高通量測序技術(shù)在遺傳性疾病實驗診斷中的應(yīng)用

吳丹 黃歡 孫麗洲

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 產(chǎn)科，江蘇 南京 210029)

高通量測序技術(shù)在遺傳性疾病實驗診斷中的應(yīng)用

吳丹 黃歡 孫麗洲*

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 產(chǎn)科，江蘇 南京 210029)

高通量測序技術(shù)(high-throughput sequencing)又稱“下一代”測序技術(shù)，具有高準(zhǔn)確性、高靈敏性以及高性價比的絕對優(yōu)勢，對于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)和疾病研究而言是一次革命性的改變，對遺傳性疾病的診斷和篩查起著非常關(guān)鍵的作用。本文介紹了高通量測序技術(shù)的作用原理，回顧新一代測序在遺傳性疾病臨床分子診斷實驗室中的應(yīng)用。隨著高通量測序技術(shù)的繼續(xù)發(fā)展和個性化醫(yī)療的不斷普及，不但會給生命科學(xué)研究帶來更多的資源和便利，而且將對改善人類健康及生活質(zhì)量起到巨大的作用。

高通量測序技術(shù)；遺傳性疾病；實驗分子診斷

DNA測序(DNA sequencing)即指測定組成DNA分子的核苷酸A、T、C、G的排列順序。

DNA測序作為一種重要的實驗技術(shù)，極大地推動了分子生物學(xué)的發(fā)展，是分子生物學(xué)中最常用的研究技術(shù)之一。以Sanger法為代表的第一代測序技術(shù)幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組圖譜等大量測序工作，但由于其存在成本高、速度慢、通量低等不足，并不是后基因組時代最理想的測序方法。因此，為了滿足研究的需要，第二代測序技術(shù)出現(xiàn)了，目前化較成熟的高通量測序技術(shù)主要包括羅氏公司的454 測序技術(shù)、Illumina 公司的Solexa測序技術(shù)以及ABI 公司的SOLiD測序技術(shù)3個主要測序平臺[1]。但第二代測序技術(shù)仍有缺點，如讀長較短，給后續(xù)的序列拼接、組裝以及注釋等生物信息學(xué)分析帶來困難，該技術(shù)原理建立在PCR 的基礎(chǔ)上，DNA 分子片段的數(shù)目比例在擴(kuò)增前后有相對偏差，在一定程度上影響了基因表達(dá)分析，尤其是對大量表達(dá)的基因。這些缺點相對制約了第二代測序技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展，因此第三代單分子測序技術(shù)應(yīng)運而生。因第三代測序技術(shù)采用單分子讀取技術(shù)，有著更快的數(shù)據(jù)讀取速度，同時不需要PCR 擴(kuò)增步驟，進(jìn)一步降低了測序成本?，F(xiàn)有的第三代測序平臺主要有Helicos biosciences公司的tSMSTM(true single molecular sequencing)技術(shù)平臺、美國Pacific Biosciences 公司的SMRT (single molecule real-time)技術(shù)平臺、美國Life Technologies 公司的基于FRET 測序技術(shù)和美國Ion Torrent 公司、英國Oxford NanoporeNechnologies公司的納米孔單分子技術(shù)[2]。本文主要對高通量測序技術(shù)作簡要介紹，并且回顧新一代高通量測序技術(shù)在遺傳性疾病臨床分子診斷實驗室中的應(yīng)用情況。

1 高通量測序技術(shù)簡介

高通量測序技術(shù)是一次性對幾百萬到十億條DNA分子進(jìn)行并行測序，又稱為下一代測序技術(shù)，其可對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行深入、細(xì)致、全貌地分析，所以又被稱為深度測序。該技術(shù)大都采用了大規(guī)模矩陣結(jié)構(gòu)的微陣列分析技術(shù)-陣列上的DNA樣本可以被并行分析，測序主要利用DNA聚合酶或DNA連接酶和引物對模板鏈進(jìn)行一系列的延伸，并且通過精細(xì)設(shè)備觀察并記錄連續(xù)測序過程中的光學(xué)信號。它的特點包括：①通過有序活化或者無序的陣列可以實現(xiàn)大規(guī)模的并行化，以提供高程度的信息密度；②不采用電泳，設(shè)備易于微型化，大大降低了樣本和試劑的消耗量[3]。高通量測序技術(shù)不僅可以用于全基因組測序、轉(zhuǎn)錄組和基因表達(dá)調(diào)控研究、DNA 和蛋白質(zhì)相互作用研究以及基因組DNA甲基化分析[4]，也有助于疾病的診斷及管理[5]。隨著高通量測序技術(shù)的不斷成熟和費用的逐步降低, 測序技術(shù)也逐漸從科研走向臨床，為臨床上的一些遺傳性疾病的研究提供了重要的分子依據(jù)。

2 在遺傳性疾病實驗診斷中的應(yīng)用

2.1 高通量DNA測序技術(shù)應(yīng)用于唐氏綜合征無創(chuàng)性產(chǎn)前檢查(non-invasive prenatal testing，NIPT) 胎兒染色體非整倍體異常是孕婦需要進(jìn)行產(chǎn)前診斷的主要原因之一，21-三體是胎兒非整倍體異常的最常見類型，每年的發(fā)病率為1/800～1/600[6]。孕婦血清標(biāo)志物-甲胎蛋白(AFP)、游離雌三醇(μE3)和絨毛膜促性腺激素(β-HCG)是目前國內(nèi)臨床應(yīng)用比較廣泛的唐氏綜合征孕中期產(chǎn)前篩查的3 項指標(biāo)，通過這3項指標(biāo)水平間接反應(yīng)胎兒的情況，缺點是會出現(xiàn)一定的假陽性和假陰性。傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷技術(shù)如絨毛、羊水和臍血細(xì)胞培養(yǎng)和核型分析有一定的流產(chǎn)率，在實際應(yīng)用中給孕婦帶來了一定的傷害和心理負(fù)擔(dān)[7]。

2.1.1 NIPT的簡要發(fā)展史 1997年香港中文大學(xué)盧煜明教授發(fā)現(xiàn)母體外周血漿中存在游離胎兒DNA，可以作為非創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷的理想材料，并于1999 年發(fā)現(xiàn)唐氏綜合征的母體血漿中胎兒游離DNA的平均濃度要顯著高于正常組，這是最早將胎兒游離DNA 應(yīng)用于唐氏綜合征診斷的研究。隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，大規(guī)模并行基因組測序技術(shù)能夠檢測大量的DNA 片段，已應(yīng)用于胎兒性別鑒定、父源性血型基因檢測、檢測胎兒非整倍體病的診斷等研究。2008年，盧煜明教授等人[8]應(yīng)用高通量DNA測序技術(shù)對唐氏綜合征進(jìn)行無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷，結(jié)果特異性較高，假陽性率較低。2010 年Chiu RW等[9]認(rèn)為該技術(shù)對于診斷21-三體是高效、準(zhǔn)確的，但對于18 和13-三體的診斷需要提高精準(zhǔn)性。2011年Chen EZ等[10]結(jié)合生物信息學(xué)分析技術(shù)，對13-三體和18-三體檢測的特異性分別達(dá)到了98.9% 及98.0%，充分論證了該技術(shù)診斷13-三體和18-三體的可行性。同年香港中文大學(xué)、英國倫敦國王學(xué)院醫(yī)院(King＇s College Hospital)、深圳華大基因的研究人員在BMJ雜志報道[11]，應(yīng)用MPGS 檢測母血cffDNA序列，發(fā)現(xiàn)無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測的靈敏度為100%，特異度為97.9%，陽性預(yù)測值為96.6%，陰性預(yù)測值為100%。2012 年Dan S等[12]對11 105 例中國孕婦進(jìn)行胎兒游離DNA 高通量測序分析，結(jié)果190例陽性，其中143例21-三體，47例18-三體，核型研究最終發(fā)現(xiàn)1例21-三體假陽性，1例18-三體假陽性，假陰性率為0，對21-三體和18-三體檢測的敏感度為100%，特異性為99. 96%。再次驗證了高通量基因測序技術(shù)對于檢測21-三體和18-三體具有高敏感性和特異性，該技術(shù)作為產(chǎn)前篩查可以避免98% 的有創(chuàng)產(chǎn)前診斷。Lo YM[13]認(rèn)為提取母體外周血中胎兒游離DNA進(jìn)行大規(guī)?；虿⑿袦y序技術(shù)，在未來的產(chǎn)科實踐中扮演著越來越重要的角色，該技術(shù)在倫理學(xué)、社會學(xué)和法律方面都具有無比的優(yōu)越性。2013 年Chiu RW[14]前瞻性地提出最有可能大規(guī)模應(yīng)用于21-三體綜合征的產(chǎn)前篩查是高通量基因測序技術(shù)。胎兒染色體非整倍體異常是造成產(chǎn)前診斷的主要原因，大規(guī)模并行測序技術(shù)為所有孕婦提供了一種檢測該疾病的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷方法[15]。

2.1.2 NIPT的假陽性率 2015年發(fā)表在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》上的3項新的研究[16-18]同時表示NIPT測試應(yīng)謹(jǐn)慎用于包括高妊娠風(fēng)險孕婦在內(nèi)的全部孕婦。研究發(fā)現(xiàn)NIPT假陽性結(jié)果的風(fēng)險相當(dāng)可觀，如果孕婦不進(jìn)行診斷確診，很可能導(dǎo)致妊娠終止。盡管NIPT測試具有高敏感性和高特異性，這項技術(shù)仍然只應(yīng)該應(yīng)用于篩查而不是對胎兒核型的診斷與確認(rèn)。由華盛頓大學(xué)團(tuán)隊領(lǐng)導(dǎo)的研究[17]深入分析了NIPT可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果的原因之一，那就是母親基因組中存在拷貝數(shù)變異。這項研究由加州大學(xué)舊金山分校領(lǐng)導(dǎo)，涉及到16 000名女性。為了研究各種無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的表現(xiàn)，貝勒和香港的研究人員重點研究了307名婦女，她們獲得了陽性的NIPT結(jié)果，包括21-三體、18-三體、13-三體、X單體、XXX、XXY或XYY，并轉(zhuǎn)診到侵入性的診斷檢測(這些結(jié)果來自Sequenom的MaterniT21和SafeT21，BGI的NIFTY、Illumina的Verifi、Natera的Panorama以及Ariosa的Harmony)。其中13個病例羊膜穿刺或絨毛膜取樣后的核型分析表明嵌合的存在。剩下294個NIPT陽性病例，19%(56個)被證明是假陽性的。其中，對于最常檢測到的21-三體，假陽性率為9%，XXX、XXY或XYY為17%，18-三體為23%，13-三體為46%，而X單體高達(dá)62%。香港中文大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)至少有8例假陽性的NIPT報告(大部分是21-三體)，但卻產(chǎn)下健康的嬰兒。NIPT產(chǎn)生假陽性結(jié)果，涉及幾個方面的原因，包括母體的體細(xì)胞嵌合、胎盤嵌合、雙胞胎消失、母親的癌癥未被檢測到以及母親的拷貝數(shù)變異。來自美國華盛頓大學(xué)研究團(tuán)隊的結(jié)果闡述了幾個可能導(dǎo)致NIPT測試產(chǎn)生假陽性結(jié)果的原因，即母體基因組在拷貝過程中存在著某些突變。在這一項研究中，他們分析了4名婦女的血液樣本。這些婦女接受了Illumina的Verifi檢測，并獲得了陽性結(jié)果，其中有3名是18-三體陽性，另一名是13-三體陽性，但是最終誕下了健康的嬰兒。對于兩名NIPT檢測結(jié)果為18-三體陽性的患者，他們在18號染色體上鑒定出重復(fù)的區(qū)域。研究人員推測，這些重復(fù)可能干擾了分析，因為18號染色體的測序讀取比其他染色體多。血液中大部分的無細(xì)胞DNA都來自母親，而母體的重復(fù)使得讀取數(shù)量增加，提高了假陽性的機(jī)會，而染色體缺失則減少了讀取數(shù)量，提高了假陰性結(jié)果的概率。這個影響取決于無細(xì)胞DNA中胎兒的比例、重復(fù)或缺失的大小、以及它是否遺傳給胎兒。有一名患者的18號染色體上有一段長達(dá)1.5 Mb的重復(fù)，并遺傳給了胎兒，故假陽性結(jié)果的概率高了16 000倍?；诳截悢?shù)變異在一般人群中的頻率，研究人員估計它們明顯提高了NIPT獲得假陽性結(jié)果的風(fēng)險。不過，若是考慮母體的拷貝數(shù)變異，風(fēng)險可降低。例如，一旦檢測到這樣的變異，則這一區(qū)域的讀取至少應(yīng)被部分丟棄，或根據(jù)需要增加或減少染色體的有效大小。英國倫敦大學(xué)學(xué)院兒童健康研究所的Lyn Chitty[19]認(rèn)為，NIPT的采用將最終“取決于當(dāng)?shù)氐奈幕蜕鐣蛩?，包括對殘疾的態(tài)度、終止妊娠的法律，以及現(xiàn)有的醫(yī)療結(jié)構(gòu)”，如現(xiàn)行的篩查項目。

國內(nèi)研究者也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象，例如林穎等[20]運用高通量測序技術(shù)檢測胎兒性染色體非整倍體，在5540 例孕婦中發(fā)現(xiàn)10例異常，G 帶核型分析只有6 例異常，發(fā)生率為0.11%，二者的符合率為60%(6 /10)，因此對于性染色體非整倍體胎兒行高通量測序存在假陽性，還需進(jìn)一步完善。

2.1.3 國家衛(wèi)生計生委等相關(guān)部門對NIPT的態(tài)度 近年來，NIPT已成為行內(nèi)熱門的話題，但由于存在一定的假陽性和假陰性率，2014年2月，國家衛(wèi)生和計劃生育委員會、食藥監(jiān)總局聯(lián)合發(fā)文，叫?；驕y序在臨床上的所有應(yīng)用，包括NIPT。2014年12月，國家衛(wèi)生和計劃生育委員會在發(fā)布第一批高通量基因測序技術(shù)臨床應(yīng)用試點單位名單時，附帶發(fā)布了《高通量基因測序產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范(試行)》[21]，審批通過了108家醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展高通量基因測序產(chǎn)前篩查與診斷(NIPT)臨床試點。這遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于此前醫(yī)政醫(yī)管局公布的NITP第三方檢驗機(jī)構(gòu)的數(shù)目，這種舉措再一次肯定了醫(yī)療機(jī)構(gòu)在未來高通量基因測序臨床應(yīng)用中的重要作用。這也是我國首個NIPT規(guī)范，是國家衛(wèi)生計生委在“叫停令”發(fā)出后，用了將近10個月時間反復(fù)商討之后確定的，這也順應(yīng)了國際上多個國家都在發(fā)布NIPT診療指南的趨勢。

2.1.4 NIPT指南 歐洲人類遺傳學(xué)學(xué)會和美國人類遺傳學(xué)學(xué)會發(fā)表聯(lián)合聲明[22, 23]對臨床實踐中的無創(chuàng)產(chǎn)前篩查(NIPT)提出了10條建議：①與現(xiàn)有的孕早期篩查方式相比，NIPT在常見的常染色體非整倍體的檢測方面有著更高的準(zhǔn)確性。然而，NIPT的陽性結(jié)果不應(yīng)該作為最終診斷：有多種原因會導(dǎo)致假陽性結(jié)果。因此對于NIPT結(jié)果為陽性的孕婦，建議在做出妊娠終止的決定前，應(yīng)建議進(jìn)行羊水穿刺等介入性診斷進(jìn)行確認(rèn)。②盡管介入性檢測率較低的NIPT篩查方式表現(xiàn)更佳，但是不能因此降低預(yù)測信息和咨詢的標(biāo)準(zhǔn)。這對于為孕婦提供有意義的生育選擇尤其重要。要特別留意其他語種、文化背景或健康知識不足的女性對信息的需求。③NIPT在應(yīng)用于特定染色體檢測的同時，也會帶來一些其他的檢測發(fā)現(xiàn)，例如其他染色體異?；虼笃蔚牟迦牖蛉笔АＷ鳛闄z測前咨詢的一部分，夫婦雙方應(yīng)該被告知會檢出除目標(biāo)疾病外其他疾病的可能性以及這些額外發(fā)現(xiàn)將會帶來的影響。針對這些額外發(fā)現(xiàn)的檢測結(jié)果，應(yīng)該制定相應(yīng)明確的處理政策以考慮受檢者是否愿意接受這些額外檢測發(fā)現(xiàn)的意愿。④將NIPT產(chǎn)前篩查擴(kuò)大到性染色體異常和微缺失不僅會引發(fā)關(guān)于信息和咨詢挑戰(zhàn)的道德問題，也可能對NIPT的非整倍體檢測的使用而大幅減少介入性檢測帶來逆向的影響。⑤胎兒異常的產(chǎn)前篩查與預(yù)防性篩查相結(jié)合可能會傳遞出含混不清的信息，造成咨詢意見不足。應(yīng)該盡可能明確清楚所有產(chǎn)前篩查活動的目的，包含不同目的的產(chǎn)前篩查應(yīng)該單獨列出。如果無法做到，起碼在提供相關(guān)信息時進(jìn)行概念性的區(qū)分。⑥對于將胎兒異常產(chǎn)前篩查列為國家公共衛(wèi)生項目的國家，政府和公共衛(wèi)生部門應(yīng)發(fā)揮積極的作用，確保NIPT作為唐氏綜合征和其他常見常染色體非整倍體篩查的第二或第一級篩查手段。這需要確保質(zhì)量控制、NIPT產(chǎn)前篩查的非實驗室因素、人才教育、篩查項目各方面的系統(tǒng)性評價、可用預(yù)算范圍內(nèi)的所有孕婦公平獲取信息和建立產(chǎn)前篩查進(jìn)一步創(chuàng)新的管理結(jié)構(gòu)。⑦NIPT篩查常見染色體非整倍體可以有多種不同的篩查模式，包括作為替代性的一線篩查檢測。如何在這些不同的篩查模式中做出選擇，不僅僅要考慮到檢測技術(shù)本身的技術(shù)指標(biāo)和衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)指標(biāo)，還應(yīng)該考慮到是否能夠?qū)υ袐D提供有意義的生育指導(dǎo)、對孕婦及其家人帶來的益處和風(fēng)險、以及篩查目標(biāo)和社會可接受的價值觀之間的平衡。⑧為了對產(chǎn)前篩查進(jìn)行充分評估，有必要進(jìn)一步促進(jìn)知情選擇以及知情選擇干預(yù)相關(guān)方法的研究及驗證。轉(zhuǎn)向基于NIPT的產(chǎn)前篩查為填補(bǔ)這一知識缺口提供了機(jī)會。⑨隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展和測序成本的不斷降低，對于未來胎兒異常的產(chǎn)前篩查范圍的專業(yè)性和社會性討論也變得尤為重要。正如文中所述，道德層面的原因是讓產(chǎn)前篩查限于嚴(yán)重先天性兒童異常，而不進(jìn)一步擴(kuò)大范圍的重要因素。⑩產(chǎn)前篩查為胎兒治療和自助生育權(quán)帶來了可能，這為探討生育自主權(quán)和父母責(zé)任關(guān)系的倫理分析提出了疑問。

鑒于國際上多個國家都發(fā)布了NIPT指南，國家衛(wèi)生和計劃生育委員會在發(fā)布第一批108家高通量基因測序試點單位的同時，發(fā)布了《高通量基因測序產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范》，該規(guī)范明確了NIPT的適用范圍，界定了NIPT在整體產(chǎn)前篩查與診斷服務(wù)體系中的合理定位，規(guī)范了臨床服務(wù)流程和質(zhì)量控制，有助于提高國內(nèi)NIPT的服務(wù)質(zhì)量和管理水平。劉俊濤教授[24]結(jié)合臨床應(yīng)用實踐，對其進(jìn)行了專業(yè)解讀。

2.2 高通量測序用于CNV，拷貝數(shù)變異 拷貝數(shù)目變異亦稱為拷貝數(shù)目多態(tài)性(copy number polymorphism，CNP)，是從1 kb至3Mb的DNA片段的亞微觀變異，表現(xiàn)為DNA片段的插入、缺失、重復(fù)等。利用全基因組擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序會檢測出大量的CNVs，有良性的、病理性的以及臨床意義不明的，這給數(shù)據(jù)的分析以及臨床應(yīng)用增加了難度。病理性CNVs是與已知的微缺失/微重復(fù)或其他臨床已知的致病的基因組片段相對應(yīng)的CNVs，可能導(dǎo)致出生缺陷、生長發(fā)育遲緩、腫瘤或神經(jīng)退行性病變等，如Prader-Willi綜合征、Miller-Dieker綜合征、DiGeorge/velocardiofacial綜合征(VCFS)、Smith-Magenis綜合征以及由于1p、4p 微缺失引起的綜合征等[25]。利用高通量測序技術(shù)可以檢測到大量的CNVs，能夠發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的G顯帶核型分析技術(shù)和FISH無法發(fā)現(xiàn)的染色體缺失、重復(fù)。傳統(tǒng)的G顯帶核型分析技術(shù)雖然是染色體異常診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是存在細(xì)胞培養(yǎng)時間長、且分辨率低、易于污染等缺點。FISH雖然顯著縮短了報告時間，約1～3天，但不能檢測全部的染色體信息[26]。Array-CGH和SNP-array是基于基因雜交技術(shù)檢測CNVs，分辨率較高，分別約1Mb和1.5Kb，但基因芯片制作難度大，成本高，且只能檢測出已知的異常，而高通量測序技術(shù)則基于全基因組測序，分辨率最高，技術(shù)穩(wěn)定性高，成本相對低，且能夠檢測出未知的異常，因此更適合進(jìn)行CNVs的檢測。

2.3 高通量測序用于單基因遺傳病檢測 目前已經(jīng)確認(rèn)的單基因隱性遺傳病有1000多種，常用的檢測技術(shù)包括基因組測序、基因芯片、液相芯片、變性高效液相色譜分析DEPLC等。高通量測序技術(shù)能以較短讀長對單基因隱性遺傳病攜帶者進(jìn)行廣譜篩查[27]，比如華大醫(yī)學(xué)采用的目標(biāo)序列捕獲+高通量測序技術(shù)，通過一套寡核苷酸探針捕獲基因組DNA中的目標(biāo)區(qū)域(基因的外顯子及剪切位點序列)，然后進(jìn)行高通量測序和生物信息學(xué)分析，獲取目標(biāo)區(qū)域的基因變異信息定位致病突變。如Sun等[28]將X染色體外顯子組捕獲測序(X-exome capture and sequencing)應(yīng)用于終端骨發(fā)育不良(terminal osseous dysplasia)的研究，通過對2例無血緣關(guān)系的患者進(jìn)行測序，確定了FLNA為其致病基因。

2.4 高通量測序用于遺傳代謝性疾病(inherited metabolic diseases，IMD) 近年來，利用高通量測序技術(shù)進(jìn)行IMD分子診斷的研究受到越來越多的關(guān)注，采用高通量進(jìn)行IMD實驗室篩查和診斷的最大特點是在一管測試中即可對幾乎所有IMD致病基因缺陷進(jìn)行檢測，省時、省力、高效，為實施 IMD早期干預(yù)和治療贏得時機(jī)。目前，NGS技術(shù)已用于肌肉型和肝型糖原貯積癥[29]、嬰兒型線粒體疾病[30]、先天性糖基化缺陷病[31]等IMD的分子缺陷研究。

2.5 高通量測序用于其他遺傳性疾病的檢測(多基因遺傳病，如耳聾、甲基丙二酸血癥、遺傳性多囊腎病基因變異) 高通量測序技術(shù)還應(yīng)用于其他遺傳性疾病的檢測，如2015年，謝楚杏、曾海生等人[32]對217例經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)(GC-MS)首次確診為遺傳性耳聾、甲基丙二酸血癥、遺傳性骨髓衰竭綜合征的患兒，應(yīng)用目標(biāo)序列捕獲結(jié)合高通量測序技術(shù)檢測其相關(guān)疾病基因。結(jié)果檢測出患兒遺傳性耳聾的致病基因為EYA4、SLC26A4、POU3F4、MYO8A、USH1C、CDH23、DFN5、TECTA，檢出率為92.11%；引發(fā)甲基丙二酸血癥的致病基因主要為甲基丙二酰輔酶A變位酶(MUT)、MMACHC基因突變，檢出率為100%；引發(fā)患兒遺傳性骨髓衰竭綜合征的致病基因為SBDS、FANCD2、RPS19、FANCG、TINF2、FANCB、ELANE，檢出率為100%，應(yīng)用目標(biāo)序列捕獲結(jié)合高通量測序技術(shù)對遺傳性耳聾、甲基丙二酸血癥、遺傳性骨髓衰竭綜合征的突變基因檢測，結(jié)果準(zhǔn)確，方便快捷。遺傳性多囊腎病通常由常染色體16p3.3區(qū)的PKD1及4q21區(qū)的PKD2兩個基因突變致病，劉維強(qiáng)等人[33]研究發(fā)現(xiàn)基因芯片靶目標(biāo)捕獲法對診斷多囊腎基因變異的具有更好的測序結(jié)果。

2.6 胚胎植入前高通量測序(PGS/PGD) 高通量測序技術(shù)在PGS/PGD領(lǐng)域的應(yīng)用報道不多。歐洲生殖年會亦對第一屆會議至第九屆會議有關(guān)PGS檢測的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計顯示胚胎染色體異常率為36%(16 784/46 589)。目前所用的取材標(biāo)本多來自囊胚期，囊胚期胚胎可以提供5～10個滋養(yǎng)層細(xì)胞，多細(xì)胞較之于單細(xì)胞易于操作，DNA樣本量亦比較充裕易于擴(kuò)增，且囊胚滋養(yǎng)外胚層活檢不涉及發(fā)育成胎兒部分的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，從而避免了活檢對胚胎所造成的不利影響，而且囊胚的嵌合體率比D3胚胎低，檢測結(jié)果更為可靠。國內(nèi)外對單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增高通量測序技術(shù)應(yīng)用于胚胎植入前遺傳學(xué)篩查的研究鮮有報道，張靜等人[34]結(jié)合基于DOP-PCR 技術(shù)原理的高保真性全基因組擴(kuò)增和高通量測序技術(shù)對植入前D3胚胎單細(xì)胞進(jìn)行染色體數(shù)目和16Mb以上缺失、重復(fù)的篩查，共檢測42枚胚胎(D3胚胎28枚，囊胚14枚)，D3優(yōu)質(zhì)胚胎單細(xì)胞染色體數(shù)目異常或者>16Mb 缺失、重復(fù)檢出率為 60.7%(17/28)，單細(xì)胞高通量測序技術(shù)基于全基因組測序可以實現(xiàn)染色體異常和單基因病的同時檢測，雖然建立時間比較短，但高度的靈敏性、準(zhǔn)確性、靈活性、運營成本低、產(chǎn)量大等特點使其顯示出巨大的優(yōu)勢，隨著該技術(shù)的進(jìn)一步完善成熟，將成為PGD/PGS的一個強(qiáng)有力的檢測手段。

3 展望

近幾年，高通量測序技術(shù)的發(fā)展突飛猛進(jìn)，其在處理速度、精確度、敏感性方面都有了質(zhì)的飛躍，已經(jīng)成為了生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)研究的重要技術(shù)手?jǐn)?。相信在不久的將來，測序技術(shù)將成為臨床檢測及治療的常規(guī)技術(shù)手段，在整個臨床研究領(lǐng)域發(fā)揮越來越大的作用。

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編輯：宋文穎

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.04.004

R714.53

A

2016-7-10)

*通訊作者：孫麗洲，E-mail：lizhou_sun@163.com