心肌損傷標志物的急診檢測和miRNAs研究進展

李春雨 姜婷 王魏魏 陳君 何琪芳 張勁松 范勇 齊煉文 李萍 曹克將 錢玲梅 陳彥，4

許多心臟疾病的發(fā)病早期，在尚未出現(xiàn)臨床癥狀時就已經發(fā)生心肌損傷的病理變化。心肌損傷程度對心臟疾病的診斷及預后判斷有較大影響。約25%的急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)患者在發(fā)病時不會表現(xiàn)出明顯的典型癥狀和體征，約50%以上的患者心電圖可無典型變化。相對而言，心肌標志物實驗室檢查簡便易行，因此對心肌損傷標志物的研究具有重要的意義[1]。

心肌細胞受到損傷后，因細胞膜的完整性和通透性改變導致細胞內大分子物質逸出，這些在外周循環(huán)中能被檢測出的物質稱為心肌損傷標志物。最早追溯到1954年，Ladue[2]首先發(fā)現(xiàn)AMI患者血清天冬氨酸氨基轉移酶/谷氨酸草酰乙酸轉氨酶(AST/GOT)水平升高，成為AMI的第一個血清酶標志物。經過半個多世紀對心肌損傷標志物種類及檢測方法的研究，已不斷成熟，對降低心肌受損導致各種心臟疾病的病死率和預后評估具有重要作用。好的標志物具有以下特點：(1)易于獲取，最好通過無創(chuàng)手段獲取。(2)敏感性高、組織特異性強。(3)分析檢測方法便捷、費用合理和診斷窗口期短。(4)實現(xiàn)早期診斷、危險分層和監(jiān)測病情進展[3]。

本文將從以下3方面進行概述：(1)目前臨床廣泛應用的心肌標志物：包括肌紅蛋白、肌酸激酶、肌鈣蛋白及高敏肌鈣蛋白。(2)其他生物標志物：包括C反應蛋白、鈉尿肽、心肌脂肪酸結合蛋白、和肽素等。(3)新型生物標志物：微小RNA的臨床應用進展

一、臨床廣泛應用的心肌標志物

1.肌紅蛋白(myoglobin,Mb)：Mb具有早期診斷急性心肌梗死的價值，陰性預測值較高，但特異性較低。Mb是一種氧結合血紅素蛋白，主要分布在心肌和骨骼肌，因其分子量小，心肌細胞損傷后最先釋放入血，是心肌損傷后最早上升的標志物，也是第一個用于診斷心肌損傷的非酶類蛋白[4]。發(fā)病后1～2 h就異常增高，4～8 h達到峰值，24 h逐漸下降，具有高度的敏感性，在AMI發(fā)病4 h陽性檢出率高達98%。但Mb并非心肌損傷的特異性標志物，易受到腎臟和骨骼肌疾病的干擾，作為早期心肌梗死標志物，有很高的陰性預測價值。Mb陰性有助于排除ACS早期診斷，同時也是冠脈再通后再發(fā)梗阻敏感且快速的標志物。若為陽性，則需排除其他情況。若重新升高，應考慮再梗死[5]。對于未確診的AMI患者，每隔2 h測定一次Mb陰性則可以排除AMI診斷[6]。癥狀開始24 h后做檢查，肌紅蛋白應該在正常范圍，并指出該指標一般和其他組織特異性強的指標聯(lián)合使用

2.肌酸激酶(creatine kinase，CK)及其同工酶(MB isoenzyme,CK-MB)：肌酸激酶共有3種，即CK-MB、CK-BB和CK-MM,其中 CK-MB主要分布于心肌細胞，在AMI 4 h開始升高，16～24 h達高峰，3～4 d恢復正常。CK-MB進入血中經羥肽酶分解為兩個亞型，即CK-MB1和CK-MB2，是診斷AMI最有價值的酶學生化指標[7]。以CK-MB1>3 mg/L，CK-MB1：CK-MB2>1.5作為診斷標準，其敏感性比單純CK-MB高；而采用質量分析方法測定其蛋白濃度，具有高度的敏感性和準確性，測定時間短，適合于自動分析已被廣泛認可[8]。

但與蛋白肽類標志物相比，敏感度不高、組織特異性差，其自身優(yōu)勢在于[9]：AMI后CK-MB持續(xù)高水平，提示心肌壞死仍在繼續(xù)；由于CK-MB半衰期短，他對有無再梗死或梗死區(qū)域有無擴大更敏感，由于CK-MB半衰期短，可以作為判斷有無再梗死或梗死區(qū)域有無擴大更敏感的標志物；而cTnI在血中保持高水平數(shù)天，因此在判斷有無再梗死或梗死區(qū)域有無擴大方面弱于CK-MB或Mb。CK-MB是否提前有助于判斷溶栓是否成功，因此CK-MB曾一度被認為是診斷AMI的“金標準”。AMI患者CK-MB質量和活性測定的動態(tài)觀察結果顯示，CK-MB質量升高較CK-MB活性升高明顯，在AMI的早期診斷上優(yōu)于CK-MB活性[10]。

3.肌鈣蛋白(cardiac troponin，cTn)和高敏肌鈣蛋白(high sensitivity cardiac troponin,hs-cTn):肌鈣蛋白分cTnI、 cTnT和cTnC3個亞型，是鈣離子受體蛋白，通常在發(fā)病后4～6 h出現(xiàn)，18～24 h達到高峰，可持續(xù)存在5～14 d，因其靈敏度高、特異性強、持續(xù)時間長，被臨床廣泛使用[11]。根據(jù)ESC對標志物的推薦，肌鈣蛋白接近第99百分位上限，2 h 內增加超過50%，將會提高AMI的診斷準確性[12]。研究表明，肌鈣蛋白并不是早期診斷AMI的理想標志物：上升緩慢、達峰時間較久，不能診斷再發(fā)梗死因為梗死2周后肌鈣蛋白濃度仍然較高，為了能夠早期排除AMI，高敏肌鈣蛋白應運而生，靈敏度大大提升[13]。

近年來國內外醫(yī)院使用cTnI、Myo、CK-MB作為診斷AMI的新指標，尤其是cTnI已取代CK-MB作為診斷心肌損傷新的“金標準”，是目前診斷心肌損傷較好的確定標志物。然而，一旦AMI患者在cTnI持續(xù)陽性期間再次發(fā)生梗死，此時CK-MB就具有更好的敏感性。因此，cTnI不能完全取代CK-MB[8]。cTnI的特異性優(yōu)于cTnT和cTnC，由于在其N末端多出31個氨基酸殘基有特異性抗原，故其是心肌損傷標志物中特異性最高的。在變異性心絞痛患者體內可檢測到cTnI升高，而CK-MB沒有升高，說明cTnI可以檢測到微小的心肌損傷[14]。

臨床表現(xiàn)胸痛但心電圖正常的患者中：cTn水平升高者，冠脈疾病占90%；cTn水平正常者，冠脈疾病者占23%(P<0.001)，當心肌損傷時，cTn釋放入血的百分率比CK-MB顯著升高，在血液中維持時間較長，因其持續(xù)升高的窗口期，提高了檢測敏感性[15]。cTn在臨床上主要用于心肌缺血損傷的診斷、危險評估和預后判斷；MI后溶栓效果判定；心肌炎、左心衰竭，以及藥物的臨床療效觀察等。近幾年來，通過檢測方法的改進，已經能實現(xiàn)對低濃度肌鈣蛋白進行精確檢測，稱為超敏感肌鈣蛋白檢測法，其檢測下限降低，敏感性明顯提高。該方法對AMI及時診斷的敏感性從70%上升至90%，對于表現(xiàn)出ACS癥狀的患者，肌鈣蛋白陽性率較以前的檢測方法增加約60%[12]。

2011年，ESC和ACC聯(lián)合發(fā)表非ST段抬高型冠脈綜合征指南中將高敏Tn作為急性冠脈綜合征的診斷和危險分層的主要依據(jù)。也有研究結果顯示超敏感肌鈣蛋白T(hs-cTnT)表達水平≥3 μg/L和≥14 μg/L對鑒別心肌損傷和AMI有重要意義，對于預測心肌損傷有重要價值[16]。另外一項大型研究利用高敏肌鈣蛋白和目前診斷金標準肌鈣蛋白分析其作用效能差異，結果顯示,在肌鈣蛋白陰性的患者中，高敏肌鈣蛋白的診斷敏感性和特異性為82%和68%，ROC曲線下面積為0.81，表現(xiàn)了高敏肌鈣蛋白能夠增加非ST段心梗的早期檢出率[17]。而在另一項研究中，在3 h內測定的高敏肌鈣蛋白陽性預測值96%，陰性預測值100%，特異度在90%～94%，支持在早期排除AMI的價值[18]。

當然，肌鈣蛋白也并非只要AMI時才升高，例如膿毒癥、心衰、腎衰、肺栓塞和心包炎等[19-20]。當沒有ACS的臨床證據(jù)，但肌鈣蛋白卻升高的患者，應考慮其他心肌損傷疾病。如創(chuàng)傷性心臟病，充血性心衰，高血壓等[21]。

二、其他生物標志物

1.B型鈉尿肽(B-type natriuretic peptide，BNP)：在心室負荷增加或心室增大時，BNP合成分泌并釋放入血控制體液和電解質的動態(tài)平衡。BNP主要用于診斷心力衰竭、監(jiān)測病程進展、對療效和預后進行評估。AMI患者在治療后對其心室功能的恢復狀況進行評估，當治療有效時，BNP水平明顯下降，BNP水平的持續(xù)升高或持續(xù)不降低，通常提示患者的心力衰竭未得到糾正或進一步加重[22]。同時BNP和NT-proBNP在ACS的診斷和早期危險分層也有重要意義[23]。

研究表明，以BNP在血中濃度超過100 pg/mL為界，心衰的診斷敏感度達90%以上，特異度達84%，因此對于心肌損傷的陽性閾值也可選擇BNP 100 pg/mL[24]。同時，有研究報導在不穩(wěn)定心絞痛患者中， BNP水平和患者的死亡率密切相關[25]。

2.C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)：CRP最早是在急性肺炎患者外周血中發(fā)現(xiàn)的一種急性時相反應蛋白,屬非特異性的炎癥標志物,參與動脈粥樣硬化的病程發(fā)展，包括從單核細胞的募集到最后斑塊破裂[26]。超敏C反應蛋白(high sensitive C-reactive protein，hs-CRP)和CRP是同一種物質但臨床意義卻不同：CRP反應機體的炎癥和創(chuàng)傷，而hs-CRP 更多被用來預測粥樣硬化性心腦血管事件，但其升高的程度與冠脈狹窄程度及心肌損傷范圍無關。由于本身介導動脈粥樣斑塊形成，其升高是AMI的獨立高危因素和早期診斷的輔助指標，可用于心血管疾病危險程度的評估。在除外其他因素引起hs-CRP水平增高情況下，hs-CRP可反映冠狀動脈炎癥情況，但其特異度比較差，因此不能作為診斷的惟一依據(jù)[27]。

心肌壞死后，由于炎癥反應CRP上升，也有報導CRP和梗死的大小和程度相關，基線CRP濃度可以預測心血管事件發(fā)生[28-29]，但最佳檢測時間還不清楚。NACB指南指出不應把CRP作為期初評估，并且把CRP作為ⅡA級推薦作為ACS的早期危險分層[13]。

3.心肌型脂肪酸結合蛋白(heart-type fatty acid binding protein，H-FABP)：H-FABP大量存在于心肌組織中，比骨骼肌中高10倍，因其可溶、分子量小、心肌特異性強和經腎臟清除快等優(yōu)點，主要作用是調節(jié)細胞脂肪酸代謝和維持脂質穩(wěn)態(tài)，參與細胞信號轉導，心肌缺血時能保護心肌，對于早期ACS特別是3 h內的AMI診斷有重要意義[30]。

對于AMI早期的診斷價值，在研究[31]提到其血中濃度在胸痛發(fā)生后1～3 h升高，6～8 h達峰，24～30 h恢復正常，在心肌損傷后釋放入血的速率超過任何已知心肌酶。研究[32]得出結論：H-FABP對AMI初期診斷比Mb、cTnT及CK-MB有更高的敏感性，是早期診斷的重要標志物，但4種指標的診斷特異性無明顯差異。Fiqiel等發(fā)現(xiàn)[30]，入院時H-FABP明顯優(yōu)于其他心肌損傷標記物，其敏感度為94.7%，特異度為100%，陽性預測值和陰性預測值分別為100%和93.4%，可作為早期診斷非ST段抬高型心梗的較好標志物，排除心肌壞死，但同時也提到H-FABP不宜單獨用來排除AMI。

4.和肽素(copeptin)：和肽素是和血管加壓素等量產生和分泌的物質，半衰期較長，更容易檢測[33]。在一項前瞻性研究結果顯示AMI患者和肽素水平在早期達到高峰，維持3～5 d，且在后期的隨訪中發(fā)現(xiàn)和肽素的濃度和心衰等惡性心血管事件相關[34]。在和肌鈣蛋白比較中，Reichlin等[35]發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測和肽素和肌鈣蛋白能夠提高診斷準確性(聯(lián)合檢測ROC曲線下面積為0.97，單獨檢測肌鈣蛋白為0.86)。

三、新型生物標志物微小RNA(miRNA)

目前，臨床上使用的生物標志物大多是蛋白質及多肽類，近些年來，分子遺傳水平的仍在研究中[36]。而miRNAs由于其具有組織和細胞特異性，參與多種病理生理過程，有望成為一種新型生物標志物[37]。

盡管miRNA的功能尚未完全闡明，但目前己明確某些miRNA有一定的組織特異性并參與斑塊穩(wěn)定性的調節(jié)，比如心肌肌組織富含的miR-133a，miR-499，miR-208a等[38]。miRNA的如下特性使其具備了作為生物標志物應用于臨床診斷的潛力：(1)具有極強的穩(wěn)定性。(2)穩(wěn)定存在于體液循環(huán)。(3)表達的組織特異性。(4)miRNA反應更為迅速。(5)靈敏特異的miRNA檢測手段40。另外miRNA不但可以抵抗酶的消化，而且耐酸耐堿，更不受溫度變化及放置時間的影響比蛋白更適合作為標志物[39]。

關于miRNA作為檢測急性心肌梗死的生物標記物，目前研究較多的是miRNA-499、miRNA-1、miRNA-133和miRNA-208[40-41]。Ai等[42]則針對心肌組織高表達，同時在心肌缺血后會表達增高的miR-1，對急性心梗人群和非心梗人群血漿中的含量進行了研究，他們發(fā)現(xiàn)miR-1在急性心梗人群中的含量要高于非心梗人群，其含量和心電圖QRS 波的寬度存在正相關性，提示血漿中心臟高表達的miRNA可作為急性心梗診斷新的標志物，可能對急性心梗的預后判斷具有一定的價值。Wang等[43]從理想的心肌標志物的特征出發(fā)，篩選了心臟特異高表達而血漿中缺乏或含量微弱的miRNA作為候選標志物，包括miR-208a、-499、-133a 和-1，利用開胸結扎前降支的方法制備了急性心梗動物模型，發(fā)現(xiàn)這4個miRNA在冠脈結扎1 h 后均能檢測到明顯的增加，在6～12 h血漿中含量達到高峰，24 h的時候顯著下降，結合miRNA的表達譜以及單純開胸不結扎冠脈的假手術組血漿中miR-133a、-1和-499 也出現(xiàn)不同程度增加的現(xiàn)象，他們認為心臟特異的miR-208a是一個較好的候選標志物。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，血漿中這4個miRNA的平均水平在急性心梗人群中顯著高于非心梗人群，這種差異能有效地區(qū)分心梗人群(ROC 分析曲線下面積均在0.8 以上)；尤其是miR-208a，在非心梗人群中檢測不到(PCR 結果CT 值>40)，而在90.9%(30/33)的心梗人群中能檢測到顯著增高。進一步對急性心梗人群按照胸痛時間進行亞組分析時發(fā)現(xiàn)，在胸痛4 h以內miR-208a對急性心梗的檢出率要高于肌鈣蛋白，提示血漿miRNA 很可能作為急性心梗新的診斷標志物。新近研究顯示，miR-499作為AMI標志物的靈敏度及特異度較miR-208、miR-1和miR-133a高；與單獨使用cTnT和miR-499相比，兩者結合能提高AMI診斷的敏感性和特異性[45]。但miRNAs也并非只在急性心肌梗死中才特異性表達，一項研究指出，miRNAs在不穩(wěn)定型心絞痛和心肌梗死患者的血漿中有重疊，但如何區(qū)分，尚未具體說明[46]。

通過以上敘述，我們可以看到，miRNAs具有在外周血中出現(xiàn)較早且穩(wěn)定、準確率高、結構簡單等優(yōu)勢，尤其是和目前高敏肌鈣蛋白的聯(lián)合應用，也許可以提高檢出率和準確率。然而在推廣應用之前，還有許多需要解決的問題: 目前所報道的研究納入樣本量都較小，需要進一步的大樣本數(shù)據(jù)來驗證，包括目前的從AMI的發(fā)病到外周血中miRNAs可檢測到的最短時間、參考區(qū)間及出現(xiàn)的miRNAs種類及順序、聯(lián)合檢測的方案等。

四、總結

心肌損傷過程中各種生化標志物的結構和診斷的特異性及敏感性各具特點，對早期診斷心肌損傷，降低其發(fā)病率和病死率起著重要的作用。隨著醫(yī)學的不斷發(fā)展和進步，越來越多的心肌損傷標志物正在被發(fā)現(xiàn)，其特異性和敏感性也在不斷提高。由于在血中出現(xiàn)、達峰、維持及消退的時間不同，心肌損傷標志物的聯(lián)合檢測在心血管疾病患者的預測、篩選、診斷、治療和預后評估中定會占據(jù)重要地位。目前肌鈣蛋白(cTn)及其新一代超敏肌鈣蛋白(hs—cTn)是診斷心肌梗死的金標準，和肌酸激酶(CK-MB)、肌紅蛋白的聯(lián)合檢測可以實現(xiàn)早期診斷、提高準確性和監(jiān)測病情進展。但當臨床檢測到這些標志物時，心肌細胞可能已經發(fā)生了不可逆的損傷，miRNA等新型生物標志物的靈敏度和特異度不亞于肌鈣蛋白，作為一類參與轉錄后水平調節(jié)的非編碼小分子RNA，其中miRNA-1、miRNA-133、miRNA-208、miRNA-499研究的最多，這些miRNAs在心肌梗死早期(<3 h)甚至比肌鈣蛋白更敏感，達峰時間更早，有望成為心肌損傷，尤其是急性心肌梗死新的診斷標志物和治療靶點。

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