北京家族結(jié)核分枝桿菌鑒定方法的研究進(jìn)展

郭立娟 黃海榮 高飛 王桂榮

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·綜述·

北京家族結(jié)核分枝桿菌鑒定方法的研究進(jìn)展

郭立娟 黃海榮 高飛 王桂榮

結(jié)核病仍是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。北京家族結(jié)核分枝桿菌是我國(guó)大部分地區(qū)流行的主要菌株。作者論述了插入序列IS6110-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(IS6110-RFLP)、間隔區(qū)寡核苷酸分型(Spoligotyping)、長(zhǎng)序列多態(tài)性(LSP)以及單核苷酸多態(tài)性(SNP)等多種北京家族結(jié)核分枝桿菌分型技術(shù)，并討論了各技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，以便對(duì)北京家族結(jié)核分枝桿菌的鑒定提供可靠依據(jù)。

分枝桿菌，結(jié)核； 基因型

結(jié)核病(tuberculosis, TB)是伴隨人類(lèi)歷史最長(zhǎng)的疾病之一，也是全球由單一致病菌導(dǎo)致死亡人數(shù)最多的疾病，已成為全球重大公共衛(wèi)生問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題。我國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié)核病患者例數(shù)僅次于印度，居世界第二位[1]；我國(guó)也是全球27個(gè)耐多藥結(jié)核病(multiple drug resistant tuberculosis, MDR-TB) 高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一。因此，我國(guó)結(jié)核病的防治工作任重道遠(yuǎn)。結(jié)核分枝桿菌北京家族是van Soolingen 等[2]1995年首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的，它是利用插入序列IS6110-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(IS6110-RFLP)和間隔區(qū)寡核苷酸分型(Spoligotyping)方法對(duì)中國(guó)北京地區(qū)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行分型研究，發(fā)現(xiàn)超過(guò)85%的菌株均屬于這個(gè)家族，故命名為北京家族。這些菌株具有高度相似的IS6110酶切片段多態(tài)性圖譜，Spoligotyping分型顯示這類(lèi)菌株缺失了1～34個(gè)間隔區(qū)。隨后，在東亞的其他國(guó)家也發(fā)現(xiàn)有很高的流行。早期在美國(guó)廣泛傳播的耐多藥菌株W菌株根據(jù)Spoligotyping型別，也被鑒定為北京家族菌株，而北京家族菌株因此又被稱(chēng)為“W/Beijing菌株”。近年來(lái)，許多對(duì)結(jié)核分枝桿菌的研究中，發(fā)現(xiàn)北京基因型菌株是一簇基因型相似的菌株的集合，統(tǒng)稱(chēng)為“北京基因型家族株”，即北京家族。

研究顯示，根據(jù)不同的基因特征，可將北京家族進(jìn)一步分為許多亞系，依此區(qū)分不同的北京家族株成員。從而深入地了解了北京家族的起源及分子進(jìn)化。基因大片段多態(tài)性(LSP)分析有其特定的優(yōu)勢(shì)，并已運(yùn)用到眾多研究中。LSP一般是由基因缺失和重排所致，通常是不可逆的唯一事件，可作為Mtb基因分型及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化史的分子標(biāo)志。Brosch等[3]發(fā)現(xiàn)大多數(shù)缺失并不是一件獨(dú)特事件的結(jié)果，而是一系列缺失事件留下的痕跡，其在追蹤傳播中是非常有效的手段，目前最常用的片段引物主要有氨基末端片段(N-terminal fragment，NTF)、差異區(qū)域(region of difference,RD)105、RD181、RD150、RD142[4-5]。全球的北京家族可根據(jù)RD181、RD150、RD142等3個(gè)大片段缺失進(jìn)一步劃分為4個(gè)亞型。由于RD142和RD150在多個(gè)地區(qū)的北京家族菌株中多態(tài)性很低甚至沒(méi)有多態(tài)性，這3個(gè)長(zhǎng)片段多態(tài)性(large sequence polymorphism，LSP)位點(diǎn)并不能有效地研究不同地區(qū)北京家族菌株的群體結(jié)構(gòu)。劉彬彬[6]在對(duì)290例北京家族結(jié)核分枝桿菌的研究中，通過(guò)RD105、RD181和NTF位點(diǎn)的鑒定，北京家族結(jié)核分枝桿菌主要表現(xiàn)為4個(gè)亞群，最大的一個(gè)亞群基因型特征表現(xiàn)為RD105和RD181缺失，并且為現(xiàn)代型。這提示，在北京家族的進(jìn)化中，現(xiàn)代型北京家族并且RD105、RD181缺失，可能是主導(dǎo)進(jìn)化前進(jìn)過(guò)程的一個(gè)重要的分支，可將RD181缺失可作為探討進(jìn)化進(jìn)程的一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)。這需要在以后的研究中對(duì)其進(jìn)行更深入的研究。另外，根據(jù)RD181與NTF區(qū)域的插入有無(wú)，依此區(qū)分古老型與現(xiàn)代型北京家族有一定的區(qū)別。

最新研究發(fā)現(xiàn)，北京家族菌株已蔓延全球各個(gè)地理區(qū)域，亞洲最高達(dá)44.7%，歐洲和非洲分別為27.9%和12.5%，美洲最低(8.9%)[7]。大量的臨床和流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，北京家族結(jié)核分枝桿菌可能與耐多藥[8-9]、高致病性有關(guān)，從而導(dǎo)致傳播[10]和感染活動(dòng)性疾病的概率增加[11]，其已達(dá)到全球分離結(jié)核分枝桿菌菌株的13%，全世界有1/3的結(jié)核分枝桿菌由北京家族結(jié)核分枝桿菌引起，其已成為世界第二大流行的結(jié)核分枝桿菌菌株；它是遺傳上高度保守，具有在人群中引起發(fā)病的遺傳學(xué)優(yōu)勢(shì)，其在世界范圍內(nèi)的廣泛傳播，對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成潛在威脅。因此，研究快速簡(jiǎn)單的檢測(cè)北京家族結(jié)核分枝桿菌的方法是很有必要的。目前，應(yīng)用較多的主要包括Spoligotyping、IS6110-RFLP、可變串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)、LSP、單核苷酸多態(tài)性(SNP)等。利用這些方法可將北京家族結(jié)核分枝桿菌分為不同的亞型，如：Mokrousou等[12-13]依據(jù)北京菌株基因組NTF區(qū)域IS6110插入序列的多態(tài)性而將其分為古老和現(xiàn)代2個(gè)亞型；Luo等[14]采用8個(gè)SNP位點(diǎn)結(jié)合VNTR-15的復(fù)合分型方法。首先將北京譜系Mtb分為最近共組年代不同的8個(gè)亞譜系，在此基礎(chǔ)上，再行VNTR-15基因分型；Schurch等[15]也推出了51個(gè)SNP位點(diǎn)，將北京譜系結(jié)核分枝桿菌分為現(xiàn)代和古代2個(gè)亞譜系。這些工作均為深入研究北京家族結(jié)核分枝桿菌的流行特征奠定了基礎(chǔ)。筆者對(duì)北京家族結(jié)核分枝桿菌的鑒定方法及其研究進(jìn)展綜述如下。

一、 IS6110-RFLP技術(shù)

IS6110-RFLP是將插入序列IS6110與限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)相結(jié)合的一種基因分型技術(shù)。IS6110插入序列是由Thierry等[16]于1990年最先發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的，其全長(zhǎng)1355 bp，隸屬于IS3家族，并且只存在于結(jié)核分枝桿菌基因組中。這種插入序列廣泛分布于結(jié)核分枝桿菌的基因組中，在不同的臨床分離株中其重復(fù)次數(shù)也比較寬泛，為0～26個(gè)重復(fù)[17-18]。根據(jù)IS6110在不同菌株中的數(shù)目和位置不同，從而進(jìn)行基因分型。

1993年，van Embden等[19]介紹了IS6110-RFLP分型法的標(biāo)準(zhǔn)操作方法，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于結(jié)核病分子流行病學(xué)的研究領(lǐng)域中。具體方法是首先提取結(jié)核分枝桿菌全基因組 DNA，然后利用限制性?xún)?nèi)切酶PuvII 在相應(yīng)的 IS6110 酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離酶切后的 DNA 片段，經(jīng)Southern Blotting(DNA印記法)將分離后的 DNA 片段轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，與標(biāo)記的特異性DNA探針進(jìn)行雜交顯色，最終于尼龍膜上形成特異性的DNA圖譜，即所謂的“DNA指紋”。該方法分辨率高、具有很強(qiáng)的菌株鑒別能力，被國(guó)際上推為結(jié)核分枝桿菌基因分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，至今仍是實(shí)驗(yàn)室研究熱點(diǎn)之一。例如，Roychowdhury等[20]在對(duì)1377株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行以IS6110為單位的新一代測(cè)序技術(shù) (next-generation sequencing，NGS)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，這些菌株包括了全球7大譜系菌株，并且發(fā)現(xiàn)特定的譜系中IS6110的拷貝數(shù)和插入?yún)^(qū)域均是保守的，并且根據(jù)IS6110在不同譜系中的拷貝數(shù)及位置不同，可作為譜系鑒定的進(jìn)化標(biāo)志。

此分型方法可以用于鑒定北京家族菌株[4]，即將菌株的RFLP圖譜與19個(gè)有代表性的北京家族菌株的IS6110-RFLP圖譜(http:www.wadsworth.org/rflp/RFLP.html)相比較，如果與某一菌株譜帶相似性>80%，就可以定義為北京家族菌株。Mokrousov等[12]于2002年在對(duì)俄羅斯流行的北京家族菌株研究中發(fā)現(xiàn)，可根據(jù)基因組NTF區(qū)域IS6110插入多態(tài)性分為N和NTF∶IS6110兩型，N型在NTF區(qū)無(wú)IS6110插入序列，反映了祖先菌株在該位點(diǎn)的狀態(tài)，所以又被稱(chēng)為“古老型”北京家族菌株；NTF∶IS6110型則在該區(qū)域都存在1個(gè)或2個(gè)IS6110轉(zhuǎn)座子序列，所以又被稱(chēng)為“現(xiàn)代型”北京家族菌株[12-13]。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，“現(xiàn)代型”北京家族菌株的IS6110 RFLP圖譜與早期Van Soolingen等[2]在北京地區(qū)鑒定的北京菌株及與在美國(guó)流行的W菌株的RFLP圖譜有很高的相似度(80%左右)；而“古老型”北京家族菌株間的RFLP圖譜則存在較大差異，其與“現(xiàn)代型”北京家族菌株RFLP圖譜的差異也較大。這說(shuō)明“古老型”北京家族菌株間遺傳差異較大，而“現(xiàn)代型”北京家族菌株間則有極高的遺傳相似性。

對(duì)于已有RFLP圖譜的菌株，可以利用IS6110-RFLP鑒定方法進(jìn)行回顧性研究，但由于操作繁瑣，這種方法并不適用于大批量快速檢測(cè)。因此，在實(shí)驗(yàn)室研究中并不常規(guī)應(yīng)用此方法來(lái)進(jìn)行北京家族菌株的鑒定。

二、Spoligotyping技術(shù)

Spoligotyping技術(shù)是基于結(jié)核分枝桿菌基因組中的直接重復(fù)(direct repeats，DR)序列建立起來(lái)的基因分型技術(shù)。DR序列存在于所有結(jié)核分枝桿菌的基因組中，該序列包括多個(gè)36 bp的保守DNA序列和多個(gè)特異的34～41 bp的間隔序列。由于不同的結(jié)核分枝桿菌DR序列中特異性間隔序列的個(gè)數(shù)及位置不同，通過(guò)對(duì)間隔序列進(jìn)行檢測(cè)即可將不同的結(jié)核分枝桿菌區(qū)分開(kāi)來(lái)[21]。1997年Kamerbeek等[22]設(shè)計(jì)了一種獨(dú)特的PCR方法，該方法首先采用PCR擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌的DR序列，然后與固定在膜上的43條間隔序列特異性探針進(jìn)行雜交，再通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測(cè)[23]，得到較為特異的結(jié)果。結(jié)果判讀雜交陽(yáng)性即間隔區(qū)存在，用“1”表示，陰性即間隔區(qū)缺失，用“0”表示，這樣每間隔區(qū)的檢測(cè)結(jié)果就獲得0或1的數(shù)字編碼，然后用BioNumerics軟件進(jìn)行結(jié)果分析。通過(guò)Spoligotyping可將全球流行的結(jié)核分枝桿菌分為60多個(gè)主要的家族以及千百種無(wú)法進(jìn)行歸類(lèi)的新基因型。目前國(guó)際上已建有Spoligotyping數(shù)據(jù)庫(kù)(SploDB4)，該數(shù)據(jù)庫(kù)共收錄了世界范圍內(nèi)122個(gè)國(guó)家的 39 295株結(jié)核分枝桿菌分離株的Spoligotyping圖譜[24]。

1995年van Soolingen 等[2]采用Spoligotyping技術(shù)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌基因分型的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，中國(guó)北京及其周邊地區(qū)存在一大群具有顯著相似遺傳特征的結(jié)核分枝桿菌，主要特征是43個(gè)寡核苷酸探針中1至34位呈陰性反應(yīng)，即命名為北京家族菌株。且根據(jù)Spoligotyping特征性圖譜分析，可將北京家族菌株分為“典型”(43個(gè)特征性間隔序列中1～34位缺失，35～43位9個(gè)間隔序列存在)和“非典型”(不完全與第35～43間隔區(qū)雜交，雜交區(qū)的數(shù)目少于9個(gè))兩大類(lèi)。近年來(lái)，利用Spoligotyping進(jìn)行基因分型的研究很多。例如，F(xiàn)lores-Trevio等[25]利用Spoligotyping對(duì)墨西哥哈里斯科州的68株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行基因多態(tài)性研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)罕見(jiàn)的與高耐藥有關(guān)的北京家族基因型(SIT406)，這是在拉丁美洲的首次發(fā)現(xiàn)；Wang等[26]利用Spoligotyping對(duì)來(lái)自青海的251株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行基因分型時(shí)，發(fā)現(xiàn)菌株呈現(xiàn)基因多態(tài)性。經(jīng)聚類(lèi)分析，可被分為2大基因群，即北京家族菌株(73.7%)和非北京家族菌株(26.3%)。但應(yīng)用該分型技術(shù)不能區(qū)分不同的北京基因型菌株，且該方法操作復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)，需要多種儀器設(shè)備，不適合基層實(shí)驗(yàn)室及大規(guī)模的推廣應(yīng)用。

三、LSP技術(shù)

LSP是基于結(jié)核分枝桿菌基因組DNA中的RD而建立的結(jié)核分枝桿菌譜系鑒定技術(shù)。LSP一般是由基因缺失和重排所致，并且這些RD缺失一旦發(fā)生，大部分會(huì)穩(wěn)定遺傳到子代菌株基因組中，因此，可作為結(jié)核分枝桿菌基因分型及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化史的分子標(biāo)志。通過(guò)該技術(shù)可將全球的結(jié)核分枝桿菌分為6大譜系[27]，即環(huán)印度洋系(L1)、東亞譜系(L2)、東非-印度譜系(L3)、歐美譜系(L4)、西非-1系(L5)、西非-2系(L6)，北京家族隸屬于東亞譜系。且每個(gè)譜系結(jié)核分枝桿菌均與對(duì)應(yīng)的地理人群存在著一定聯(lián)系[28-30]。此外，Tessema等[31]在對(duì)來(lái)自埃塞俄比亞西北部的244株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行VNTR和Spoligotyping研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的譜系，定義為L(zhǎng)7。研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)TbD1缺失與否可將6大譜系分為古老與現(xiàn)代菌株，即環(huán)印度洋系、西非-1系、西非-2系(L1、L5、L6)，由于存在TbD1，被認(rèn)為是古老菌株，而其他譜系由于缺失TbD1則被認(rèn)為是現(xiàn)代菌株[3]。LSP 與 Spoligotyping 在鑒定結(jié)核分枝桿菌主要譜系(或家族)上具有一定程度的一致性，如經(jīng) LSP 鑒定的東亞譜系與經(jīng) Spoligotyping 鑒定的北京家族結(jié)核分枝桿菌呈高度一致，歐美譜系與 T 家族、S家族、X 家族、Haarlem、LAM 家族相一致，東非-印度譜系與 CAS 家族相一致，環(huán)印度洋譜系與 EAI 家族相一致[32]。近年來(lái)，利用LSP技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的研究越來(lái)越多。例如，F(xiàn)aksri等[33]利用LSP技術(shù)對(duì)來(lái)自泰國(guó)的256株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行譜系分類(lèi)，可得到環(huán)印度洋系譜系(70%)、北京譜系(23%)和歐美譜系(7%)三大譜系，并且發(fā)現(xiàn)北京家族譜系與耐藥和低齡化相關(guān)。LSP采用普通PCR 即可完成基本操作(個(gè)別RD片段需要進(jìn)行測(cè)序等輔助檢查技術(shù))，針對(duì)某一特定RD片段，在其序列兩端設(shè)計(jì)合成引物，PCR擴(kuò)增得到相應(yīng)產(chǎn)物片段，電泳鑒定產(chǎn)物片段長(zhǎng)度，若該RD片段缺失，則產(chǎn)物片段相對(duì)較短，即可鑒定為某一譜系結(jié)核分枝桿菌。

2005年，Tsolaki等[5]在比較結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv與北京家族菌株LSP的差異過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，RD105在所有H37Rv菌株中都存在，而在所有北京家族菌株中全部缺失，提出了RD105缺失基因可以作為“北京家族”菌株鑒定的一個(gè)非常有價(jià)值的分子標(biāo)記。研究表明，RD105缺失基因檢測(cè)法對(duì)北京家族菌株的鑒定結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)Spoligotyping基本一致，敏感度和特異度高達(dá)100%，且該方法操作簡(jiǎn)便、快速、費(fèi)用低廉、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，逐漸成為對(duì)北京家族菌株進(jìn)行鑒定的首選篩選方法[34]。另外，全球的北京家族菌株可被另外3個(gè)大片段缺失(RD181、RD142、RD150)進(jìn)一步劃分為4個(gè)亞型。其中，根據(jù)RD181的缺失與否，可將北京家族菌株分為“古老型”和“現(xiàn)代型”。但由于RD142和RD150在多個(gè)地區(qū)北京家族菌株中的多態(tài)性很低甚至沒(méi)有多態(tài)性，這3個(gè)LSP位點(diǎn)并不能有效地研究不同地區(qū)北京家族菌株的群體結(jié)構(gòu)[35]。

四、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polyrnorphism，SNP)技術(shù)

SNP技術(shù)主要是指基因組水平上由單個(gè)核苷酸變異引起的基因組DNA序列多態(tài)性，這種多態(tài)性包括單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失等4種形式，但研究中通常認(rèn)為SNP僅包括轉(zhuǎn)換和顛換兩種形式。它可分為同義SNP和非同義SNP兩類(lèi)，這些SNP位點(diǎn)與微衛(wèi)星等重復(fù)序列多態(tài)性相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)位點(diǎn)豐富：SNP位點(diǎn)幾乎遍及整個(gè)基因組，它是人類(lèi)可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一種；(2)遺傳穩(wěn)定：與其他重復(fù)序列多態(tài)性標(biāo)記相比，具有更高的遺傳穩(wěn)定性；(3)疾病相關(guān)性：SNP突變可影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達(dá)，從而引起表型變異、耐藥、疾病易感性等。因此，SNP可被用于結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定、進(jìn)化分析，以及疾病相關(guān)基因等方面的研究。

SNP有多種鑒定方法，但依據(jù)其基本原理可分為兩大類(lèi)：一類(lèi)是DNA測(cè)序相關(guān)方法，主要有全基因組測(cè)序和目的基因片段測(cè)序兩種；另一類(lèi)是基于PCR擴(kuò)增的非DNA測(cè)序方法，如實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)、PCR限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RLFP)、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)、基因芯片(基因探針)檢測(cè)等。北京家族結(jié)核分枝桿菌由于其在致病性、耐藥及傳播方面的獨(dú)特性，引起了人們利用SNP位點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行研究的興趣。Homolka等[36]研究發(fā)現(xiàn)，Rv2629等位基因中的A191C突變是北京基因型的生物學(xué)標(biāo)志。隨后，Alonso等[37]利用該SNP標(biāo)志建立了一種與RT-PCR結(jié)合的高分辨率熔解(high-resolution melting)實(shí)驗(yàn)，可快速區(qū)分北京家族與非北京家族的菌株。另外，Jiang等[38]利用SNP技術(shù)在對(duì)來(lái)自中國(guó)的180株結(jié)核分枝桿菌人類(lèi) T細(xì)胞表位中Ag85抗原復(fù)合體分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，Ag85B中的C714A基因位點(diǎn)可能是北京家族系統(tǒng)進(jìn)化的非常有價(jià)值的分子標(biāo)記。此外，Mestre等[39]通過(guò)復(fù)制、重組、修復(fù)相關(guān)3R基因(replication，recombination和 repair)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分型，可將我國(guó)的北京菌株進(jìn)一步分為7種亞型，并且發(fā)現(xiàn)Bmyc10亞型在群體中占主導(dǎo)地位，約占所有北京菌株的80%。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，Bmyc10亞型與根據(jù)NTF區(qū)域差異定義的“現(xiàn)代北京家族”本質(zhì)上是同一類(lèi)菌株，但SNP分型對(duì)北京家族菌株的定義更為細(xì)致。此外，羅濤[40]從我國(guó)11省份收集并鑒定的1385株北京菌株3R基因的8個(gè) SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型，這些菌株共被分為8個(gè)亞型，并且根據(jù)菌株在mutT2基因58號(hào)密碼子的突變情況，Bmyc10、Bmyc13及Bmyc210屬于“現(xiàn)代型”北京家族菌株，而B(niǎo)myc2、Bmyc6、Bmyc4、Bmyc25及Bmyc26屬“古老型”北京家族菌株。并且和VNTR等基因分型相比，SNP具有可準(zhǔn)確定義菌株進(jìn)化地位的優(yōu)勢(shì)。

五、分枝桿菌散在重復(fù)單位-數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列(Mycobacterium interspersed repeats units-variable number of tandem repeats，MIRU-VNTR)技術(shù)

MIRU-VNTR技術(shù)是基于結(jié)核分枝桿菌基因組中的 VNTR 位點(diǎn)而建立起來(lái)的結(jié)核分枝桿菌基因分型方法。VNTR 又稱(chēng)“小衛(wèi)星 DNA” (mini-satellite DNA)，是一種重復(fù) DNA 小序列，每個(gè)特定的 VNTR 位點(diǎn)由兩部分組成，即中間特異的“核心區(qū)”和兩側(cè)保守的“側(cè)翼區(qū)”。核心區(qū)含有至少 1 個(gè)以上稱(chēng)之為“重復(fù)單位”(repeat unit)、并以串聯(lián)形式存在的 DNA 短序列，一般該重復(fù)單位的堿基序列不變，但在不同的結(jié)核分枝桿菌中該重復(fù)序列串聯(lián)在一起的數(shù)目是可變的[41]。MIRU-VNTR 就是針對(duì)結(jié)核分枝桿菌基因組 DNA 中的多個(gè) VNTR 位點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行組合，通過(guò)對(duì)相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)單位數(shù)目的計(jì)算，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同結(jié)核分枝桿菌的基因分型。該方法的基本原理是基于 PCR 的擴(kuò)增方法， 挑選適當(dāng)?shù)?VNTR 位點(diǎn)，PCR 對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR 產(chǎn)物大小，并根據(jù)已知的該位點(diǎn)“重復(fù)單位”大小及兩側(cè)的保守側(cè)翼區(qū)(flank region)大小對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)單位個(gè)數(shù)的計(jì)算，相應(yīng)結(jié)果用數(shù)字表示。對(duì)多個(gè) MIRU-VNTR 位點(diǎn)進(jìn)行組合分析，最終得到一組由不同數(shù)字組成的 MIRU-VNTR 基因型，從而實(shí)現(xiàn)了不同結(jié)核分枝桿菌的基因分型[42]。該方法較 IS6110-RFLP 操作簡(jiǎn)便，對(duì) DNA含量及質(zhì)量要求較低，不需預(yù)先培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌，也不需結(jié)核分枝桿菌的全基因組 DNA；結(jié)果以數(shù)字化形式表現(xiàn)，便于分析及不同實(shí)驗(yàn)室之間進(jìn)行比較；分辨率略低于 IS6110-RFLP，但明顯高于 Spoligotyping，因此受到了結(jié)核病分子流行病學(xué)研究領(lǐng)域的廣泛重視。

但VNTR分型法與北京家族結(jié)核分枝桿菌識(shí)別的關(guān)系尚不清楚。雖然 15 位點(diǎn)和 24 位點(diǎn) MIRU-VNTR 組合在結(jié)核病分子流行病學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮了重要的作用，但是大量的研究表明，對(duì)于北京家族結(jié)核分枝桿菌高流行的地區(qū)(如中國(guó))來(lái)說(shuō)，這兩種組合并不是最佳的基因分型位點(diǎn)組合[43-44]，主要是由于北京家族結(jié)核分枝桿菌菌株間的遺傳相似性較高的原因[14]。因此，Iwamoto 等[45]對(duì)北京家族結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行深入研究，組建了一套 18 位點(diǎn) MIRU-VNTR 組合用于對(duì)北京家族結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行基因分型。Murase 等[46]重新組合了12 個(gè) MIRU-VNTR 位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)該 12 位點(diǎn) MIRU-VNTR 對(duì)北京家族結(jié)核分枝桿菌的分辨能力優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn) 15 位點(diǎn)MIRU-VNTR，接近 24 位點(diǎn) MIRU-VNTR。Luo 等[47]為推行出一套最適合中國(guó)地區(qū)流行的結(jié)核分枝桿菌基因分型的 MIRU-VNTR 位點(diǎn)組合，對(duì)收集自中國(guó)6個(gè)省的1362 株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行了 25 個(gè) MIRU-VNTR 位點(diǎn)的分辨能力的評(píng)價(jià)，最終組建出適合于我國(guó)結(jié)核分枝桿菌基因分型的 9 個(gè) MIRU-VNTR 位點(diǎn)組合，以及用于進(jìn)一步區(qū)分成簇菌株的 3 個(gè) VNTR高變位點(diǎn)。劉彬彬[6]利用15位點(diǎn)對(duì)北京家族菌株的研究中，發(fā)現(xiàn)MLVA分型在北京家族進(jìn)化的探討中也可起到一定的標(biāo)識(shí)作用，并篩選出ETRD、MIRU26、Mtub21和Mtub30這4個(gè)位點(diǎn)，可以作為提供北京家族菌株系統(tǒng)進(jìn)化的信號(hào)；金嘉琳等[48]在利用12位點(diǎn)VNTR進(jìn)行北京家族菌株進(jìn)行分型中，發(fā)現(xiàn)在北京家族菌株中分辨率最高的是MIRU26位點(diǎn)，最低的為ETR-B位點(diǎn)；所以針對(duì)特定地區(qū)和人群，應(yīng)選取分辨率較高的VNTR位點(diǎn)進(jìn)行北京家族的微進(jìn)化研究，從而能為北京家族菌株分子流行病學(xué)框架的構(gòu)建、菌株進(jìn)化研究和臨床菌株的基因型分析提供幫助。

六、小結(jié)

結(jié)核病分子流行病學(xué)研究是集分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)及流行病學(xué)幾種學(xué)科的聯(lián)合應(yīng)用，它從基因水平研究結(jié)核病的病原分子特征、遺傳變異機(jī)制、耐藥機(jī)制、人群中傳播規(guī)律及危險(xiǎn)因素等。分子流行病學(xué)的核心是分子分型技術(shù)，它能克服傳統(tǒng)流行病學(xué)不足，對(duì)結(jié)核病暴發(fā)流行時(shí)追蹤傳染源、檢測(cè)結(jié)核病的傳播、區(qū)別內(nèi)外源性感染、多克隆或單克隆感染、識(shí)別耐藥菌株感染流行，以及分析某一地區(qū)流行的結(jié)核分枝桿菌的群結(jié)構(gòu)特征等方面的研究都具有十分重要的意義[49]。

在對(duì)北京家族結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行鑒定的各種分型方法中，IS6110-RFLP、Spoligotyping和VNTR技術(shù)是國(guó)際上進(jìn)行結(jié)核病流行病學(xué)研究最常用的方法，并且在結(jié)核病的防控中發(fā)揮了重要作用，目前都已有標(biāo)準(zhǔn)操作方法；LSP和SNP是新興的分子分型技術(shù)，隨著對(duì)這些分型技術(shù)的深入研究，北京家族結(jié)核分枝桿菌的鑒定會(huì)更加簡(jiǎn)便、快速和細(xì)致。

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(本文編輯：范永德)

Progress in identification of Beijing familyMycobacteriumtuberculosis

GUOLi-juan*,HUANGHai-rong,GAOFei,WANGGui-rong.

*InnerMongoliamedicaluniversitygraduateschool,Hohhot010059，China

WANGGui-rong，Email：276761010@qq.com；GAOFei,Email:gaofeiwho@163.com

Tuberculosis is still a big public health problem worldwide. Tuberculosis is mainly caused by Beijing familyMycobacteriumtuberculosisin China. This paper discussed the progress of several genotyping methods including insertion sequence 6110-restricted fragment longevity polymorphism (IS6110-RFLP), spacer oligonucleotide typing (Spoligotyping), large sequence polymorphism (LSP) and single nucleotide poly- morphism (SNP) in identification of Beijing familyMycobacteriumtuberculosis, which will provide a reliable basis for selecting genotyping methods to identify Beijing family strains.

Mycobacteriumtuberculosis; Geneotyper

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.02.015

北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才培養(yǎng)項(xiàng)目(2014-3-084)

010059 呼和浩特,內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院(郭立娟)；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所 國(guó)家結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室 北京市耐藥結(jié)核病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(黃海榮、王桂榮)；內(nèi)蒙古自治區(qū)第四醫(yī)院(高飛)

王桂榮，Email：276761010@qq.com； 高飛，Email：gaofeiwho@163.com

2015-09-15)