多能干細(xì)胞視網(wǎng)膜定向分化研究進(jìn)展

顏廷宇，孔珺

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，中國醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院，遼寧省晶狀體學(xué)重點實驗室，沈陽 110005）

·綜述·

多能干細(xì)胞視網(wǎng)膜定向分化研究進(jìn)展

顏廷宇，孔珺

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，中國醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院，遼寧省晶狀體學(xué)重點實驗室，沈陽 110005）

在發(fā)達(dá)國家，年齡相關(guān)性黃斑變性等視網(wǎng)膜變性類病變是導(dǎo)致不可逆性視力喪失的主要原因，以視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細(xì)胞的功能障礙及損傷為病理生理學(xué)基礎(chǔ)。目前，臨床上尚無有效的逆轉(zhuǎn)視網(wǎng)膜變性類病變視力喪失的手段，臨床試驗中的RPE細(xì)胞移植及基因治療有望成為未來有效的治療措施。胚胎干細(xì)胞（ESC）及誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSC）的眼部定向分化為眼部單細(xì)胞病變類疾病的細(xì)胞移植治療提供了可能性。本文總結(jié)了ESC及iPSC眼部視網(wǎng)膜細(xì)胞定向分化的研究進(jìn)展，并對其未來發(fā)展前景進(jìn)行初步探討。

胚胎干細(xì)胞；誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞；眼；分化；視網(wǎng)膜變性

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胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC），是來源于囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的一種多能干細(xì)胞。人類胚胎受精后4～5 d的胚泡期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)由50～150個細(xì)胞組成，處于種植前的囊胚階段。ESC具有正常核型，能夠保持端粒酶高活性，并表現(xiàn)出顯著的長期增殖潛能，具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性［1］。ESC既可以一直保持未分化的狀態(tài)，也可以定向分化成內(nèi)胚層、中胚層和外胚層來源的細(xì)胞。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）是通過將特定基因、特定基因產(chǎn)物或小分子化合物導(dǎo)入體細(xì)胞中，使體細(xì)胞重新編程而獲得的具有ESC特性和功能的細(xì)胞［2］。近年來，ESC與iPSC向眼部定向分化和移植的相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究成為熱點并發(fā)展迅速。現(xiàn)主要就ESC向眼部視網(wǎng)膜細(xì)胞定向分化的研究進(jìn)展予以綜述。

1　誘導(dǎo)ESC眼部定向分化

視網(wǎng)膜變性疾病，如年齡相關(guān)性黃斑變性（age?related macular degeneration，AMD），是導(dǎo)致不可逆性視力喪失的主要原因。在此類疾病中，視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞的功能障礙導(dǎo)致了疾病的發(fā)生。隨著RPE的退化，光感受器開始凋亡，患者的視力開始喪失。就目前而言，細(xì)胞移植對于視網(wǎng)膜變性疾病有一定的治療效果，而ESC是其重要的供體細(xì)胞來源之一［3］。如何高效控制ESC定向分化是研究的熱點。

1.1誘導(dǎo)生成視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞

MELLOUGH等［4］模仿神經(jīng)和視網(wǎng)膜發(fā)育過程，通過將無血清無滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)條件與已知生長因子以及代謝產(chǎn)物相結(jié)合，成功地將ESC和iPSC分化為光感受器細(xì)胞。該研究在為期60 d的hESC與hiPSC分化培養(yǎng)中，通過對標(biāo)志物OPNISW和RHO?DOPSIN的檢測，證實其分化有效率要高于以往報道。其中，只有B27和（或）N2作為補(bǔ)給的培養(yǎng)基要比多成分培養(yǎng)基的分化效率更高，說明在分化過程中B27與N2發(fā)揮了重要作用。同時，在分化早期，DKK1和Noggin在促進(jìn)hESC與hiPSC分化成視網(wǎng)膜祖細(xì)胞以及光感受器前體中扮演著重要角色。

1.2誘導(dǎo)生成RPE細(xì)胞

對視網(wǎng)膜變性疾病患者進(jìn)行細(xì)胞移植，最首要的問題是需解決如何獲得大量且安全可靠的供體細(xì)胞的問題。通過具有無限增殖潛能及多能性特性的ESC及iPSC定向分化成RPE細(xì)胞，有望解決供體細(xì)胞來源問題。

在ESC分化成RPE的過程中，尼克酰胺（nico?tinamide，vitamin B3，NIC）具有重要的正向作用。NIC存在時，Activin A能夠在4周內(nèi)有效地誘導(dǎo)和促進(jìn)ESC分化為RPE細(xì)胞。研究［5］表明，通過在適當(dāng)時間聯(lián)合使用視網(wǎng)膜誘發(fā)因子（IGF1，Noggin，Dkk1和bFGF）和其他因子（NIC，Activin A，SU5402，血管活性腸肽），多能干細(xì)胞能夠有效地定向分化成RPE細(xì)胞。Pmel17表達(dá)可使定向分化有效率高達(dá)80%以上。重要的是，早在分化開始后14 d，這些分化的RPE細(xì)胞就可以從干細(xì)胞分離出來以備使用。人包皮或腹部成纖維細(xì)胞具有維持人類ESC長期培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化的潛能，可以作為滋養(yǎng)細(xì)胞用于ESC定向分化成具有特征性形態(tài)和分子標(biāo)志物的RPE細(xì)胞［6］。這些培養(yǎng)技巧及培養(yǎng)方式的改進(jìn)對于快速生成移植所需的充足、高質(zhì)量的RPE細(xì)胞有著極為重要的意義。

2　誘導(dǎo)過程的標(biāo)志與調(diào)控

在RPE分化中，miRNA下調(diào)與RPE特異基因上調(diào)相互關(guān)聯(lián)［7］。有研究者希望通過mRNA和miRNA轉(zhuǎn)錄譜找出影響RPE定向分化的一組RPEmRNA和miRNA標(biāo)志基因。為了解RPE分化過程中DNA甲基化所扮演的角色，研究者通過簡化代表性重亞硫酸鹽序列的方法檢測基因組DNA甲基化模式，發(fā)現(xiàn)ESC/ iPSC在分化成RPE過程中甲基化及去甲基化呈4個階段的動態(tài)波動。對DNA甲基化和RPE轉(zhuǎn)錄進(jìn)行整合分析，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化與miRNA和mRNA基因的亞型表達(dá)之間存在反向關(guān)聯(lián)。基因本體論（gene ontolo?gy，GO）分析表明，發(fā)生動態(tài)甲基化改變的基因與RPE的分化和成熟有關(guān)。因此，DNA甲基化水平可以在一定程度上用來闡釋人體多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為功能性RPE細(xì)胞的分化狀態(tài)［8］。

細(xì)胞源性的微泡（microvesicles，MVs）被認(rèn)為是細(xì)胞間聯(lián)系的重要組成部分。將體外培養(yǎng)的人類Muller細(xì)胞每48 h連續(xù)暴露在鼠的ESC源性MVs（ESMVs）中，連續(xù)處理9次后，光鏡下可見處理組細(xì)胞發(fā)生明顯形態(tài)學(xué)變化，出現(xiàn)孤立的異形性細(xì)胞，而未處理組細(xì)胞呈均勻紡錘狀融合成片。ESMVs能夠?qū)⒕S持ESC多能性的mRNA轉(zhuǎn)入到Muller細(xì)胞內(nèi)［9］。

3　ESC眼部視網(wǎng)膜細(xì)胞定向分化及移植的相關(guān)動物模型

目前，在AMD和Stargardt病這類視網(wǎng)膜變性疾病的動物模型眼視網(wǎng)膜下腔進(jìn)行RPE細(xì)胞移植的主要方法為在視網(wǎng)膜下腔推注hESC?RPE細(xì)胞懸液或植入hESC?RPE單層細(xì)胞植片。

3.1ESC眼部視網(wǎng)膜細(xì)胞定向分化相關(guān)動物實驗

由光感受器缺失造成的不可逆失明臨床上可望應(yīng)用細(xì)胞替代療法治療。有研究表明，通過移植從分娩后幼鼠視網(wǎng)膜分離的光感受器前體細(xì)胞，可使視覺障礙的成年小鼠恢復(fù)部分視力。GONZALEZ?CORDERO等［10］采用三維分化的方式從小鼠的ESC中生成了神經(jīng)視網(wǎng)膜，分離光感受器前體細(xì)胞以用于移植，并采用Rhop.GFP選擇標(biāo)記視桿前體細(xì)胞，證實其可以與成年視網(wǎng)膜變性小鼠的視網(wǎng)膜整合，在局部可進(jìn)一步分化為成熟的含有外界膜盤的光感受器細(xì)胞；并提出發(fā)育階段的ESC衍生的光感受器前體細(xì)胞與胎鼠生后4～8 d的光感受器細(xì)胞相似，比在其他階段的細(xì)胞整合效率更高。

徐國彤等［3］的研究表明，在RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔移植rESC分化的視網(wǎng)膜前體細(xì)胞（retinal progeni?tor cells，RPC），不僅移植細(xì)胞可以在局部存活，而且在移植早期即發(fā)揮了保護(hù)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能的作用；在體外延長貼壁培養(yǎng)rESC來源的RPC的時間，僅能在移植后4周時輕度增加RCS大鼠視網(wǎng)膜ERG b?波的波幅，而在體外懸浮培養(yǎng)一定時間的rESC?RPC細(xì)胞卻能夠產(chǎn)生明顯的神經(jīng)元分化，移植后可顯著地改善RCS大鼠的視覺功能。

在ESC培養(yǎng)和分化過程中，人類ESC與鼠ESC存在一定的區(qū)別。ESC體外培養(yǎng)分化可以形成視杯結(jié)構(gòu)，人源性ESC分化的視杯結(jié)構(gòu)比鼠ESC來源的視杯結(jié)構(gòu)大，人源性ESC體外分化培養(yǎng)的神經(jīng)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)很厚，而且會在頂部凸起部分自發(fā)卷曲，這在鼠的ESC培養(yǎng)分化中是看不到的。另外，人ESC源性神經(jīng)視網(wǎng)膜可以分化出包含視錐和視桿的多層組織，而在鼠的培養(yǎng)中卻幾乎不能得到視錐的分化［11］。這些都體現(xiàn)了物種之間的差異，也為基礎(chǔ)研究與臨床研究的結(jié)合起到了警示作用。

3.2眼部視網(wǎng)膜細(xì)胞移植相關(guān)動物實驗

ESC阻礙ESC應(yīng)用于臨床的核心問題就是潛在腫瘤形成的可能性。中國的研究者［12］對移植于小鼠視網(wǎng)膜變性模型中的多種ESC?RPCs進(jìn)行評估，并對其全基因組基因的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路介導(dǎo)的TCF7表達(dá)對成瘤性的調(diào)控具有關(guān)鍵作用。TCF7能夠直接誘導(dǎo)Sox2和巢蛋白的表達(dá)。小鼠視網(wǎng)膜下腔移植的ESC?RPCs細(xì)胞內(nèi)Sox2和巢蛋白的表達(dá)上調(diào)，可以顯著降低移植細(xì)胞的成瘤性，提高移植細(xì)胞與視網(wǎng)膜的整合能力，并有效阻止小鼠的進(jìn)行性視力減退。提示W(wǎng)nt信號是ESC?RPCs致瘤性以及影響治療性功能的重要因素。

4　研究者應(yīng)繼續(xù)關(guān)注的相關(guān)問題

ESC研究一直是一個頗具爭議的領(lǐng)域。支持者認(rèn)為，此類研究有助于解決很多疑難雜癥，因為ESC可以分化成多種功能的多能細(xì)胞，被認(rèn)為是挽救生命的嘗試，是科學(xué)進(jìn)步的表現(xiàn)。然而，反對者認(rèn)為，進(jìn)行ESC研究就必須破壞胚胎，而胚胎是人尚未成形時在子宮內(nèi)的生命形式，這會產(chǎn)生倫理問題，例如胚胎在植入前，是否應(yīng)該與發(fā)育完善的人類具有相同的道德或者法律地位［13］。

目前，ESC研究已成為熱點，而iPSC更是科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的尖端領(lǐng)域。大量的動物和人類iPSC實驗針對視網(wǎng)膜細(xì)胞移植治療中移植細(xì)胞的安全性以及患者特異性、疾病特異性iPSC的安全性進(jìn)行了廣泛而深入的研究，為未來iPSC的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。視網(wǎng)膜是研究神經(jīng)再生的最佳模型。1項通過視網(wǎng)膜下電子假體進(jìn)行視覺修復(fù)的臨床試驗表明，即使是存在嚴(yán)重變性病變的視網(wǎng)膜組織也可以在細(xì)胞移植后通過視覺系統(tǒng)的潛在可塑性擁有修復(fù)的能力。iPSC成功分化成神經(jīng)視網(wǎng)膜組織及體外由人ESC分化形成視杯的成功案例增加了為人體臨床試驗提供可大量增殖、適應(yīng)性強(qiáng)的細(xì)胞來源的可行性。在今后ESC眼部定向分化的基礎(chǔ)以及臨床試驗中，利用iPSC衍生視網(wǎng)膜細(xì)胞作為臨床治療的可靠模型，以及將iPSC作為遺傳性視網(wǎng)膜疾病患者進(jìn)行臨床細(xì)胞移植治療的細(xì)胞來源，有著無限的發(fā)展前景。

［1］BETHESDA MD.What are embryonic stem cells?NIH Stem Cell Information Home Page.In Stem Cell Information［EB/OL］.［2016?09?21］http：//stemcells.nih.gov/info/basics/3.htm.

［2］SONG MJ，BHARTI K.Looking into the future：using induced plu?ripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling［J］.Brain Res，2016，1638（Pt A）：2-14.DOI：10.1016/j.brainres.2015.12.011.

［3］QU Z，GUAN Y，CUI L，et al.Transplantation of rat embryonic stem cell?derived retinal progenitor cells preserves the retinal structure and function in rat retinal degeneration［J］.Stem Cell Res Ther，2015，6：219.DOI：10.1186/s13287?015?0207?x.

［4］MELLOUGH CB，SERNAGOR E，MORENO?GIMENO I，et al.Effi?cient stage?specific differentiation of human pluripotent stem cells toward retinal photoreceptor cells［J］.Stem Cells，2012，30（4）：673-686.DOI：10.1002/stem.1037.

［5］BUCHHOLZ DE，PENNINGTON BO，CROZE RH，et al.Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium［J］.Stem Cells Transl Med，2013，2（5）：384-393.DOI：10.5966/sctm.2012?0163.

［6］ZHANG YS，LU ZY，YU Y，et al.Derivation，culture and retinal pig?ment epithelial differentiation of human embryonic stem cells using human fibroblast feeder cells［J］.J Assist Reprod Genet，2012，29（8）：735-744.DOI：10.1007/s10815?012?9802?2.

［7］HU G，HUANG K，YU J，et al.Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells［J］.PLoS One，2012，7（7）：e37224.DOI：10.1371/journal. pone.0037224.

［8］LIU Z，JIANG R，YUAN S，et al.Integrated analysis of DNA methyl?ation and RNA transcriptome during in vitro differentiation of hu?man pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells［J］. PLoS One，2014，9（3）：e91416.DOI：10.1371/journal.pone.009141 6.

［9］KATSMAN D，STACKPOLE EJ，DOMIN DR，et al.Embryonic stem cell?derived microvesicles induce gene expression changes in Müller cells of the retina［J］.PLoS One，2012，7（11）：e50417.DOI：10.1371/journal.pone.0050417.

［10］GONZALEZ?CORDERO A，WEST EL，PEARSON RA，et al.Pho?toreceptor precursors derived from three?dimensional embryonic stem cell cultures integrate and mature within adult degenerate ret?ina［J］.Nat Biotechnol，2013，31（8）：741-747.DOI：10.1038/ nbt.2643.

［11］NAKANO T，ANDO S，TAKATA N，et al.Self?formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs［J］. Cell Stem Cell，2012，10（6）：771-785.DOI：10.1016/j.stem.2012. 05.009.

［12］CUI L，GUAN Y，QU Z，et al.WNT signaling determines tumorige?nicity and function of ESC?derived retinal progenitors［J］.J Clin In?vest，2013，123（4）：1647-1661.DOI：10.1172/JCI65048.

［13］NAKAYA AC.Biomedical ethics［M］.San Diego：Reference Point Press，2011：96.

（編輯王又冬）

Differentiation of Pluripotent Stem Cells into Retinal Pigment Epithelium：Progress and Application

YAN Tingyu，KONG Jun
（Department of Ophthalmology，The Fourth Affiliated Hospital，The Eye Hospital，China Medical University，Lens Science Research Key Laboratory of Liaoning Prov?ince，Shenyang 110005，China）

Eye is a type of sense organ enriched of nerves and histiocytes.In developed countries，retinal degeneration disorders such as age?relat?ed macular degeneration are the leading causes of irreversible vision loss.Dysfunction and damage of retinal pigment epithelium（RPE）and other related cells are the pathophysiological basis.So far，there was no efficient treatment to reverse the vision loss of this kind of diseases.The ongoing clinical trials of cell transplantation and genetic therapy are promising regimens in the future.Directed differentiation of embryonic stem cells（ESC）and induced pluripotent stem cells（iPSC）provides the possibility for the cell transplantation therapy，since these cells can be induced to almost all kinds of cells both in vitro and vivo.We summarized the progress and prospects in the field of inducing ESCs and iPSCs to differentiate into retina cells.

embryonic stem cell；induced pluripotent stem cell；eye；differentiation；retinal degeneration

R774.1

A

0258-4646（2016）11-0961-03

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.11.001

沈陽市科技局國際科技合作項目（140784）

顏廷宇（1991-），女，碩士研究生.

孔珺，E-mail：kongjun@hotmail.com

2016-09-12

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