子宮內(nèi)膜異位癥在位子宮內(nèi)膜間質及腺上皮細胞高純度分離培養(yǎng)技術的改進

余莎，謝梅青

（1.廣東省深圳市第二人民醫(yī)院 婦科，廣東 深圳 518000；2.中山大學附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510120）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosos, EMs）體外模型是研究其發(fā)病機制及探討新的治療方法的工具。模型可分為兩種，一種是在體模型，還有一種是離體模型。由于人子宮內(nèi)膜間質細胞及腺上皮細胞還沒成功建立體系，因此，原代培養(yǎng)成為了EMs的重要體外研究方法?，F(xiàn)今，和腺上皮以及宮內(nèi)膜間質分離培養(yǎng)的相關文獻非常的多[1]，但未檢索到比較EMs在位子宮內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜分離培養(yǎng)方法差異的文獻。本研究的目的是對EMs患者在位子宮內(nèi)膜腺上皮及間質細胞進行高純度分離、培養(yǎng)，從而對子宮內(nèi)膜細胞常規(guī)培養(yǎng)方法做出改進。

1 資料與方法

1.1 臨床資料及子宮內(nèi)膜組織標本的獲取

隨機選取2007年7月-2012年3月在深圳市第二人民醫(yī)院及中山大學附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科住院治療的手術患者共12例，年齡25～40歲，分為EMs組和正常組。EMs組選擇有不孕癥史的因子宮腺肌病或卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫手術治療的患者7 例，所有病例均經(jīng)腹腔鏡或開腹手術確診，分期不限；正常組選擇已正常生育的非子宮內(nèi)膜異位癥、非子宮內(nèi)膜病變及非惡性腫瘤的入院手術患者5例。所有患者術前3個月未使用激素類藥物，行腹腔鏡術之前，通過患者的陰道取樣，或者直接對切除的子宮進行刮取，將采集的子宮內(nèi)膜立刻置于無菌的5 ml磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline, PBS）離心管中，并且轉移到實驗室，在低溫下進行分離培養(yǎng)。經(jīng)術后病理檢查，患者的子宮內(nèi)膜都沒有發(fā)生病變，獲取子宮內(nèi)膜樣本及所需操作均在術前取得患者同意。

1.2 主要試劑及儀器

D-MEM/F-12培養(yǎng)基及膠原酶I（Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶以及多孔板等（Corning公司）；倒置顯微鏡（Leica公司，DMi1），400目不銹鋼篩網(wǎng)（博理醫(yī)療儀器有限公司），立可靈一次性宮腔組織吸引管（上海家寶醫(yī)學保健科技有限公司，C3.1型），二氧化碳（CO2）細胞培養(yǎng)箱（Thermo公司，3429型），低速離心機（北京醫(yī)用離心機廠，DT5-1B）；小鼠抗人波形蛋白單抗、小鼠抗人角蛋白單抗、即用型鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物（streptavidin-biotin-peroxidase complex method, SABC）免疫組化染色試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺3（3'-diaminobenzidine, DAB）（武漢博士德公司）。

1.3 方法

1.3.1 子宮內(nèi)膜腺上皮及間質細胞的分離及培養(yǎng) ①在無菌操作的條件下，使用PBS液清洗子宮內(nèi)膜，共計3次；除去血塊及黏液，將子宮內(nèi)膜組織剪成大小約為0.5～1.0 mm3碎塊。②加入2.5～5.0 倍體積的0.1%膠原酶I，混勻37℃水浴60～120 min（EMs組標本120 min，正常組標本60～90 min）。③經(jīng)步驟②處理后，使用規(guī)格為38 mm的過濾網(wǎng)進行過濾，并且把濾液以1 000 r/min的速度進行離心，時長為5 min。經(jīng)離心處理后，摒棄上層清液，下層的沉淀主要成分為間質細胞；把過濾網(wǎng)上殘留的物質進行漂洗并收集，然后進行離心處理，摒棄上層清液，下層的沉淀主要成分為腺上皮細胞團。④ 使用細胞計數(shù)器進行細胞計數(shù)后，將混有間質細胞的沉淀液以5×105/ml接種于加有培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶內(nèi)。再將混有腺上皮細胞團的沉淀液以400 個 / cm2接種于加有培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶內(nèi)。⑤EMs組間質細胞標本在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)30 min，正常組間質細胞標本在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)45～60 min之后，摒棄懸浮在上方的腺上皮細胞和細胞，再次分別將培養(yǎng)液加入其中。⑥正常組腺上皮細胞標本在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)120～150 min，EMs組腺上皮細胞標本在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)90～120 min，之后吸出懸浮在上層的腺上皮細胞團和細胞，并且將其轉移到加有培養(yǎng)液的新培養(yǎng)瓶中或直接種到6孔板及24孔板中。⑦置于CO2體積分數(shù)為5%并且溫度為37℃的孵箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)1 d后更換培養(yǎng)液，之后每隔2、3 d再更換1次。

正常組子宮內(nèi)膜腺上皮及間質細胞分離培養(yǎng)主要參照唐雪蓮[2]的方法，本實驗中對EMs組子宮內(nèi)膜腺上皮及間質細胞分離培養(yǎng)進行了如下改良：相比正常組，延長EMs組消化時間30～60 min（步驟②），縮短了其后的貼壁等待時間約15～30 min（步驟⑤、⑥）。

1.3.2 子宮內(nèi)膜腺上皮及間質細胞的形態(tài)與純度鑒定 ①將細胞置于倒置顯微鏡下，觀察上述細胞的形態(tài)學差異。②用小鼠抗人波形蛋白單抗、小鼠抗人角蛋白單抗對腺上皮細胞及間質細胞分別進行免疫染色，操作按照說明書進行。其中小鼠抗人波形蛋白單抗、小鼠抗人角蛋白單抗的工作濃度均為1∶100。

1.3.3 子宮內(nèi)膜腺上皮及間質細胞的傳代 原代細胞鋪滿瓶底后，進行傳代，向瓶內(nèi)加入0.125%胰酶加0.02%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA），室溫下消化2 min，加入含10%胎牛血清的D-MEM/F-12培養(yǎng)基終止反應。用吸管將細胞自瓶底吹下并使其呈均勻混懸液。將細胞懸液以1 000 r/min離心5 min，棄去上清，加入含10%胎牛血清的D-MEM/F-12培養(yǎng)基，將細胞吹勻，按1傳3的比例進行傳代培養(yǎng)。

2 結果

2.1 細胞培養(yǎng)結果

12例子宮內(nèi)膜標本中10例培養(yǎng)成功，2例培養(yǎng)失敗。其中，1例是因為細菌污染所致，1例是因為細胞量過少所致。經(jīng)原代培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細胞，在接種1 d之后，基本能貼壁。接種4～7 d，腺上皮細胞鋪滿；接種3～7 d間質細胞鋪滿，細胞存活率≥90%。

2.2 對間質細胞培養(yǎng)過程的觀察

EMs組間質細胞貼壁較快，約15 min后開始逐漸貼壁；正常組約30 min后開始貼壁，2 h后大部分貼壁；EMs組和正常組子宮內(nèi)膜間質細胞在體外生長時外觀特征相似。兩組間質細胞均呈梭形，紡錘狀，折光性強，胞質薄而透明，核橢圓，長期培養(yǎng)后細胞延伸為長梭形，相互平行排列成束。兩組原代培養(yǎng)的間質細胞純度相當高，幾乎見不到腺上皮細胞團，偶見的小團樣生長腺上皮細胞經(jīng)傳代1、2代亦可去除純化。間質細胞易被傳代，生存期長，10代以內(nèi)其形態(tài)基本不變。

2.3 對腺上皮細胞培養(yǎng)過程的觀察

EMs組腺上皮細胞團貼壁較快，約90 min后開始逐漸貼壁；正常組約2 h后開始貼壁，24 h后均貼壁良好。EMs組和正常組子宮內(nèi)膜腺上皮細胞在體外生長時外觀特征相似。兩組腺上皮細胞胞質飽滿，核大圓，核仁明顯，細胞多數(shù)形態(tài)為星形、多角形，形狀不規(guī)則，呈旋渦狀成團生長。腺上皮細胞團中偶見間質細胞插入性生長，較散在。培養(yǎng)瓶中腺上皮細胞約占細胞總數(shù)92%～98%。兩組腺上皮細胞均能傳1、2代，傳代后細胞數(shù)量逐漸減少。

2.4 消化時間及貼壁時間不同對兩組細胞生長的影響

本實驗發(fā)現(xiàn)在使用膠原酶I消化兩組細胞時，正常組標本消化60～90 min，正常組的子宮內(nèi)膜腺上皮細胞和間質細胞可以達到較好的分離效果，但是，如果采用與正常組相同的消化時間EMs組只能得到數(shù)量很少的腺上皮和間質細胞（少于正常組的30%）。考慮消化時間不夠，延長EMs組標本消化120 min后，間質細胞及腺上皮細胞純度增加。

正常組間質細胞標本在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)45～60 min之后，間質細胞純度較高。如果采用與正常組相同的貼壁時間，EMs組只能得到純度較低的間質細胞（混有較多的腺上皮細胞）。考慮貼壁時間較長，一部分腺上皮也已貼壁。故減少培養(yǎng)時間，EMs組間質細胞標本在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)30 min之后，間質細胞純度明顯提高。

正常組腺上皮細胞標本在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)120～150 min之后，間質細胞基本全部貼壁，懸浮液中腺上皮純度較高。如果采用與正常組相同的貼壁時間，EMs組只能得到數(shù)量很少的腺上皮細胞。考慮貼壁時間較長，大部分腺上皮細胞也已貼壁，懸浮液中腺上皮細胞剩余較少。故減少培養(yǎng)時間，EMs組腺上皮細胞標本在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)90～120 min，腺上皮細胞數(shù)量明顯提高。

2.5 細胞純度鑒定

對EMs組子宮內(nèi)膜細胞使用改進后的分離培養(yǎng)方法后，分別取得EMs組間質細胞及腺上皮細胞原代細胞。用對腺上皮細胞特異的細胞角蛋白單克隆抗體標記腺上皮細胞，對間質細胞特異的波形蛋白單克隆抗體標記間質細胞，原代培養(yǎng)的EMs組腺上皮細胞角蛋白染色陽性，純度率約95%；原代培養(yǎng)的EMs組間質細胞行波形蛋白染色呈陽性反應，細胞純度率可達97%以上。

3 討論

子宮內(nèi)膜細胞的原代培養(yǎng)，其生物學特性未發(fā)生很大變化，仍具有二倍體遺傳物性。體外原代培養(yǎng)EMs患者的在位以及異位子宮內(nèi)膜細胞，能夠將細胞在組織原位信息，當作是研究子宮內(nèi)膜細胞的代謝、分化以及生長的實驗模型，能夠為異位癥的臨床研究與治療提供依據(jù)。根據(jù)經(jīng)血逆流致病學說，發(fā)生EMs的組織是子宮內(nèi)膜。有學者指出，體外培養(yǎng)子宮內(nèi)膜細胞，實際上是模擬EMs[3]。經(jīng)研究證實，對子宮異位患者的內(nèi)膜進行體外培養(yǎng)，內(nèi)膜細胞的生化活性以及內(nèi)膜細胞和在為內(nèi)膜細胞的相似；和異位子宮的內(nèi)膜細胞相比較，在為子宮的內(nèi)膜細胞更容易獲取足夠的標本量，所以，利用EMs患者在位子宮的內(nèi)膜進行分離培養(yǎng)，所得到的間質細胞和腺上皮細胞可以當做EMs的體外模型。

關于子宮內(nèi)膜間質及腺上皮細胞的分離培養(yǎng)有較多文獻報道[4-7]，但子宮內(nèi)膜異位癥在位子宮內(nèi)膜細胞培養(yǎng)參考文獻不多[8]，并且未檢索到比較正常子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜異位癥在位子宮內(nèi)膜分離培養(yǎng)方法差異的文獻。在現(xiàn)有關于子宮內(nèi)膜異位癥在位子宮內(nèi)膜細胞培養(yǎng)的報道中，細胞純度尤其是腺上皮細胞純度不高[9-12]。雖然譚先杰等[13]報道的方法分離兩種細胞純度較高，但操作步驟復雜，4次篩網(wǎng)分離及用牛血清白蛋白梯度離心的方法增加了污染的可能性。李傲等[14]報道將膠原酶的濃度提高，用量加大，可提高兩類細胞的產(chǎn)量。這里筆者參考唐雪蓮等[2]的子宮內(nèi)膜簡易分離法并加以改進。在實驗中筆者發(fā)現(xiàn)EMs組子宮內(nèi)膜消化時間需長于正常組，同時前者兩種細胞貼壁均快于后者。Klemmt等[15]也發(fā)現(xiàn)EMs患者在位及異位子宮內(nèi)膜較正常子宮內(nèi)膜的黏附能力增加。在同樣的處理時間60～90 min下相比正常組，EMs組用膠原酶消化不夠完全，仍然有較大的組織塊存在，增加后續(xù)的分離困難。而當延長消化時間至120 min后，內(nèi)膜組織消化較完全。EMs組分離間質細胞時，若采用正常組的貼壁時間45～60 min因已有部分腺上皮細胞貼壁而致純度下降；分離腺上皮細胞時，若采用正常組的貼壁時間120～150 min因腺上皮細胞貼壁快而在之后的上清液中所剩無幾，故筆者采取了延長EMs組的消化時間（較正常組長30～60 min），并減少其后的貼壁等待時間（較正常組減少15～30 min），使盡可能少的腺上皮細胞貼壁而純化間質細胞；多放培養(yǎng)皿增加接觸面積，使在較短貼壁時間內(nèi)（較正常組減少30～60 min）盡可能多的間質細胞貼壁和盡可能少的腺上皮細胞貼壁從而獲得盡可能多的腺上皮細胞。分離過程簡便，按不同貼壁時間分離獲得的EMs組和正常組的腺上皮和間質細胞純度及活性均高，可作為子宮內(nèi)膜異位癥在位子宮內(nèi)膜細胞常規(guī)培養(yǎng)方法的改進。

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