大力加強(qiáng)非結(jié)核分枝桿菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷研究

鄭惠文 趙雁林

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·專家論壇·

大力加強(qiáng)非結(jié)核分枝桿菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷研究

鄭惠文 趙雁林

非結(jié)核分枝桿菌(NTM)病的發(fā)病率在全球逐年增加，但由于NTM病與結(jié)核病相比有相似的臨床癥狀，且致病菌種繁多，鑒別診斷困難，增加了治療的難度，所以對(duì)分枝桿菌進(jìn)行菌種鑒定將在疾病的診斷、治療及預(yù)后上具有重要意義?，F(xiàn)代細(xì)菌學(xué)方法的快速鑒別診斷，以及隨著免疫技術(shù)和分子生物技術(shù)的發(fā)展，為NTM的鑒定提供了更快速、準(zhǔn)確的診斷方法。

分枝桿菌, 非典型性； 實(shí)驗(yàn)室技術(shù)和方法； 診斷, 鑒別

非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria, NTM)是一種條件致病菌，包括200多種不同的分枝桿菌[1]。自1899年Lenmann與Neumann在環(huán)境中分離到不同于結(jié)核分枝桿菌的分枝桿菌，并將其命名為草分枝桿菌后，NTM菌種陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。雖然NTM對(duì)人的致病程度較結(jié)核分枝桿菌弱，但最近幾年發(fā)現(xiàn)許多NTM菌種與人類感染有關(guān)，如肺病、皮膚和可播散性疾病。對(duì)患有囊性纖維性變(cystic fibrosis, CF)、支氣管擴(kuò)張和免疫抑制狀態(tài)的患者有很大的威脅[2]。由于NTM病不會(huì)傳染，大多數(shù)國(guó)家并不強(qiáng)制報(bào)告，因此監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)不僅有限且不可靠[3]。現(xiàn)有資料表明，在世界范圍內(nèi)NTM病的患病率不斷增加，在許多國(guó)家已有報(bào)道，包括加拿大[4-5]、美國(guó)[6-7]、英國(guó)[8]、德國(guó)[9]、日本[10]。我國(guó)NTM的分離率也出現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)[11]，山東省多個(gè)地區(qū)的陽(yáng)性培養(yǎng)標(biāo)本中，1.37%為NTM[12]，江蘇NTM占3.37%, 上海NTM占5.9%，福建NTM占10.2%，廣東NTM占19.2%[12-16]。飲水系統(tǒng)中NTM的增加，老年人、慢性阻塞性肺疾病、過(guò)敏性肺炎、腎透析或臟器移植時(shí)給予免疫抑制藥、惡性腫瘤患者，以及腎上腺糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用等都可使NTM病發(fā)病率增加[17-20]。但由于NTM病與結(jié)核病相比有相似的臨床癥狀，且致病菌種繁多，鑒別診斷困難，增加了治療的難度。所以，對(duì)分枝桿菌進(jìn)行菌種鑒定將在疾病的診斷、治療及預(yù)后上具有重要意義[21]。

近年來(lái), NTM的臨床實(shí)驗(yàn)室分離頻率有所增加, 這與現(xiàn)代細(xì)菌學(xué)方法的快速鑒別診斷密切相關(guān), 并且隨著免疫技術(shù)和分子生物技術(shù)的發(fā)展，為NTM的鑒定提供了更快速、準(zhǔn)確的診斷方法。筆者就目前NTM感染常用實(shí)驗(yàn)室診斷方法總結(jié)如下。

一、抗酸染色和細(xì)菌培養(yǎng)

涂片鏡檢是一種快速檢測(cè)分枝桿菌的廉價(jià)方法，目前常用的方法包括萋-尼抗酸染色和金胺O熒光染色。但不能將NTM與結(jié)核分枝桿菌區(qū)分，特異度較差[1]。核酸擴(kuò)增(NAA)實(shí)驗(yàn)是直接從臨床樣本中快速檢測(cè)分枝桿菌的理想方法，敏感度高于涂片鏡檢[22]。許多商業(yè)化的測(cè)試已被廣泛使用，如Xpert MTB/RIF和CobasTaqMan MTB。趙冰等[23]通過(guò)評(píng)價(jià)Xpert MTB/RIF檢測(cè)技術(shù)在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用證實(shí)，其敏感度高于涂片鏡檢和固體培養(yǎng)試驗(yàn)。

痰標(biāo)本培養(yǎng)仍然是實(shí)驗(yàn)室鑒定NTM的金標(biāo)準(zhǔn)，常用的培養(yǎng)基包括固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基包括以雞卵為固化及營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基(如羅氏培養(yǎng)基)，或以瓊脂為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基(如7H10和7H11)。在固體培養(yǎng)基上可觀察分枝桿菌的克隆形態(tài)、生長(zhǎng)速度，并能依據(jù)產(chǎn)色來(lái)鑒別菌種，對(duì)感染的微生物進(jìn)行定量。目前，實(shí)驗(yàn)室常用的液體培養(yǎng)基是熒光底物培養(yǎng)基、C標(biāo)記底物的培養(yǎng)基(BAETEC 460系統(tǒng))、熒光感應(yīng)器檢測(cè)系統(tǒng)(BACTEC 960和MGIT系統(tǒng))。液體培養(yǎng)的敏感度高于固體培養(yǎng)基，并且培養(yǎng)時(shí)間短，但易于被其他微生物污染。因此，所有的分枝桿菌都應(yīng)進(jìn)行固體和液體培養(yǎng)，兩種方法的同時(shí)使用能夠?qū)z測(cè)NTM的敏感度增加15%[24]。

二、免疫學(xué)鑒定

免疫膠體金技術(shù)(immune colloidal gold technique)，是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。MPB64抗原膠體金法利用MPB64蛋白(結(jié)核分枝桿菌在生長(zhǎng)繁殖中分泌的一種具有特殊作用的蛋白質(zhì))在NTM中極少存在的特點(diǎn)設(shè)計(jì)的，由此可以進(jìn)行初步菌種鑒定[25]。分枝桿菌培養(yǎng)物懸濁液或培養(yǎng)液均可直接作為標(biāo)本，加入膠體金檢測(cè)孔中15 min后即可觀察結(jié)果。當(dāng)檢測(cè)區(qū)未出現(xiàn)紫紅色條帶時(shí)為陰性結(jié)果，表明培養(yǎng)物中無(wú)MPB64蛋白，即可判定此分枝桿菌菌種為NTM。張帆等[26]用MPB64抗原膠體金法進(jìn)行NTM鑒定，敏感度為96.9%，特異度為100.0%，與傳統(tǒng)分枝桿菌菌種鑒定方法檢測(cè)的一致率為97.8%。此方法操作簡(jiǎn)便，不需要特殊的儀器，能在短時(shí)間獲得結(jié)果，但該法僅能用于NTM的初步鑒定，無(wú)法對(duì)NTM菌種進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

三、分子學(xué)鑒定

由于NTM分離株的臨床特點(diǎn)和藥物敏感性特征有很大的不同，臨床治療方案也不同，這使得NTM菌種鑒定非常重要。因此，建議將NTM菌種鑒定到種[24]。在過(guò)去20年間，實(shí)驗(yàn)室鑒定分枝桿菌的方法發(fā)生了明顯的變化，分子學(xué)方法已經(jīng)代替了傳統(tǒng)的生化方法和高效液相色譜技術(shù)，如線性探針雜交，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以及DNA測(cè)序[22, 24]。

分子線性探針(line probe assay, LPA)將分枝桿菌特異的基因序列用探針標(biāo)記，來(lái)識(shí)別與之互補(bǔ)的特異基因序列，通過(guò)酶聯(lián)免疫顯色，從而將NTM與結(jié)核分枝桿菌區(qū)分開(kāi)來(lái)，以德國(guó)HAIN Lifescience公司的Genotype MTBDR(the Genotype MTBDR LPA, MTBDR-LPA) 分子線性探針?lè)榇?。陳琛和馬遠(yuǎn)征[27]研究發(fā)現(xiàn)MTBDR-LPA與BACTEC MGIT 960的抑制率高達(dá)100.0%, 與基因測(cè)序法結(jié)果一致率為91.3%。該方法具有操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，但成本較高，鑒定的種類有限，直接應(yīng)用到臨床檢測(cè)中仍很困難。

熒光定量PCR 通過(guò)將雙重PCR和Taqman 探針技術(shù)相結(jié)合，針對(duì)分枝桿菌的特異性序列設(shè)計(jì)探針和引物，探針用不同的熒光基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記，從而對(duì)分枝桿菌的核酸進(jìn)行定性檢測(cè)。當(dāng)反應(yīng)體系中有目的基因存在時(shí)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，不斷釋放出熒光，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)菌種的鑒別。張潔等[28]通過(guò)比較PCR-熒光探針與傳統(tǒng)培養(yǎng)法對(duì)菌種的鑒定，發(fā)現(xiàn)PCR-熒光探針?lè)ㄨb定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和NTM的準(zhǔn)確性較高，與測(cè)序相比復(fù)合率達(dá)到100.0%。該方法能夠縮短檢測(cè)報(bào)告周期，且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，可以滿足臨床確診的需求。

基因測(cè)序是NTM菌種鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，并且可用于不常見(jiàn)的菌種或?qū)⒕N鑒定到亞種水平。其中，16S rRNA基因測(cè)序快速、準(zhǔn)確，被認(rèn)為是鑒定分枝桿菌的金標(biāo)準(zhǔn)[29]。16S rRNA含有1500個(gè)核苷酸序列，具有高度保守性和相對(duì)可變性，對(duì)保守區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序能將細(xì)菌鑒別到種、屬?？勺儏^(qū)是分枝桿菌屬或種所特有的，對(duì)其進(jìn)行分析可將生物菌種鑒定到亞種水平。然而，16S rRNA基因?qū)π碌木N或親緣關(guān)系近的菌種無(wú)法區(qū)分。因此，需要選擇多態(tài)性更高的靶基因，如RNA聚合酶的β亞基 (rpoB)、熱休克蛋白65 (hsp65)、16S-23S rRNA基因間隔區(qū) (ITS) 等基因[30]。更多同源序列的聯(lián)合應(yīng)用能夠發(fā)現(xiàn)新的菌種或亞種，如16S rRNA和ITS鑒定了膿腫分枝桿菌復(fù)合群，在進(jìn)一步使用hsp65和rpoB基因后，將膿腫分枝桿菌復(fù)合群分為膿腫分枝桿菌亞種、M.bolletii亞種和M.massi-liense亞種[25]。但就鑒別能力而言，hsp65優(yōu)于rpoB和ITS，16S rRNA的鑒別能力最低。然而，由于16S rRNA的相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)最為完整，因此建議常規(guī)使用[31-32]。為提高菌種鑒定的分辨能力，建議至少將hsp65、rpoB和ITS基因之一與16S rRNA聯(lián)合使用。此外，目前應(yīng)用擴(kuò)增不同靶基因的商業(yè)化試劑盒來(lái)區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和許多NTM菌種。通過(guò)將分枝桿菌特異的基因序列用探針標(biāo)記，并將探針標(biāo)記在固相的支持物上(如纖維素膜、芯片等)，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿优c待測(cè)序列的雜交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息，從而達(dá)到鑒別菌種的目的[33]。但鑒定的種類有限，僅能鑒別臨床中最常見(jiàn)的部分NTM菌種，對(duì)無(wú)法鑒定的菌種需進(jìn)一步采用其他方法鑒別。

目前，基因測(cè)序是鑒定NTM菌種最正確的方法，然而鑒定到種水平有時(shí)需要分析好幾個(gè)基因，并且僅限于專業(yè)實(shí)驗(yàn)室。最近幾年，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDL-TOF MS)方法在臨床上越來(lái)越多地應(yīng)用于細(xì)菌和真菌感染的研究，是鑒定NTM的潛在方法[33]。原理是在已知的NTM菌株文庫(kù)中，通過(guò)比較NTM菌種特異的分子質(zhì)譜類型，主要是核糖體蛋白，從而達(dá)到鑒定菌種的目的[33]。在最近研究中，通過(guò)比較MALDL-TOF MS和常規(guī)的PCR方法對(duì)NTM的鑒定，結(jié)果表明，MALDL-TOF MS是一種正確、快速和高效的方法。然而，與測(cè)序相比，MALDL-TOF MS需要的菌量較大，分辨率主要取決于數(shù)據(jù)庫(kù)的質(zhì)量，并且不能將膿腫分枝桿菌復(fù)合群鑒定到亞種水平[34-35]。

四、NTM耐藥的分子診斷

藥物敏感性試驗(yàn)是制定理想的治療方案所必需的。但由于NTM的細(xì)胞壁通透性低，藥物與靶位點(diǎn)的親和力低及藥物外排泵的作用，使得NTM對(duì)大多數(shù)抗結(jié)核藥物具有天然耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，NTM對(duì)某些藥物的耐藥性與特定耐藥基因的突變有關(guān)[36]，如編碼23S rRNA的rrl基因突變與大環(huán)內(nèi)酯類耐藥性有關(guān)，對(duì)阿米卡星藥物的耐受性常與16S rRNA基因(rrs)突變有關(guān)，rpoB基因突變與利福平耐受性有關(guān)。因此，通過(guò)對(duì)藥物靶基因進(jìn)行測(cè)序，及時(shí)發(fā)現(xiàn)耐藥菌株，有助于更好地制定治療方案。

五、NTM病診斷的難點(diǎn)及展望

我國(guó)NTM的分布具有明顯的地域差異，不同地區(qū)的感染率、發(fā)病率和流行菌種各有特點(diǎn)[15, 36]，而目前關(guān)于NTM流行病學(xué)資料的研究較少，又沒(méi)有建立早期、快速、敏感和特異的標(biāo)準(zhǔn)化診斷技術(shù)。此外，由于樣本的臨床癥狀、放射性特征和涂片鏡檢的敏感度和特異度較低，培養(yǎng)仍然是檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。然而培養(yǎng)耗時(shí)，且需要使用不同類型的培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度使細(xì)菌獲得最優(yōu)生長(zhǎng)，不適于臨床早期快速診斷的要求，具有一定的局限性。所以，NTM的實(shí)驗(yàn)室診斷方面迫切需要進(jìn)行更加深入的研究。隨著免疫技術(shù)和分子生物技術(shù)的發(fā)展，為NTM的鑒定提供了更快速、準(zhǔn)確的診斷方法。雖然這些診斷方法展現(xiàn)了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和巨大的應(yīng)用前景，但各診斷方法各有利弊，應(yīng)同時(shí)通過(guò)幾種不同的方法同時(shí)鑒定，克服每項(xiàng)技術(shù)的局限性，發(fā)揮各自優(yōu)勢(shì)，進(jìn)而形成快速、可靠、成本低廉的標(biāo)準(zhǔn)化體系。此外，可以利用結(jié)核病領(lǐng)域的診斷優(yōu)勢(shì)來(lái)解決NTM面臨的挑戰(zhàn)。在過(guò)去幾十年中，結(jié)核病及NTM病實(shí)驗(yàn)室診斷的重大突破之一是Xpert MTB/RIF等分子診斷技術(shù)的出現(xiàn)，雖然有些分子診斷技術(shù)能夠?qū)TM與結(jié)核分枝桿菌區(qū)分開(kāi)來(lái)，但不能將NTM鑒定到種水平。然而，這種進(jìn)步對(duì)包括至少幾種常見(jiàn)的NTM病原重新建立分子診斷平臺(tái)提供了機(jī)會(huì)[37]，應(yīng)大力加強(qiáng)NTM病的實(shí)驗(yàn)室診斷研究，諸如診斷技術(shù)、耐藥機(jī)制、致病機(jī)制和組學(xué)研究，這將有助于確定種的特異性診斷標(biāo)識(shí)，通過(guò)建立快速、特異的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，為臨床早期診斷NTM病提供更多可靠的參考依據(jù)。

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(本文編輯：薛愛(ài)華)

Strengthening laboratory diagnosis of non-tuberculosis mycobacterial disease

ZHENGHui-wen,ZHAOYan-lin.

NationalTuberculosisReferenceLaboratory,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China

ZHAOYan-lin,Email:zhaoyanlin@chinatb.org

The incidence of non-tuberculous mycobacterial (NTM) disease increased year by year in the world. NTM andM.tuberculosishave similar clinical symptoms, and various species lead to a difficult diagnosis which increases the difficulty of treatment. To identify mycobacterium at species level is of great important for the diagnosis, treatment and prognostic of disease. The rapid diagnosis of modern bacteriologic method, and with the development of immunological technique and molecular biotechnology, a fast, reliable, and standardized NTM identification system would be developed.

Mycobacteria, atypical; Laboratory techniques and procedures； Diagnosis, differential

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.09.001

102206 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室

趙雁林，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

2016-08-14)