骨與關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷研究進(jìn)展

金陽輝 石仕元 賴 震

骨與關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷研究進(jìn)展

金陽輝 石仕元 賴 震

結(jié)核；骨與關(guān)節(jié)；診斷；研究進(jìn)展

骨與關(guān)節(jié)結(jié)核是伴隨人類歷史最長(zhǎng)的疾病之一，敏感、準(zhǔn)確、快速、高效、簡(jiǎn)單、價(jià)廉的檢測(cè)手段是防治骨與關(guān)節(jié)結(jié)核的關(guān)鍵。近年來，隨著影像學(xué)、細(xì)菌學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等檢查方法的不斷發(fā)展、檢測(cè)設(shè)備的不斷更新以及新的檢測(cè)手段的不斷涌現(xiàn)，為骨與關(guān)節(jié)結(jié)核的早期診斷帶來了希望，現(xiàn)就骨與關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷研究進(jìn)展綜述如下。

1 影像學(xué)診斷

1.1 X線 X線片作為骨與關(guān)節(jié)結(jié)核的常規(guī)檢查，具有價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單、快速直觀等優(yōu)點(diǎn)。在骨與關(guān)節(jié)結(jié)核早期診斷上可以確定病變部位、程度、骨質(zhì)變化、破壞程度及軟組織內(nèi)膿腫等[1]。在敏感性方面，X線表現(xiàn)比較差，發(fā)病初期X線上常顯示不出異常的征象，而當(dāng)X線上出現(xiàn)異常征象的時(shí)候，骨質(zhì)的破壞程度一般都達(dá)到50%以上。對(duì)軟組織與死骨的鈣化X線檢查也存在著一定的不足，如關(guān)節(jié)結(jié)核早期X線平片可無明顯改變或僅有輕度骨質(zhì)疏松和關(guān)節(jié)間隙增寬或變窄，后期才會(huì)出現(xiàn)骨紋理紊亂，骨質(zhì)模糊不清呈毛玻璃樣，繼而出現(xiàn)骨質(zhì)破壞、缺損和死骨及周圍軟組織腫脹、膿腫及竇道形成[2]。

1.2 計(jì)算機(jī)X線攝影（CT） CT具有高分辨率、高敏感性和強(qiáng)大的三維重建功能。可以很好顯示病灶周圍軟組織的情況，克服了檢查部位組織結(jié)構(gòu)重疊的影響，并且可以根據(jù)需求調(diào)節(jié)掃描層的厚度。陳忠元龍等[3]報(bào)道顯示CT在骨質(zhì)破壞、死骨形成、冷膿腫的顯示、軟組織和膿腫內(nèi)有無鈣化、椎體附件的破壞情況以及硬膜囊有無受壓等方面的顯示均明顯優(yōu)于X線平片。在微小骨質(zhì)破壞和鈣化觀察方面的優(yōu)勢(shì)也使其可以更清晰地顯示病灶內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

1.3 MRIMRI對(duì)骨與軟組織分辨率高,敏感性強(qiáng)，具有多平面的成像能力，可以清晰顯示病灶范圍、軟組織異常和硬膜受壓程度。相比較于X線和CT，可以更容易顯示椎體骨質(zhì)破壞、椎間盤受累、椎管受累和椎旁膿腫，可在脊柱結(jié)核骨質(zhì)破壞前期即可做出早期診斷，是觀察早期椎體骨質(zhì)破壞、椎管內(nèi)侵犯和脊髓病變最敏感的診斷方法[4-5]。在對(duì)骨膜下型結(jié)核和脊椎旁寒性膿腫的大小，形狀、范圍以及對(duì)周圍器官和組織推壓的顯示方面，MRI也較X線片和CT片有更大的優(yōu)勢(shì)。

2 細(xì)菌學(xué)診斷

2.1 涂片抗酸染色鏡檢

2.1.1 萋-尼式抗酸染色法 萋-尼式抗酸染色鏡檢法可以對(duì)骨或關(guān)節(jié)結(jié)核膿液標(biāo)本中的抗酸桿菌做到快速的檢測(cè)，是診斷骨與關(guān)節(jié)結(jié)核最為經(jīng)典的檢測(cè)方法，也是在全世界應(yīng)用最為普遍的技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快速、價(jià)廉，送檢當(dāng)天就能出結(jié)果。缺點(diǎn)：敏感性低，特異性差，不能區(qū)分結(jié)核桿菌和非結(jié)核桿菌，對(duì)L型和顆粒性結(jié)核分支桿菌也不能檢出[6]，并且送檢標(biāo)本的質(zhì)量和鏡檢人員的技術(shù)水平都會(huì)對(duì)最后的檢測(cè)結(jié)果造成極大的影響。

2.1.2 發(fā)光二級(jí)管（LED）熒光顯微鏡檢測(cè) 近年來，結(jié)合了發(fā)光二級(jí)管和顯微鏡的發(fā)光二級(jí)管（LED）熒光顯微鏡檢測(cè)技術(shù)逐漸應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)。由于其簡(jiǎn)單、價(jià)廉、燈泡壽命長(zhǎng)、不需要暗室，同時(shí)具有較高的敏感性和特異性等方面的優(yōu)勢(shì)，使其有望逐步替代傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡而在結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室中推廣應(yīng)用[7]。

2.2 結(jié)核分支桿菌培養(yǎng)法

2.2.1 L-J固態(tài)培養(yǎng)法 L-J固態(tài)培養(yǎng)法陽性率高于涂片法，可以進(jìn)行活菌和菌系的鑒定，同時(shí)還可以進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。但由于結(jié)核分枝桿菌緩慢生長(zhǎng)的習(xí)性，通常需要6～8周才能出結(jié)果，而且陽性率也只有30%～40%，同時(shí)無法區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與不致病的非結(jié)核分支桿菌。其耗時(shí)長(zhǎng)，陽性率低的問題，使其難以滿足臨床需求，正在逐漸被液體培養(yǎng)基快速培養(yǎng)系統(tǒng)所替代，而臨床運(yùn)用越來越少。

2.2.2 液體培養(yǎng)基快速培養(yǎng)系統(tǒng) BACTECTM MGITTM960和BacT/ALERT3D快速培養(yǎng)儀系統(tǒng)對(duì)骨與關(guān)節(jié)結(jié)核患者的病灶標(biāo)本進(jìn)行MTB分離培養(yǎng)，僅需兩周，是目前臨床上較常用的液體培養(yǎng)基快速培養(yǎng)系統(tǒng)，在陽性率和培養(yǎng)時(shí)間上較傳統(tǒng)的L-J固態(tài)培養(yǎng)法更敏感、更快速。金格勒等[8]研究顯示應(yīng)用BACTECTM MGITTM960快速培養(yǎng)儀系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)4周陽性率 34.78%，8周陽性率57.97%，適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間可提高培養(yǎng)陽性率。但是即便是適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，依舊存在著敏感性差、耗時(shí)長(zhǎng)的問題，再則部分骨與關(guān)節(jié)結(jié)核患者由于病變部位的原因，造成臨床標(biāo)本的不易獲取或者所取得的臨床標(biāo)本中所含菌量比較少，這些均會(huì)導(dǎo)致敏感性進(jìn)一步下降。

3 免疫學(xué)診斷

免疫學(xué)檢查法是用結(jié)核分支桿菌的菌體成分制成抗原或抗體，檢查患者血清中的結(jié)核抗體或抗原，具有標(biāo)本來源方便、檢查速度快、操作簡(jiǎn)單、敏感性和特異性均較好等特點(diǎn)[9]，是診斷骨與關(guān)節(jié)結(jié)核的重要輔助檢查之一，對(duì)骨與關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷有著較高的參考價(jià)值。

3.1 結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（TST） 結(jié)核菌素（包括舊結(jié)核菌素OT、純蛋白衍化物PDD）皮膚試驗(yàn)基于IV型變態(tài)反應(yīng)原理，通過將結(jié)核菌素再次注入皮膚，觀察48～72h內(nèi)注射部位是否出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)判斷機(jī)體有無感染過結(jié)核桿菌。其簡(jiǎn)便的特性使其成為近一個(gè)世紀(jì)來用于MTB感染檢測(cè)最為普遍的傳統(tǒng)方法，但是存在觀察結(jié)果耗時(shí)長(zhǎng)，敏感性低的問題，且無法區(qū)分是由于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群感染引起的變態(tài)反應(yīng)，還是由于非結(jié)核分支桿菌或卡介苗的接種引起的致敏所導(dǎo)致的低特異性。因此我國(guó)作為卡介苗普遍接種的國(guó)家,TST的敏感性和特異性將會(huì)受到極大的限制。

3.2 結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB） TSPOT.TB為近年來用于診斷骨與關(guān)節(jié)結(jié)核的一項(xiàng)新技術(shù)，由敏聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)展而來，主要用于檢測(cè)外周血標(biāo)本，具有較高的靈敏性和特異性。古甫丁等[10]報(bào)道，T-SPOT.TB在骨與關(guān)節(jié)結(jié)核診斷中的敏感性和特異性分別是84.5%和90.4%。秦世炳等[11]報(bào)道，在骨結(jié)核診斷方面，結(jié)核感染T細(xì)胞檢查的靈敏性為94.2%，特異性為70.8%。機(jī)體的免疫狀態(tài)不會(huì)影響T-SPOT.TB的敏感性[12]，對(duì)免疫低下或免疫抑制人群亦可使用，并且在特異性上不會(huì)受到卡介苗和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌的影響。該方法檢測(cè)的標(biāo)本易于采集（血液檢測(cè)），檢測(cè)時(shí)間不長(zhǎng),24～48h就能出結(jié)果。但是也存在著一些局限性：（1）該方法操作步驟較多且繁瑣、檢測(cè)費(fèi)用昂貴。（2）采集到的標(biāo)本較易受到污染，且還需要進(jìn)行后續(xù)處理。（3）需要盡早測(cè)試以避免細(xì)胞功能下降，從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。（4）由于檢測(cè)的是血液標(biāo)本，所以對(duì)于病灶的位置無法確定。

3.3 結(jié)核抗體檢測(cè)法 結(jié)核抗體存在于各種體液標(biāo)本中，目前常用的方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)（DIGFA）、斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)（DICA）、免疫印跡試驗(yàn)（Westem blot）和蛋白芯片技術(shù)。ELISA始于上個(gè)世紀(jì)70年代，該方法快速、簡(jiǎn)便，敏感性和特異性也較高，是目前研究最多、臨床應(yīng)用最廣泛的血清學(xué)診斷方法。DIGFA是基于ELISA發(fā)展而來的固相免疫標(biāo)記測(cè)定技術(shù)，較ELISA更為簡(jiǎn)便、快速，無需精密儀器，15min可出結(jié)果，檢測(cè)的敏感性和特異性與ELISA相當(dāng)，并可以單人份測(cè)定。DICA是基于DIGFA發(fā)展起來一種新技術(shù)，其只需一個(gè)試劑、一個(gè)步驟即可完成檢測(cè)反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)引起來人們的極大關(guān)注。免疫印跡斑點(diǎn)法具有很高的特異性和敏感性，但因操作繁瑣而在臨床上較少應(yīng)用。血清結(jié)核抗體檢測(cè)法具有重復(fù)性好、簡(jiǎn)單快捷、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，已成為結(jié)核病常用的輔助診斷手段之一[13]，尤其是對(duì)骨與關(guān)節(jié)結(jié)核等肺外結(jié)核的診斷和鑒別診斷具有重要的意義。

4 分子生物學(xué)診斷

結(jié)核分子生物學(xué)診斷是基于對(duì)結(jié)核桿菌基因進(jìn)行檢測(cè)的一種技術(shù)，可以直接對(duì)結(jié)核分枝桿菌的種系進(jìn)行分類鑒定和藥敏的檢測(cè)，具有簡(jiǎn)便、快速、試劑穩(wěn)定、高敏感性和特異性等優(yōu)點(diǎn)。1989年Hance[14]最早報(bào)道用PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，開創(chuàng)了使用分子生物學(xué)技術(shù)基因診斷結(jié)核病的先河，到最近幾年在國(guó)內(nèi)外受到廣泛關(guān)注的Xpert MTB/RIF技術(shù)的問世，結(jié)核的分子生物學(xué)診斷在近年來獲得了快速的發(fā)展。

4.1 熒光定量PCR（FQ-PCR） 熒光定量PCR（FQPCR）是美國(guó)PE公司開發(fā)的一種新的核酸定量技術(shù)，是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，加入熒光標(biāo)記探針，再融合核酸擴(kuò)增、DNA雜交及光譜技術(shù)。該技術(shù)的特點(diǎn)是在封閉狀態(tài)下檢測(cè)，避免了擴(kuò)增產(chǎn)物污染所致的假陽性；光譜技術(shù)提高了靈敏度；熒光探針DNA雜交進(jìn)一步提高了特異性[15-16]。并且相比于常規(guī)的PCR技術(shù)，不僅實(shí)現(xiàn)了從定性到定量的飛躍，而且特異性更強(qiáng)，重復(fù)性更好，自動(dòng)化程度更高。

4.2 XpertMTB/RIF XpertMTB/RIF整合了基于定量PCR分子遺傳檢測(cè)所需的3個(gè)步驟（樣品準(zhǔn)備、擴(kuò)增、檢測(cè)），將待檢樣品放入到XpertMTB/RIF反應(yīng)盒中，系統(tǒng)就會(huì)自動(dòng)按照相應(yīng)的程序運(yùn)行，實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR運(yùn)行情況，一旦PCR完成，Xpert MTB/RIF檢測(cè)系統(tǒng)全自動(dòng)化的軟件就會(huì)判斷出患者是否患有結(jié)核病，以及是否對(duì)利福平耐藥[17]。因其簡(jiǎn)單，只需一個(gè)步驟，即可自動(dòng)化完成；快速，只需90min即可完成結(jié)核病的診斷和利福平耐藥的檢測(cè)；安全，全程在密閉的儀器中完成，無需生物安全需求。同時(shí)具有高敏感性和特異性，李力韜等[18]報(bào)道，在培養(yǎng)陽性的脊柱結(jié)核臨床標(biāo)本中，Xpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的敏感度為98.43%，在培養(yǎng)陽性、涂片陰性的標(biāo)本中，結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的敏感度為97.67%。賈文韞等[19]報(bào)道，Xpert MTB/RIF利用膿液標(biāo)本檢測(cè)骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者結(jié)核分枝桿菌的敏感性為93.87%，特異性為96.87%，陽性預(yù)測(cè)值為97.87%，陰性預(yù)測(cè)值為91.17%，一致率為95.06%。這些優(yōu)點(diǎn)使得XpertMTB/ RIF在結(jié)核病的診斷中被WHO譽(yù)為最具有革命性突破的診斷技術(shù)。要說其不完美之處或許就在于其相對(duì)昂貴的檢測(cè)費(fèi)用和僅能對(duì)利福平的耐藥進(jìn)行檢測(cè)。

4.3 恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)

4.3.1 RNA恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)（SAT）SAT是基于RNA

恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)發(fā)展起來的一種新型核酸檢測(cè)技術(shù)。其最大的優(yōu)點(diǎn)在于直接以結(jié)核分枝桿菌特異性RNA為擴(kuò)增靶標(biāo)，以擴(kuò)增產(chǎn)物RNA為檢測(cè)靶標(biāo)，而RNA僅在活菌中存在，結(jié)核分枝桿菌死亡和RNA降解，該方法可以作為區(qū)分死菌、活菌的依據(jù)及治療效果的檢測(cè)[20]；SAT可在15～30min將模板擴(kuò)增10億倍的高擴(kuò)增效率也確保了檢測(cè)的靈敏度，整個(gè)過程耗時(shí)1.5h展現(xiàn)了其檢測(cè)周期短的優(yōu)勢(shì)；RNA在自然環(huán)境中的極易降解，不僅有效地解決了PCR技術(shù)在檢測(cè)TB時(shí)導(dǎo)致的假陽性問題，而且大幅度提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性；同時(shí)SAT相對(duì)于其他的核酸擴(kuò)增技術(shù)，其反應(yīng)抑制物更少，更進(jìn)一步降低了假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

4.3.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP） LAMP是Notomi等[21]于2000年發(fā)明的一種全新的核酸擴(kuò)增方法，不僅具有PCR技術(shù)的全部?jī)?yōu)點(diǎn)，而且操作方法簡(jiǎn)單。LAMP直接擴(kuò)增臨床標(biāo)本中的Mtb DNA，不需昂貴的核酸擴(kuò)增儀和檢測(cè)設(shè)備；檢測(cè)速度快：等溫?cái)U(kuò)增法的診斷效能幾乎等同于羅氏培養(yǎng)法，但是其檢出時(shí)間僅僅只需1h左右，大大降低診斷延誤的時(shí)間和幾率[22]；鑒定簡(jiǎn)便：在恒溫下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生大量的擴(kuò)增產(chǎn)物即焦磷酸鎂為白色的沉淀，具有極高的特異性，通過肉眼觀察或濁度儀檢測(cè)沉淀度就能判斷擴(kuò)增與否。這些優(yōu)點(diǎn)使得LAMP不僅可以用于設(shè)備精良的大醫(yī)院或者實(shí)驗(yàn)室，而且也可以用于基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)或現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。

5 展 望

目前骨與關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷方法很多，尤其是近年來細(xì)胞免疫學(xué)和分子生物學(xué)診斷技術(shù)的飛速發(fā)展為骨與關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷帶來了新的突破，但是基于其自身所存在的缺陷或不足，使其依然不能代替MTB的涂片和培養(yǎng)而成為骨與關(guān)節(jié)結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。目前依然沒有一種技術(shù)能單獨(dú)、有效地診斷骨與關(guān)節(jié)結(jié)核。因此臨床應(yīng)了解各種診斷技術(shù)的優(yōu)劣勢(shì)所在，并將這些技術(shù)有機(jī)結(jié)合，在傳統(tǒng)檢測(cè)的基礎(chǔ)上，輔以最新的檢測(cè)手段綜合分析，做出正確診斷，充分發(fā)揮診斷技術(shù)在骨與關(guān)節(jié)結(jié)核防治中急先鋒的作用。

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（收稿：2015-06-03 修回：2015-07-23）

杭州市科委引導(dǎo)項(xiàng)目（No.2014YD14）

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