ACS患者外周血LXA4與CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細胞水平的臨床意義

柳洪杰，劉魯濱.北京市海淀區(qū)北安河社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心心血管內(nèi)科，北京　00095；.北京大學醫(yī)院內(nèi)科，北京　0087

ACS患者外周血LXA4與CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細胞水平的臨床意義

柳洪杰1，劉魯濱2
1.北京市海淀區(qū)北安河社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心心血管內(nèi)科，北京100095；2.北京大學醫(yī)院內(nèi)科，北京100871

[摘要]目的探討ACS患者入院時外周血脂氧素A4（LXA4）與CD4+ CD25+ CD127-調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)水平在急性冠脈綜合癥患者中的作用及機制，探討其在此類疾病診斷及預(yù)后方面作用。方法整群選取自2010年3月—2015年3月該院收治的154例ACS患者，其中49例急性非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)，53例急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)組，52例不穩(wěn)定型心絞痛(UA)組。對照組選取同期該院健康體檢者50例。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和流式細胞分析法，檢測各組外周血LXA4、CD4+CD25+ CD127-Treg細胞水平，并進行相關(guān)性分析。結(jié)果ACS組患者入院時外周血LXA4水平顯著高于對照組(P<0.01)；STEMI組患者外周血LXA4水平顯著高于UA組及NSTEMI組(P值分別為<0.05，<0.05)；ACS組患者入院時外周血CD4+CD25+CD127-Treg細胞占CD4 +CD25+T細胞的百分率與對照組(P<0.01)相比顯著較低；STEMI組患者外周血CD4+CD25+ CD127-Treg細胞占CD4+CD25+T細胞的百分率與UA組及NSTEMI組(P值分別為<0.05，<0.05)相比顯著較低；CD4+ CD25+CD127-Treg細胞百分率和ACS患者血漿LXA4水平呈顯著負相關(guān)(r=-0.653，P=0.004)。結(jié)論通過檢測ACS患者的CD4+CD25+CD127-Treg細胞及LXA4水平，能夠?qū)CS患者的分型及預(yù)后有一定的指導意義。

[關(guān)鍵詞]急性冠脈綜合癥；脂氧素A4；CD4+CD25+ CD127-Treg細胞

急性冠狀動脈綜合癥(acute coronary syndrome．ACS)，是冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary artery disease，CHD）中的急癥，約占冠心病的30%～40%左右，是較常見的致死性心血管疾病之一。ACS有三種：急性ST段抬高心肌梗死(ST segment elevation myo cardial infarction．STEMI)、不穩(wěn)定型心絞痛(unstable angina，UA)、急性非ST段抬高心肌梗死(non—ST segment elevation myocardial infar ction，NSTEMI)[1]。ACS的主要是由于不穩(wěn)定斑塊中炎癥細胞的積聚造成，當斑塊破損或出現(xiàn)裂紋，從而將大量的炎癥因子釋放出來的時候，會使一系列的級聯(lián)免疫反應(yīng)來放大免疫細胞浸潤產(chǎn)生，從而使得斑塊破裂[2]。有研究認為，過度表達的局部炎性反應(yīng)會造成缺血本身更嚴重的對缺血區(qū)心肌組織的損傷，所以，如何使其后過度表達的炎性反應(yīng)得到抑制，使免疫調(diào)節(jié)性T細胞（Tr）和致病性T細胞（Tp）等實現(xiàn)動態(tài)平衡，進一步保護心肌細胞，是近年研究的重點[3]。脂氧素A4（Lipoxin，LX A4）是近年來人們發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性化學介質(zhì)，LX A4能時炎性細胞因子的產(chǎn)生得到降低，使中性粒細胞的活化和趨化得到抑制，是調(diào)節(jié)炎癥消退的重要抗炎介質(zhì)[4]。LX A4在炎性相關(guān)性疾病中越來越受到重視，在冠心病缺血再灌注的炎性反應(yīng)中的作用及機制尚未見報道。該研究通過測定分析該院2010年3月—2015年3月收住的154例ACS患者外周血脂氧素A4 （LXA4）與CD4+ CD25+ CD127+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)水平，不同分組間進行分析比較，以及進行相關(guān)性研究，探討LXA4在ACS患者缺血再灌注的炎性反應(yīng)中的機制和作用，以及其在此類疾病發(fā)病、預(yù)后過程中的作用。現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

整群選擇2010年3月—2015年3月來該院心內(nèi)科住院并接受冠脈造影的ACS患者154例，其中男性87例，女性67例，平均年齡(59.62±17.84)歲。根據(jù)造影結(jié)果及其他輔助檢查，將ACS患者分為不穩(wěn)定型心絞痛(UA)組52例，其中男性29例，女性23例，平均年齡(61.73±13.59)歲；急性非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI) 49例，其中男性28例，女性21例，平均年齡(58.19± 14.03)歲；急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)組53例。其中男性30例，女性23例，平均年齡(58.63±18.58)歲。各組在性別、年齡間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。所有病例診斷符合2007年美國心臟病學會和美國心臟病協(xié)會(ACC／AHA)修訂的診斷標準?；颊呔Y(jié)合肌鈣蛋白I、臨床行心肌酶等生化標記物和冠狀動脈造影檢查使ACS得到確診。所有確診為冠心病的患者使用的基礎(chǔ)藥物治療方案都相似，如氯吡格雷、硝酸酯類、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、阿司匹林、他汀類藥物、p受體阻滯劑、利尿劑、鈣拮抗劑等等。所有病例都將自身免疫性疾病或使用免疫抑制劑(如皮質(zhì)類固醇)、心肌病、惡性腫瘤、嚴重心力衰竭、炎癥性疾病、內(nèi)分泌疾病、心內(nèi)膜炎、嚴重肝腎功能不全等排除。對照組選取同期該院健康體檢者，未發(fā)現(xiàn)心血管疾病者50例,其中男性28例，女性22例，平均年齡(59.13±16.65)歲，ACS各組和對照組在年齡、性別上的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。所有患者及健康體檢者均簽署了知情同意書。

1.2儀器和試劑

FC500型流式細胞儀，是在美國的貝克曼庫爾特有限公司購買的。試劑當中主要包括：LXA4試劑盒購自美國A&D公司。以下均購于美國eBioscienee公司：人Treg染色試劑盒，規(guī)格100t的藻青蛋白-花青苷（PC5)標記的鼠抗人單克隆抗體CD25 mAb(抗CD25 m Ab)；規(guī)格100t的異硫氰熒光素(FITC)標記的鼠抗人單克隆抗體CD4 mAb(抗CD4 mAb)；規(guī)格100 t的藻紅蛋白(PE)標記的鼠抗人單克隆抗體CD127 mAb(抗CD127+ mAb)。

1.3檢測方法

采集兩管ACS患者入院后清晨空腹靜脈血每管3～4 mL，共5～8 mL。同時，對照組取空腹靜脈血。LXA4測定：肝素抗凝，30 min內(nèi)，常規(guī)離心,將血清分離,在-80℃超低溫冰箱將血清標本凍存待測。嚴格按照試劑說明書中描述的使用酶聯(lián)免疫吸附法的夾心法實施檢測。CD4+CD25+ CD127-Treg表達率測定：EDTA抗凝，標記細胞采用直接免疫熒光標記法，并進行流式細胞儀分析。操作步驟：取單克隆抗體CD127-PE、CD25-PC5、CD4-FITC，同型對照各20 μL，添加100 uL EDTA抗凝的外周血，在室溫下實施避光孵育15 min,再添加500 μL紅細胞裂解液，實施避光孵育10 min；加入PBS，洗2次，離心1500轉(zhuǎn)/5min，棄上清后，添加適量PBS。采用流式細胞儀進行檢測，并對CD4+CD25+CD127-Treg細胞百分率進行計算。

1.4統(tǒng)計方法

使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以mean±SD表示，多個樣本均數(shù)兩兩比較，運用LDS法方差進行分析，每兩組間的比較用最小顯著差法得t值。不連續(xù)變量采用χ2檢驗，采用Pearson相關(guān)分析和偏相關(guān)分析兩個正態(tài)分布的連續(xù)變量之間的相關(guān)關(guān)系，P<0.05時，差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1 ACS患者及正常對照組血漿LXA4水平

各組血清LXA4濃度經(jīng)過方差齊性檢驗，結(jié)果為(F=9.138, P<0.01)具有方差齊性。ACS組患者入院時外周血LXA4水平顯著高于對照組(P<0.01)；STEMI組患者外周血LXA4水平顯著高于UA組及NSTEMI組(P值分別為<0.05)；UA組及NSTEMI組患者外周血LXA4水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　ACS患者及正常對照組血漿LXA4水平（±s）

表1　ACS患者及正常對照組血漿LXA4水平（±s）

注：aP<0.01 vs對照組;bP<0.05 vsNSTEMI組；cP<0.01；vsUA組;dP>0.05 vsUA組。

ACS（n=154) STEMI(n= 53) NSTEMI(n=49) UA(n=52)對照組(n=50)組別(21.569±10.716)a(26.064±9.123)b c(20.317±8.268)d18.472±11.564 9.624±7.313 LXA4(ug/L)

2.2 CD4+CD25+ CD127-Treg細胞占CD4+CD25+T細胞的百分率

STEMI組患者外周血CD4+CD25+ CD127-Treg細胞占CD4+CD25+T細胞的百分率與UA組及NSTEMI 組(P分別<0.05，<0.05)相比顯著較低差異有統(tǒng)計學意義；ACS組患者入院時外周血CD4+CD25+ CD127-Treg細胞占CD4+CD25+T細胞的百分率和對照組相比顯著較低(P<0.01)；UA組及NSTEMI組患者外周血CD4+ CD25+ CD127-Treg細胞占CD4+CD25+T細胞的百分率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2　CD4+CD25+ CD127-Treg細胞占CD4+CD25+T細胞的百分率

3　討論

動脈粥樣硬化，屬于一種炎癥性疾病。在動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展的過程當中，炎癥機制扮演著重要的角色。現(xiàn)有研究認為，炎癥反應(yīng)和易損斑塊破裂互相為因果，使一個急性冠脈綜合征(acute coronary sysndromes As)的惡性循環(huán)過程啟動。內(nèi)皮細胞損傷后炎癥反應(yīng)導致了動脈硬化斑塊的形成是，在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程免疫及炎癥反應(yīng)反映了急性心肌缺血連續(xù)的病理生理過程[5-6]。該研究通過檢測154例ACS患者血漿LXA4水平，分析比較其在ACS的早期診斷及臨床分型中的臨床意義。脂氧素A4(Lipoxin A4，LXA4)是機體在急性炎癥反應(yīng)時產(chǎn)生的一類脂質(zhì)抗炎遞質(zhì)，在感染、損傷和炎癥等過程中經(jīng)跨細胞途徑合成，能降低炎性細胞因子的產(chǎn)生[7]，是二十烷類家族中一類花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，使中性粒細胞的趨化與活化受到抑制，是使炎癥消退得到調(diào)節(jié)的重要抗炎介質(zhì)[8]。該研究發(fā)現(xiàn)ACS患者入院時外周血LXA4水平顯著高于對照組，其中STEMI組患者外周血LXA4水平高于UA組及NSTEMI組，UA組及NSTEMI組患者外周血LXA4水平比較無差異。說明LXA4在ACS早期迅速升高，并與心肌缺血的程度呈正相關(guān)。該研究者前期研究也發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死患者入院時血漿LXA4水平與對照組和48 h后相比顯著較高。結(jié)合既往研究結(jié)果LXA4為炎癥消退因子，其可能在ACS早期急性炎癥反應(yīng)的過程中可能起到了抑制炎癥反應(yīng)進一步級聯(lián)擴大，保護心肌細胞的作用。但具體作用機制尚需進一步研究。進而提示研究人員也許能夠通過檢測ACS患者入院時外周血LXA4水平，進一步預(yù)測ACS患者的病情及預(yù)后。

不只血管病變當中會發(fā)生冠狀動脈粥樣硬化中炎癥的激活，活化外周血中的免疫細胞也會發(fā)生冠狀動脈粥樣硬化中炎癥的激活，尤其是T細胞起著重要的作用。研究顯示在急性心肌梗死中不同的T細胞亞群在動脈粥樣硬化的進展中起著不同的作用[9]。在ACS患者中存在Th1細胞的激活和Th1/Th2細胞的失衡，通過調(diào)節(jié)輔助性T細胞分泌的細胞因子水平，能夠改變斑塊內(nèi)和外周血中T細胞的數(shù)目，從而能夠穩(wěn)定ACS患者動脈粥樣硬化的斑塊[10]。體外研究試驗發(fā)現(xiàn)誘導產(chǎn)生Treg細胞可縮小ACS的斑塊，而Treg細胞的疫苗加速了ACS的進程。Foxp3是Treg細胞分化和細胞因子分泌的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子。近期發(fā)現(xiàn)Foxp3的表達和CD127（IL-7受體）有負相關(guān)的關(guān)系，所以檢測時在CD4+CD25+的基礎(chǔ)上與CD127抗原相聯(lián)合，可以把人CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)[11]很好地識別出來。該實驗經(jīng)對ACS患者CD4+CD25+T細胞中外周血CD4+CD25+CD127-Treg細胞的百分率進行檢測，進行分析和比較，發(fā)現(xiàn)ACS組患者入院時，外周血CD4+CD25+ CD127-Treg細胞占CD4+CD25+T細胞的百分率顯著低于對照組，其中STEMI組CD4+CD25+T細胞中患者外周血CD4+CD25+ CD127-Treg細胞的百分率與UA組及NSTEMI組相比顯著較低，UA組及NSTEMI組之間比較差異無統(tǒng)計學意義?？赡苷f明了ACS患者體內(nèi)Treg細胞水平明顯下降，且隨著Treg細胞水平的下降幾乎與病情嚴重程度一致。該研究者前期研究發(fā)現(xiàn)AMI患者入院時外周血中CD4+CD25+T細胞內(nèi)CD4+CD25+ CD127-Treg細胞的百分率顯著低于入院48 h及對照組[12]。提示研究人員也許能夠通過檢測CD4+CD25+ CD127-Treg細胞的水平，預(yù)測ACS的分型及預(yù)后，同時對ACS的治療方向也有一定的指導作用。同時研究人員還發(fā)現(xiàn)ACS患者血漿LXA4水平與CD4+CD25+ CD127-Treg細胞百分率呈顯著正相關(guān)，說明兩者均在ACS的發(fā)生發(fā)展及發(fā)病過程中起到了調(diào)節(jié)作用，但具體的作用機制尚需進一步的研究。

[參考文獻]

[1] Chinwong D,Patumanond J,Chinwong S,et al. Clinical indicators for recurrent cardiovascular events in acute coronary syndrome patients treated with statins under routine practice in Thailand: an observational study[J].BMC Cardiovasc Disord,2015 Jun 16;15(1):55.doi: 10.1186/s12872-015-0052-y. PMID:26076586

[2] Bentzon JF,Otsuka F,Virmani R,et al. Mechanisms of plaque formation and rupture[J].Circ Res,2014,114(12):1852-1866.

[3] Zhang D, Wang SQ, Guan YQ, et al. Effect of oral atorvastatin on CD4+CD25+ regulatory T cells, FoxP3 expression, and prognosis in patients with ST-segment elevated myocardial infarction before primary percutaneous coronary intervention[J].J Cardiovasc Pharmacol,2011,57(5):536-541.

[4] Backteman K,Andersson C,Dahlin LG,et al. Lymphocyte subpopulations in lymph nodes and peripheral blood: a comparison between patients with stable angina and acute coronary syndrome[J].PLoS One,2012,7 (3):e32691.doi: 10.1371/journal.pone.0032691. Epub 2012 Mar 1. PMID:22396788.

[5] Chen XQ,Wu SH,Zhou Y,et a1. Lipoxin A4-induced heme oxygenase-1 protects cardiomyocytes against hypoxia/reoxygenation injury via p38 MAPK activation and Nrf2/ARE complex[J].PLoS One,2013 Jun 24,8(6):e67120. doi: 10.1371/ journal.pone.0067120. Print 2013. PMID:23826208.

[6] Gregoric P, Pavle G, Sijacki A,et a1.SIRS score on admission andinitial concentration of IL-6 as severe acute pancreatitis outcomepredictors[J].Hepato-Gastroenterology,2010,57 (98):349-353.

[7] Zhou MT,Chen BC,Sun HW,et a1. The protective effects of Lipoxin A4 during the early phase of severe acute pancreatitis in rats[J].Scand J Gastroenter,2011,46(2):211-219.

[8] Serhan CN, Yacoubian S,Yang R. Anti-inflammatory and proresolving lipid mediators[J].Annu Rev Pathol,2008(3): 279-312.

[9] Zhao XW,Bao JJ,Hu C,et al. Effect of diclofenac on the levels of lipoxin A4 and Resolvin D1 and E1 in the post-ERCP pancreatitis [J].Dig Dis Sci,2014,59 (12):2992-2996.doi: 10.1007/s10620 -014 -3280 -6.Epub 2014 Jul 17.PMID: 25030943.

[10] Wu HY,Maron R,Tukpah AM,et al.Mucosal anti-CD3 monoclonal antibody attenuates collagen-induced arthritis that is associated with induction of LAP+ regulatory T cells and is enhanced by administration of an emulsome-based Th2-skewing adjuvant[J].J Immunol,2010,185(6):3401-3407.

[11] Liberal R,Grant CR,Holder BS,et al.In autoimmune hepatitis type 1 or the autoimmune hepatitis-sclerosing cholangitis variant defective regulatory T -cell responsiveness to IL-2 results in low IL-10 production and impaired suppression[J].Hepatology,2015,62(3).doi:10.1002/hep.27884. PMID:25953611

[12]柳洪杰,劉魯濱.急性心肌梗死患者不同時期外周血LXA4與CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細胞水平及相關(guān)性研究[J].中國醫(yī)藥導報,2015(7):42-45.

Clinical Significance of Levels of LXA4 and CD4+CD25+CD127- Treg cells in Peripheral Blood in Patients with Acute Coronary Syndrome

LIU Hong-jie1, LIU Lu-bin2
1.Department of Cardiology, Beianhe Community Health Service Center, Haidian District, Beijing, 100095 China；2.Department of Internal medicine, Beijing University Hospital, Beijing, 100871 China

[Abstract]Objective To explore the mechanism of the levels of LXA4 and CD4+CD25+CD127- Treg cells in peripheral blood in patients with acute coronary syndrome (ACS) and discuss its role in diagnosis and prognosis of this kind of disease. Methods From March 2010 and March 2015, 154 ACS patients were enrolled, including 49 cases of acute non-ST-elevation myocardial infarction (NSTEMI) as the NTESMI group, 53 cases of acute ST-elevation myocardial infarction (STEMI) as the STEMI group, 52 cases of unstable angina as the UA group. Other healthy people who received health check in the same period in this hospital were selected as the control group. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and flow cytometry were used to detect the levels of LXA4 and CD4+CD25+CD127-Treg cells in peripheral blood in all the patients and the correlation analysis was conducted. Results The level of LXA4 at admission was higher in the all the ACS patients than in those in the control group(P<0.01), was higher in the STEMI group than in the UA group(P<0.05) and NTESMI group (P<0.05). The proportion of peripheral blood CD4+CD25+CD127-Treg cells in CD4+CD25+T cells at admission was obviously lower in all the ACS patients than those in the control group (P<0.01), was obviously lower in the STEMI group than in the UA group(P<0.05) and NTESMI group(P<0.05). The proportion of peripheral blood CD4+CD25+CD127-Treg cells was negatively correlated with the level of LXA4, (r=-0.653, P=0.004). Conclusion Detecting the level of CD4+CD25+ CD127-Treg cells and LXA4 can provide guidance for the classification and prognosis of patients with ACS.

[Key words]Acute coronary syndrome; Lipoxin A4; CD4+CD25+CD127-Treg cells

收稿日期：（2015-07-10）

[作者簡介]柳洪杰(1972.6-)，男，山東濟南人，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：急危重癥診療。

[文章編號]1674-0742（2015）10（b）－0078-04

[文獻標識碼]A

[中圖分類號]R4