸發(fā)的液體(ml)，W為真武湯藥材總質(zhì)量.

2. 2單因數(shù)實驗

2. 2. 1提取時間的影響分別取按處方準(zhǔn)備好的藥材量的1/6(既茯苓1. 50g，芍藥1. 50g，生姜1. 50g，白術(shù)1. 00g，炮附子0. 70g)，各六份，混勻.按料液比為1∶15加入70%的乙醇溶液，設(shè)定微波火力為中火(P = 50)，微波提取時間分別為1、2、3、4、5、6min，得提取液，最后測定芍藥苷的吸光度.

2. 2. 2微波火力的影響分別取按處方準(zhǔn)備好的藥材量的1/6(既茯苓1. 50g，芍藥1. 50g，生姜1. 50g，白術(shù)1. 00g，炮附子0. 70g)，各五份，混勻.按料液比為1∶15加入70%的乙醇溶液，設(shè)定微波時間為3min，微波火力分別為微火(P =10)、中微火(P = 30)、中火(P = 50)、中高火(P =80)、最大火(P =100)，得提取液，最后測定芍藥苷的吸光度.

2.2.3料液比的影響分別取按處方準(zhǔn)備好的藥材量的1/6(既茯苓1.50g，芍藥1.50g，生姜1.50g，白術(shù)1.00g，炮附子0.70g)，各五份，混勻.分別按料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1

∶20、1∶25加入70%的乙醇溶液，設(shè)定微波火力為中火(P = 50)，微波提取時間為3min，得提取液，最后測定芍藥苷的吸光度.

2. 2. 4乙醇濃度的影響分別取按處方準(zhǔn)備好的藥材量的1/6(既茯苓1. 50g，芍藥1. 50g，生姜1. 50g，白術(shù)1. 00g，炮附子0. 70g)，各五份，混勻.按料液比為1∶15分別加入40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，設(shè)定微波火力為中火(P =50)，微波提取時間為3min，得提取液，最后測定芍藥苷的吸光度.

2. 2. 5單因素實驗結(jié)果隨著提取時間的增加芍藥苷的吸光度值先增大后減小，且在4min時有最大值;隨著微波火力的增大，芍藥苷的吸光度值先增大后減小，且在微波火力為中高火時有最大值;隨著料液比的增大，芍藥苷的吸光度值逐漸增大，后趨于平衡，其中在1∶20、1∶25時，趨于平衡;隨著乙醇濃度的增大，芍藥苷的吸光度值先增大后減小，且在濃度為70%時有最大值.

2. 3正交試驗

2. 3. 1正交實驗分別稱取按處方準(zhǔn)備好的藥材量的1/3(既茯苓3. 00g，芍藥3. 00g，生姜3. 00g，白術(shù)2. 00g，炮附子1. 40g)，各9份，混勻，根據(jù)單因素實驗結(jié)果，進行L9(34)正交試驗(見表1).

表1　因素水平表

2. 3. 2正交實驗的結(jié)果由表2可知，根據(jù)K值各因素對實驗指標(biāo)的影響按大小次序排列為A＞D＞B＞C，即乙醇濃度＞料液比＞微波時間＞火力.由方差分析F值大小可得從真武湯中提取芍藥苷的最佳條件為: A2B2C3D1，即乙醇濃度為60%，微波時間為3min，微波火力中高火，料液比為1∶10.

表2　正交實驗的結(jié)果

2. 3. 3實驗驗證取上述處方藥材三份，分別按上述最佳工藝條件A2B2C3D1，即乙醇濃度為60%，微波時間為3 min，微波火力中高火，料液比為1∶10，對實驗結(jié)果進行驗證，見表3.

表3　真武湯提取最佳工藝的驗證結(jié)果表

由表3可知，按照正交試驗所優(yōu)選而得的最佳工藝進行提取試驗，三次結(jié)果芍藥苷含量均處于較高水平，這說明該最佳工藝是穩(wěn)定可行的.

3　討論

真武湯為經(jīng)典方劑，臨床用于心血管系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、腎臟疾病、婦科疾病以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等.現(xiàn)代研究證實，該方不但具有利尿、強心的作用，還有保護受損心肌、消除自由基、提高機體應(yīng)激、促進新陳代謝抗衰老等作用[1].李景巍[2]、劉崇新[3]、荊世常[4]、何幼斌[5]等應(yīng)用真武湯在臨床上取得很好療效.該方雖應(yīng)用很廣，但未見該方提取工藝的研究，從而也制約該方的制劑開發(fā).另外，微波提取技術(shù)具有快速、溶劑用量少、提取率高、成本低、質(zhì)量好等許多優(yōu)點，是天然產(chǎn)物提取中一種非常有發(fā)展?jié)摿Φ男滦图夹g(shù)[6－8].因此本文選擇以乙醇濃度、微波時間、微波火力、料液比四個因素對真武湯中芍藥苷的提取工藝進行考察，采用單因素以及正交實驗兩者相結(jié)合，以芍藥苷為檢測指標(biāo)，考察真武湯中芍藥的提取工藝.吳謙認(rèn)為[9]:“真武湯尤妙在芍藥之酸收，仲景之旨微矣.蓋人之身陽根于陰，若徒以辛熱補陽，不少佐以酸收之品，恐真陽飛越矣，用芍藥者，是亟收陽氣歸根于陰也，于此推之，則可知誤服青龍致發(fā)汗亡陽者，所以于補陽藥中之必需芍藥也.”所以檢測芍藥苷的含量具有代表性，芍藥苷含量多少與該方的有效部位的溶出度有密切關(guān)系.故本實驗用紫外分光光度法測定芍藥苷得率，方法簡單、易操作，且乙醇提取溶出的雜質(zhì)少、溶劑可回收、比較經(jīng)濟.實驗結(jié)果表明最佳的提取工藝為:乙醇濃度為60%，微波時間3 min，微波火力中高火，料液比1∶10;且驗證實驗結(jié)果表明該最佳工藝是穩(wěn)定可行的.本文通過單因素及正交試驗對真武湯的提取工藝作初步研究，以期能為開發(fā)該方新制劑奠定一定基礎(chǔ).

參考文獻

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[3]劉崇新．真武湯化裁治療上呼吸道感染后久咳138例[J]．安徽中醫(yī)臨床雜志，2000，12(2): 82．

[4]荊世常．真武湯加減治療老年性遺尿95例[J]．河南中醫(yī)，2011，31(1): 14．

[5]何幼斌．真武湯治療尿路結(jié)石并腎積水30例[J]．湖北中醫(yī)雜志，2003，25(4): 35．

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收稿日期:( 2014. 12. 18)

【文章編號】1007－8517(2015)06－0008－02

【文獻標(biāo)志碼】A

【中圖分類號】R284. 2