附睪微環(huán)境對(duì)精子成熟影響的研究進(jìn)展

龔 堅(jiān)綜述 劉朝圣審校

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)2013級(jí)碩士研究生（長(zhǎng)沙　410208）；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院

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附睪微環(huán)境對(duì)精子成熟影響的研究進(jìn)展

龔 堅(jiān)1綜述 劉朝圣2審校

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)2013級(jí)碩士研究生（長(zhǎng)沙410208）；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院

20世紀(jì)60年代Bedford［1］和Orgebin-Crist［2］根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提出了附睪精子成熟的理論，睪丸產(chǎn)生精子并不成熟，缺乏運(yùn)動(dòng)和精-卵結(jié)合能力，精子在附睪中的成熟不是自發(fā)和時(shí)間依賴的，而是通過與附睪蛋白相互作用來完成的。研究表明，不僅附睪分泌蛋白參與精子成熟過程，而且是附睪內(nèi)多種因素共同作用于附睪精子促使精子成熟。附睪精子和睪丸精子妊娠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，睪丸精子組種植率及妊娠率低于附睪精子組，可能與睪丸精子缺乏成熟、影響胚胎進(jìn)一步發(fā)育有關(guān)［3］，進(jìn)一步驗(yàn)證了附睪微環(huán)境對(duì)精子成熟的影響。本文就精子成熟過程中附睪微環(huán)境的影響進(jìn)行了文獻(xiàn)綜述。

一、精子在附睪內(nèi)成熟

睪丸中產(chǎn)生的精子從其形態(tài)結(jié)構(gòu)和染色質(zhì)的角度已基本成熟，但還不具備運(yùn)動(dòng)能力，精卵識(shí)別以及牢固的結(jié)合能力。精子在附睪中的成熟是一個(gè)高度程序化的過程，一方面受到精子自身因素的作用，另一方面則受到了附睪微環(huán)境的影響。精子在附睪移行過程中，精子各部分也在發(fā)生著一系列的變化，如精子胞質(zhì)小滴的移行，胞漿、頂體等精子的形態(tài)發(fā)生了進(jìn)一步的變化；精子核染色質(zhì)的濃縮，對(duì)核酸酶的抵抗力增強(qiáng)；精子膜的膜脂、膜蛋白、膜上糖基成分、膜電荷以及膜流動(dòng)性與通透性的改變；精子運(yùn)動(dòng)能力、受精能力的獲得；異常的精子逐漸被吞噬、吸收或降解等［4， 5］。精子從睪丸到附睪經(jīng)歷了一系列的物理、化學(xué)和形態(tài)的改變，從而最終獲得完全成熟。

二、附睪內(nèi)影響精子成熟的因素

（一）附睪分泌蛋白與精子成熟

現(xiàn)今對(duì)附睪精子成熟的研究已深入到分子生物學(xué)水平，熱點(diǎn)是與附睪精子成熟微環(huán)境相關(guān)的一些特異性蛋白表達(dá)及基因調(diào)節(jié)的研究。目前己知附睪可以分泌約200種蛋白質(zhì)［6］，其中一些蛋白已被確認(rèn)直接參與了附睪中精子的成熟，但它們中的大多數(shù)在雄性生殖中的作用還未明了。這些蛋白質(zhì)與管腔液的其他成分形成不斷變化著的管腔微環(huán)境，與精子相互作用，使精子表面蛋白的成分得以部分改變或部分修飾，從而被激活或抑制從而逐步獲得成熟時(shí)所具備的功能。

1. 附睪分泌蛋白與精子運(yùn)動(dòng)能力的獲得：精子的運(yùn)動(dòng)能力是在附睪成熟過程中獲得并得到發(fā)展的，包括超激活運(yùn)動(dòng)和前向運(yùn)動(dòng)。

有研究表明，附睪特異分泌蛋白EPPIN表達(dá)與精子濃度、精子活力呈顯著負(fù)相關(guān)，它能結(jié)合精囊蛋白（semenogelin， Sg）和纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)n），通過在精子表面形成的外殼蛋白抑制精子獲能及精子的活動(dòng)性［7］。其中，EPPIN-Sg可以調(diào)控精子內(nèi)部的pH值及鈣離子水平，進(jìn)而抑制精子的活動(dòng)率，影響生殖［8， 9］。體外模型研究證明，前向運(yùn)動(dòng)蛋白（FMP）是未成熟精子在附睪內(nèi)成熟獲得前向運(yùn)動(dòng)的必需蛋白［10］，當(dāng)FMP結(jié)合在附睪精子的尾部時(shí)，精子能獲得前向運(yùn)動(dòng)能力，當(dāng)FMP結(jié)合在附睪精子頂體時(shí)，能防止精子間的頭部凝集［11］。有報(bào)道，中性α-糖苷酶活性與精子活力之間有顯著的正相關(guān)性，與不運(yùn)動(dòng)精子有顯著的負(fù)相關(guān)性，因此推測(cè)其與精子前向運(yùn)動(dòng)能力有關(guān)［12］；其可能的機(jī)制是中性α-糖苷酶可催化精子糖原降解，供給精子代謝與運(yùn)動(dòng)能源。此外β-防御素15［13］、β-防御素3（HBD-3）［14］參與精子活力和前向運(yùn)動(dòng)能力發(fā)生，在附睪內(nèi)精子成熟方面發(fā)揮重要作用。

2. 附睪分泌蛋白與獲能、頂體反應(yīng)、精卵結(jié)合：精子獲能是指精子在獲得穿透卵子透明帶能力的生理過程，是精子在受精前必須經(jīng)歷的一個(gè)重要階段；頂體反應(yīng)是指精子釋放頂體酶，穿過透明帶的過程。精子質(zhì)膜上有一些具黏附作用的蛋白參與到精子獲能、頂體反應(yīng)以及其后的精卵融合過程過程中，存在于精子和卵子上的蛋白質(zhì)復(fù)合物具有結(jié)合和融合作用，一些附睪分泌的精子結(jié)合蛋白參與了這個(gè)過程。

附睪分泌蛋白P34H大多與精子膜頂體部位結(jié)合，可作為附睪精子成熟的標(biāo)志物，能夠介導(dǎo)精子和透明帶的結(jié)合，當(dāng)附睪中P34H降低時(shí)可發(fā)生原發(fā)性男性不育［15］。精卵聚合蛋白通過與卵質(zhì)膜的相互作用，破壞卵質(zhì)膜的穩(wěn)定性，促使精子穿卵過質(zhì)膜，完成受精［16］。附睪特異蛋白絲氨酸蛋白酶抑制劑（HongrES1）特異地表達(dá)于附睪尾段，在附睪精子移行時(shí)結(jié)合到精子頂體前區(qū)，精子獲能使HongrES1蛋白脫落，頂體反應(yīng)后完全消失，起到去能因子的作用［17， 18］。此外，人附睪蛋白SOB2，F(xiàn)LB1，gp20， Ecad等也參與了精卵融合過程。

3. 附睪分泌蛋白與免疫保護(hù)及抗菌能力：附睪分泌的蛋白中，有些能夠結(jié)合在精子表面，保護(hù)精子在男性和女性生殖道內(nèi)免受細(xì)菌或病毒的攻擊，從而促進(jìn)精卵作用，在附睪精子成熟過程中發(fā)揮重要作用；防御素家族就是其中的代表。

防御素家族成員Bin1b特異地表達(dá)于附睪頭部，能與精子頭部結(jié)合；在對(duì)成長(zhǎng)中大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，30d的大鼠附睪才發(fā)現(xiàn)Bin1b的表達(dá)，在性成熟時(shí)表達(dá)量達(dá)到高峰，老年時(shí)逐漸減少。這種區(qū)域特異性和發(fā)育階段特異性的表達(dá)方式提示Bin1b在精子成熟和生育方面可能有重要作用。而利用附睪頭部上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)物和反義實(shí)驗(yàn)已證實(shí)了Bin1b的抗微生物作用［19］。防御素家族其他成員如：HE2［20］，EP2［21］和ESC42［22］也被證實(shí)具有較強(qiáng)的抗細(xì)菌、抗真菌作用。

hCAP18是一種在附睪從頭部到尾部全程表達(dá)的分泌蛋白，是Cathelicidin家族成員，大量的表達(dá)于附睪尾部。已證實(shí)hCAP18具有強(qiáng)大抗菌作用［19］。同樣在附睪尾部大量分泌的Lf蛋白，是一種金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，通過限制微生物攝取這些金屬離子而發(fā)揮強(qiáng)大的抗菌、抗真菌、抗病毒效應(yīng)，同時(shí)還具有抗腫瘤和抗炎癥作用［19］。

4. 附睪分泌蛋白與抗氧化保護(hù)蛋白：哺乳動(dòng)物的精子多富含不飽和脂肪酸，因而極易受到氧自由基的損傷。附睪分泌的抗氧化損傷的物質(zhì)可以保護(hù)附睪管腔內(nèi)移行成熟和儲(chǔ)存的精子。

附睪管腔液中谷胱甘肽（GSH）介導(dǎo)的保護(hù)作用在附睪內(nèi)是很活躍的，通過對(duì)谷胱甘肽過氧化物酶5基因敲除小鼠模型的研究表明，谷胱甘肽過氧化物酶5是一種重要的管腔液自由基清除者，保護(hù)尾部精子自由基損傷，維持精子DNA完整性，保障男性生育能力［23， 24］。肉堿及其酯類是附睪中另一種活躍的抗氧化物質(zhì)，它能通過兩種途徑發(fā)揮其抗氧化作用：一條途徑是通過阻止活性氧（ROS）產(chǎn)生，清除自由基，保護(hù)精子細(xì)胞免遭氧化損傷［25］。另一條途徑是通過清除細(xì)胞內(nèi)過多的乙酰輔酶A，或替代進(jìn)入質(zhì)膜磷脂中的脂肪酸，以及增加花生四烯酸的分解代謝，從而有效發(fā)揮其抗氧化和修復(fù)作用［26-27］。

（二）附睪內(nèi)細(xì)胞因子與精子成熟

附睪內(nèi)的細(xì)胞因子是由睪丸間質(zhì)的巨噬細(xì)胞受到外界刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物活性的小分子蛋白質(zhì)，通過與受體結(jié)合等途徑在附睪內(nèi)參與精子的發(fā)育與成熟［28］。

由T細(xì)胞產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）具有垂體激素、免疫調(diào)節(jié)劑和分裂素等功能。研究發(fā)現(xiàn)MIF作為一種附睪上皮細(xì)胞因子大量存在于附睪中，參與精子在附睪中的成熟過程，可能與附睪精子獲得運(yùn)動(dòng)能力有關(guān)［29-31］。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）在附睪的體部及尾部能高度表達(dá)，它對(duì)附睪精子的受精能力和運(yùn)動(dòng)能力的啟動(dòng)有著重要作用；研究發(fā)現(xiàn)，它參與附睪精子的運(yùn)動(dòng)能力的獲得［32］。

（三）微量元素與精子成熟

微量元素能通過多種途徑影響精子的生成、成熟；有研究表明，不育癥患者精漿中微量元素含量與精液參數(shù)存在密切的相關(guān)性［33］。其中，附睪中的鋅離子、鈣離子對(duì)附睪精子成熟影響最大。

1. 鋅離子： 附睪中一些促進(jìn)精子成熟的酶是鋅金屬酶，鋅缺乏可導(dǎo)致這些酶功能異常。有研究表明，精漿中鋅離子含量與精子頂體酶活性呈正相關(guān)；因此，鋅離子能通過對(duì)精子頂體酶活性的作用影響精子成熟過程［34］。而另一種鋅金屬酶：山梨糖醇脫氨酶，可將山梨醇轉(zhuǎn)化為果糖為精子提供能量，因此，山梨糖醇脫氨酶活性與精子運(yùn)動(dòng)性相關(guān)［35］。可見附睪中鋅離子含量對(duì)精子成熟有著重要作用。

2. 鈣離子：已有研究表明精子的Ca2+聚集作用對(duì)精子成熟、獲能和頂體反應(yīng)起主導(dǎo)作用，進(jìn)而直接影響雄性受精和生育力［36， 37］。附睪特異肽Bin1b通過激活鈣離子通道促進(jìn)Ca2+吸收，引發(fā)未成熟精子獲得運(yùn)動(dòng)能力［38， 39］。實(shí)驗(yàn)證明Bin1b通過激活精子L型Ca2+通道，進(jìn)而為未成熟精子獲得運(yùn)動(dòng)力提供必需的Ca2+匯集，Ca2+與精子鞭毛中的鈣調(diào)蛋白相互作用激活磷酸二酯酶，降低精子內(nèi)cAMP的濃度，從而調(diào)控精子活力［40-41］。

（四）其他

1. 活性氧：氧的代謝產(chǎn)物及其衍生物的含氧物質(zhì)統(tǒng)稱為活性氧類（Reactive Oxygen Specie，ROS），包括超氧陰離子、過氧化氫、羥基自由基、單線態(tài)氧和一氧化氮等。在生殖系統(tǒng)中，ROS的產(chǎn)生是一種正常生理情況。附睪微環(huán)境中適量活性氧可以調(diào)節(jié)精子功能， 研究表明，適當(dāng)水平的ROS在精子生理學(xué)方面起著重要作用，如O2-、H2O2和NO與精子高活躍性運(yùn)動(dòng)、獲能以及頂體反應(yīng)有關(guān)，ROS引起的脂質(zhì)過氧化作用促進(jìn)透明帶結(jié)合［42］。但過多活性氧會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激發(fā)生，造成精子質(zhì)膜不飽和脂肪酸氧化，嚴(yán)重影響精子質(zhì)膜流動(dòng)性，危害精子獲能、精卵識(shí)別和受精過程，同時(shí)破壞精子DNA和魚精蛋白之間緊密包裝狀態(tài)，引起 DNA 斷裂，堿基缺失，父方遺傳信息完整性無(wú)法保障，常引起不育或者圍產(chǎn)期流產(chǎn)［43］。

2. 酸性環(huán)境：近年來有研究表明，無(wú)論是基因突變還是環(huán)境因素所導(dǎo)致的附睪管腔酸性環(huán)境的破壞均可引起精子成熟障礙和雄性不育。因此，附睪管腔內(nèi)pH值改變可以影響精子的成熟［44-45］。當(dāng)精子進(jìn)入女性生殖道后，在獲能過程中，位于質(zhì)膜上的精子特異性Ca2+通道1（CatSper1）促進(jìn)Ca2+的內(nèi)流，使得精子尾部呈“鞭打”運(yùn)動(dòng)，CatSper1的激活依賴于堿性環(huán)境，而附睪管腔內(nèi)酸性環(huán)境以及HCO3-的濃度則會(huì)阻滯CatSper1的激活，阻止精子在附睪的提前獲能［46］。附睪上皮細(xì)胞通過各種酸堿轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)節(jié)HCO3-的重吸收和質(zhì)子的分泌，共同維持了附睪管腔酸性微環(huán)境的平衡，為附睪精子成熟提供了適合的環(huán)境。

結(jié)　語(yǔ)

近年來隨著研究的深入，越來越多的影響附睪精子成熟的因子及機(jī)制被發(fā)現(xiàn)，附睪與避孕及男性不育的關(guān)系也顯得越來越重要。盡管對(duì)附睪內(nèi)環(huán)境的附睪分泌蛋白、細(xì)胞因子、微量元素等作用機(jī)制的研究取得了一定的進(jìn)展，但還有許多問題尚未解決。有別于傳統(tǒng)對(duì)睪丸精子研究的重視，隨著附睪微環(huán)境對(duì)精子成熟影響研究的深入，將為以附睪為目標(biāo)的男性不育防治及男性生育調(diào)控方法提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

致謝：本文由湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012SK3138），國(guó)家自然科學(xué)（81373641）項(xiàng)目資助。

關(guān)鍵詞附睪； 微環(huán)境； 精子成熟； 細(xì)胞因子；附睪分泌蛋白

doi∶10.3969/j.issn.1008-0848.2016.02.017

參 考 文 獻(xiàn)

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（2015-11-11收稿）

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