尼古丁降解菌株HZN7的最佳生長條件及土壤中降解特性

尼古丁降解菌株HZN7的最佳生長條件及土壤中降解特性

馬云，洪駿

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

摘要：利用從杭州農(nóng)藥廠活性污泥中篩選到的一株新型高效降解尼古丁的菌株Shinella sp.HZN7為對象，通過正交試驗對影響菌株生長的pH值、溫度、氯化鈉、葡萄糖、轉(zhuǎn)速等條件參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，得出了其在實驗室條件下的最佳生長條件.通過在土壤中添加煙草廢棄物，利用該高效尼古丁降解菌株Shinella sp.HZN7對模擬煙草廢棄物污染土壤進(jìn)行生物修復(fù)的土壤實驗，實驗表明：添加菌株的處理組與不加菌株的對照組相比，在尼古丁的去除能力、pH值穩(wěn)定性、含水率保持等方面均有較大改善，以及對土壤有機質(zhì)量的變化產(chǎn)生一定的影響，且在一定范圍內(nèi)，隨著煙草廢棄物添加量的增大，生物修復(fù)的效果越明顯.

關(guān)鍵詞：尼古?。徽粚嶒?；降解；生物修復(fù)

收稿日期：2015-03-27

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(21007058)；浙江省自然科學(xué)基金資助項目(GB13031050069)

作者簡介：馬云(1977—)，女，浙江杭州人，副教授，博士，研究方向為環(huán)境微生物，E-mail:mayun@zjut.edu.cn.

中圖分類號：X172

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1006-4303(2015)05-0537-06

Abstract:Taking a strain of bacterium Shinella sp. HZN7 degrading nicotine isolated from the sludge in insecticide factory of Hangzhou as an object, we determined its optimal growth conditions by orthogonal experimental design. The factors are including pH value, temperature, sodium chloride, glucose and the speed of shaking tables. By adding tobacco waste into soil, the soil experiment includes that the bioremediation of the soil contaminating tobacco waste by using the degrading bacterium Shinella sp. HZN7, it indicates that the nicotine removal efficiency was better than the case in which the bacterium Shinella sp. HZN7 was not added. In addition, pH stability with time and the moisture content was improved, the total organic carbon was influenced. The effect of bioremediation was more remarkable with adding more tobacco waste within its limits.

Keywords:nicotine; orthogonal experiment; degradation; bioremediation

Optimal growth conditions and degrading nicotine characteristic

in soil of strain HZN7

MA Yun, HONG Jun

(College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

尼古丁，又名煙堿，是一種存在于茄科植物中的生物堿，也是煙草的重要成分[1].由于尼古丁水溶性很大，能通過口、鼻、支氣管黏膜被人體迅速吸收，進(jìn)入人體后能使人上癮或產(chǎn)生依賴性.重復(fù)使用會對心、腦、肺和血管等造成損傷，嚴(yán)重的還會引發(fā)肺癌等在內(nèi)的多種疾病[2].對比于傳統(tǒng)的物理、化學(xué)處理法，利用微生物降解菌處理環(huán)境中的煙堿類污染是一種高效、經(jīng)濟(jì)和無二次污染的綠色處理方式[3-5].因此，本研究以從實驗室分離得到的一株尼古丁降解菌HZN7為材料，將其生長條件進(jìn)行優(yōu)化，并對其在土壤中降解尼古丁的降解特性進(jìn)行了初步研究，為后續(xù)在實際工程應(yīng)用中利用該菌實現(xiàn)對尼古丁污染土壤的微生物修復(fù)提供了理論依據(jù)[6].

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1菌源

菌株HZN7(申氏桿菌屬，Shinellasp.)為本實驗室分離，保藏至中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2013060.

1.1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(Luria-Bertani medium):含10.0 g/L蛋白胨，5.0 g/L酵母膏和10.0 g/L氯化鈉，pH7.0.

1.1.3煙草廢棄物

取自杭州利群卷煙廠，120 ℃烘干至恒重，密封.

1.1.4供試土壤

采自浙江工業(yè)大學(xué)校園內(nèi)菜地表層土(0～20 cm)，采集土樣預(yù)處理：多點采樣，去除雜物，自然風(fēng)干，研磨均勻，過1 mm(30目)篩后，室溫保存[7].

1.1.5主要儀器設(shè)備

電子天平(AC204)，恒溫振蕩器(THZ-C)，恒溫振蕩搖床，數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9070)，pH計(奧立龍828)，單道移液器(eppendorf),高壓蒸汽滅菌鍋(ES-315)，紫外可見分光光度計(JASCO V-550型)，高效液相色譜儀(HPLC, JASCO 2000 plus)等.

1.2正交試驗

通過比較不同pH值、溫度、氯化鈉、葡萄糖、轉(zhuǎn)速對菌體生長的影響，從中篩選出菌株HZN7的最佳生長條件，確定影響因子的影響順序[8-9].依據(jù)正交實驗設(shè)計，以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過改變pH值、溫度、轉(zhuǎn)速、添加、減少或者改變培養(yǎng)基中某些組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，配制成不同體系的液體培養(yǎng)基.然后按5%的接種量接入在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期的HZN7(OD600=0.90,菌體用無菌水洗滌2次)，搖床培養(yǎng)12 h.取2 mL菌液，6 000 r/min離心5 min,棄上清液，加入等體積去離子水混勻，稀釋至適當(dāng)濃度后，用紫外可見分光光度計在600 nm波長下測定吸光度[10].

1.3土壤試驗

1.3.1土壤的活化預(yù)處理

選取浙江工業(yè)大學(xué)校園內(nèi)菜地表層土作為供試土壤(經(jīng)檢測不含尼古丁)，將研磨過篩后的土壤分別稱取500 g置于2 L的燒杯中，燒杯底部鋪一層直徑約10 mm碎石子，高度約30 mm，隨后在上面鋪蓋3層網(wǎng)狀紗布封墊，將土壤置于紗布之上.在土壤中加入適量無菌水并用玻璃棒不斷攪拌使其含水率保持在20%左右，玻璃棒的攪拌不僅使水分均勻分布，還能使土壤疏松，保證足夠的O2補給.最后用保鮮膜封住燒杯口，防止表層土壤中的水分迅速揮發(fā)，保鮮膜上留有一些小孔，保證與外部空氣流通.以上處理過的供試土壤在室溫下放置3 d以待土壤的活化，期間用玻璃棒定時攪拌和疏松土壤、添加適量水分保持土壤的含氧量和含水率.

1.3.2煙草廢棄物及菌液的添加

在預(yù)處理后的土壤中添加煙草廢棄物，用攪拌的方式將其混勻.本實驗設(shè)置5個實驗處理組，每組添加的煙草廢棄物量依次為25，50，75，100，125 g，每組各設(shè)置3個重復(fù).同時設(shè)置對照處理組，每組添加跟實驗組相同量的煙草廢棄物，只是不加尼古丁降解菌，同樣每組各設(shè)置3個重復(fù).各組實驗均在室溫條件下進(jìn)行，并適時補充水分，保持20%左右的土壤含水率.由于煙草廢棄物進(jìn)入土壤中需要一個過程(浸潤時間大約2 d左右，預(yù)實驗結(jié)果)，因此，在添加煙草廢棄物的第3d開始投加處于生長穩(wěn)定期(OD600約為1.5)的尼古丁高效降解菌Shinellasp.HZN7，投加比例為5%.實驗周期為4周，在每周的第1 d添加一次與首次添加量相等的煙草廢棄物，實驗組在第3次添加煙草廢棄物后的第3 d(即第3周的第3 d)再投加1次相同比例的尼古丁高效降解菌Shinellasp.HZN7.

1.3.3尼古丁殘留量、pH值、土壤含水率、有機質(zhì)量的測定

尼古丁殘留量用水溶法測定，每次在不同土層取10 g土樣，加入30 mL去離子水，在30 ℃恒溫?fù)u床中振蕩1 h，靜置1 h，6 000 r/min離心10 min(2次)，取上層水溶液過0.45 μm水系濾膜，濾液待液相色譜測定.檢測條件為：柱溫30 ℃，流動相采用V(甲醇)∶V(水)∶V(濃硫酸)=10∶90∶0.01，流速0.6 mL/min，檢測波長254 nm，進(jìn)樣量20 μL.pH值用玻璃電極法測定，供試m(土壤)∶m(水)=1∶5比例混合測定.含水率的測定，每次稱取2 g土樣，放置于已知重量的可加熱器皿中，將器皿放入105 ℃烘箱中，干燥2 h，取出容器冷卻后稱重，根據(jù)干燥前后土壤和器皿總重量的減少量計算出土壤的含水率(%).有機質(zhì)量采用重鉻酸鉀氧化-分光光度法測定(參照HJ615—2011《中華人民共和國國家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)》)，本法直接測定的是土壤中有機碳的量，根據(jù)有機碳換算成有機質(zhì)系數(shù)，將其換算成土壤中有機質(zhì)的量.以上指標(biāo)均每隔1 d測定1次.

2結(jié)果與分析

2.1菌株HZN7最佳生長條件的正交試驗

本實驗采用5因素3水平設(shè)計(表1)，以L18(35)設(shè)計，每一種組合分別設(shè)3個重復(fù).根據(jù)K值、R值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，K值表示的是同一因素各水平的實驗結(jié)果之和，k值表示K值的平均值，K值的大小則反映該因素中各水平對實驗結(jié)果影響的大小.R(極差)為同一因素中kmax-kmin，根據(jù)極差的大小可以判斷各因素對實驗指標(biāo)的影響主次，R值的大小說明該因素對實驗結(jié)果影響的大小，R值越大，說明該因素對實驗結(jié)果影響越大，R值越小則說明該因素的影響越小.

表1　各因素水平列表

表2　L 18(3 5)正交試驗結(jié)果

注：1)A，B，C，D，E分別代表相應(yīng)的因素，下標(biāo)代表其對應(yīng)的水平.

由表2可知：根據(jù)正交試驗的結(jié)果，菌株HZN7的最佳生長條件pH值為7.0，葡萄糖10 g/L，氯化鈉10 g/L，溫度40 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min.按上述條件進(jìn)行實驗，搖床培養(yǎng)12 h，菌株HZN7的OD600達(dá)到1.517.由此可知，A2B3C2D3E2為菌株的最佳生長條件，且各因素的影響順序為C>A>B>E>D.

2.2土壤試驗

2.2.1不同量煙草廢棄物污染下尼古丁的降解

土壤中的尼古丁主要來自于煙草及其廢棄物、煙堿型農(nóng)藥、含尼古丁的藥劑等[11].由于考慮到現(xiàn)實情況下，工廠附近的含尼古丁的廢棄物會以堆砌的方式長期存放于一處，容易造成土壤中尼古丁的殘留量呈現(xiàn)復(fù)合增加的趨勢，因此本試驗采用重復(fù)添加煙草廢棄物的方法，與現(xiàn)實相類似[12].對添加不同量煙草廢棄物情況下土壤中尼古丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較，由圖1可知：在添加尼古丁高效降解菌株HZN7的情況下，菌株對煙草廢棄物污染土壤中的尼古丁的降解具有協(xié)助作用，對尼古丁污染土壤顯示出了一定的修復(fù)能力.與添加菌液的處理組相比，添加煙草廢棄物量較少時，如25 g和50 g，土壤本身的自凈能力也能將少量的尼古丁降解去除，但添加菌液處理組的尼古丁降解速度明顯要高于對照組.

圖1　不同添加量下尼古丁降解情況的比較 Fig.1　Comparation of the nicotine degradation with different adding amount

在添加煙草廢棄物量較多的情況下，如100 g和125 g，未添加菌液的對照組土壤中尼古丁的降解速度明顯低于加菌的處理組.這可能是由于重復(fù)且大量添加高污染物的情況下，高濃度的尼古丁對土壤中的土著微生物產(chǎn)生毒性，造成了生理抑制的原因，超出了土壤的自凈能力，所以隨著時間的推移，土壤中尼古丁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)出累積性.從圖1可知：在添加量為100 g的煙草廢棄物情況下的尼古丁的降解效果最為理想，土壤中尼古丁殘留量始終控制在0.5 g/kg以下，不會產(chǎn)生累積性的污染.

2.2.2不同量煙草廢棄物污染下的土壤pH值變化

由于土壤中微生物的活動需要特定的理化環(huán)境，可能會對土壤原有的pH值發(fā)生改變，因此對土壤pH值的監(jiān)測，有利于弄清土壤中特定微生物的生存狀態(tài).如圖2所示，在微生物降解尼古丁的過程中，土壤pH值整體呈上升趨勢.在添加煙草廢棄物初期，土壤pH值會明顯下降，且添加量越多，pH值降低越多，這可能是由于煙草廢棄物中含有的一些醇類、脂類物質(zhì)和不飽和脂肪酸等酸類物質(zhì)造成的[13].在添加的煙草廢棄物量較少的情況下，如25 g和50 g，添加菌液的處理組與對照組相比，pH值在變化趨勢、范圍上具有較好的一致性，這可能是由于污染物較少，土壤中的降解微生物在還未達(dá)到最佳理化條件下，污染物就被降解殆盡.但是，在煙草廢棄物添加量較大、高污染的情況下，處理組土壤的pH值要高于對照組，且維持在8.5左右.說明在此pH值條件下最有利于尼古丁降解微生物的生長，此時尼古丁的降解速率可能也是最大.

2.2.3不同量煙草廢棄物污染土壤的含水率變化

土壤含水率也是每隔1 d測量1次，雖然煙草廢棄物中含有的大量煙葉、煙花、煙根、煙桿，其中的纖維素、木質(zhì)素等物質(zhì)對水分的保持具有很大貢獻(xiàn)[14]，但隨著時間推移，土壤水分會由于揮發(fā)以及微生物的活動而消耗許多，因此在整個實驗過程的中期(即第3周開始時)補充1次水分，以保持土壤濕度不至于太低，以至于影響微生物的生長.如圖3所示，整個實驗過程中土壤的含水率始終維持在16%～22%之間，對比各不同煙草廢棄物污染程度下的實驗組和其對照組，發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)間的差異不是很大,說明尼古丁高效降解菌在降解土壤中尼古丁的過程中對土壤含水率的影響不大.

圖2　不同添加量下pH情況的比較 Fig.2　Comparation of the pH with different adding amount

圖3　不同添加量下含水率變化情況的比較 Fig.3　Comparation of the moisture content with different adding amount

2.2.4不同量煙草廢棄物污染土壤的有機質(zhì)變化

由于土壤中有機質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)受微生物影響較大，因此對土壤有機質(zhì)的測定在某種意義上也可以反映微生物的活動情況.如圖4所示，在添加煙草廢棄物之初，土壤中的有機質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)會明顯上升，這是由于煙草廢棄物中含有大量的有機化合物，如有機酸、生物堿、TSNA等[15-16]，很顯然，土壤中有機質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)與添加的煙草廢棄物的量呈正相關(guān).雖然菌株HZN7和土壤中的土著微生物對煙草廢棄物中的有機化合物有代謝作用，但隨著大量重復(fù)的添加煙草廢棄物，超出了菌株HZN7和土壤中的土著微生物的承受能力，而且煙草廢棄物中的某些組分對微生物有毒害作用[17-18]，導(dǎo)致土壤有機質(zhì)總量在循環(huán)累積增加.對比觀察土壤中尼古丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化和土壤有機質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化，發(fā)現(xiàn)兩者的變化曲線有一定的關(guān)聯(lián)性，差別在于有機質(zhì)的降解程度沒有尼古丁徹底，原因可能是煙草廢棄物中的有機化合物成份的復(fù)雜性、多樣性，導(dǎo)致土壤中的土著微生物對有機質(zhì)的降解速度低于有機質(zhì)加入的速度，而導(dǎo)致有機質(zhì)積累.

圖4　不同添加量下土壤中有機質(zhì)變化情況的比較 Fig.4　Comparation of the TOC in soil with different adding amount

3結(jié)論

本研究對菌株HZN7的生長條件進(jìn)行了優(yōu)化，菌株HZN7在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中(葡萄糖10 g/L，氯化鈉10 g/L，pH控制7.0)，置于40 ℃，180 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12 h，菌體生長量達(dá)到最大，OD600達(dá)到1.517.該實驗結(jié)果為后期在工業(yè)上大量生產(chǎn)高效尼古丁降解菌HZN7提供了一定的指導(dǎo)性作用.尼古丁高效降解菌在土壤中降解煙草廢棄物的實驗表明：在不同量煙草廢棄物污染程度下，添加菌株HZN7的處理組與不添加菌株的對照組，尼古丁的去除率得到明顯提升，且煙草廢棄物添加量在100 g時，對于尼古丁的去除，土壤的修復(fù)效果最佳.同時添加了高效降解菌HZN7的土壤，對于維持土壤pH值、含水率、改變微生物的群落結(jié)構(gòu)起到了積極的作用，為后續(xù)對于煙草廢棄物污染的土壤的修復(fù)，做出了一定的理論貢獻(xiàn).

參考文獻(xiàn)：

[1]BENOWITZ N L. Nicotine addiction[J]. New England Journal of Medicine,2010,362(24):2295-2303.

[2]HAWKINS B T, ABBRUSCATO T J, EGLETON R D, et al. Nicotine increases in vivo blood-brain barrier permeability and alters cerebral microvascular tight junction protein distribution[J]. Brain Research,2004,1027(1):48-58.

[3]BRENNER K, PANCHWAGH A, RANGRASS S, et al.Biomethanation of tobacco waste[J]. Environmental Pollution,1995,90(2):199-202.

[4]BRANDSCH R. Microbiology and biochemistry of nicotine degradation[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2006,69(5):493-498.

[5]WADA E, YAMASAKI K. Mechanism of microbial degradation of nicotine[J]. Science,1953,117：152-153.

[6]趙巍巍，邊拯民，高鶴南，等.煙嘧磺隆降解菌最佳生長條件及其在土壤中的降解特性[J].農(nóng)藥，2010，49(1):41-43.

[7]WANG Xin , TANG Lu , YAO Yanlai , et al. Bioremediation of the tobacco waste-contaminated soil byPseudomonassp. HF-1:nicotine degradation and microbial community analysis[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2013,97:6077-6088.

[8]張小華，張國順，武俊，等.敵敵畏降解菌(DDV-1)最佳生長條件的正交實驗及其在土壤中的降解特性研究[J].土壤通報，2005，36(5)：731-734.

[9]石炳興，趙紅，劉喜朋，等.抗生素AGPM搖瓶發(fā)酵條件的正交試驗[J].過程工程學(xué)報，2001，4(1)：442-444.

[10]馬云，劉學(xué)虎，洪駿.雙酚A降解菌的分離鑒定和降解特性研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)報，2014，42(2)：162-166.

[11]BEKETOV M A, LIESS M.Actue and delayed effects of the neonicotinoid insecticide thiacloprid on seven freshwater arthropods[J]. Environmental Toxicology and Chemistry,2008,27(2):461-470.

[12]王欣.Pseudomonassp. HF-1響應(yīng)尼古丁脅迫的代謝組學(xué)分析及其降解機制與污染修復(fù)[D].杭州：浙江大學(xué)，2012.

[13]WANG M, YANG G, MIN H, et al. A novel nicotine catabolic plasmid PMH1 inPseudomonassp. strain HF-1[J]. Can Journal Microbiol,2009,55(3):228-233.

[14]BARRETT R E. Tobacco aging, enzymes of bright and burley tobaccos[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1957,5(3):220-224.

[15]WANG S N, XU P, TANG H Z, et al. Biodegradation and detoxification of nicotine in tobacco solid waste by aPseudomonassp[J]. Biotechnology Letters，2004,26(19):1493-1496.

[16]ZHENG K L, YU D M. A status of the comprehensive utilization of discarded tobacco leave[J]. Journal of Chongqing University,2004(3):61-64.

[17]HOCHSTEIN L, RITTENBERG S C. The bacterial oxidation of nicotine oxidation by cell-free preparations[J]. Journal of Biological Chemistry,1959,234(1):151-155.

[18]BATHAM H. Nitrification in soils:Ⅱ[J].Soil Science,1927,24(3):187-204.

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