黃芪聯(lián)合應用阿托伐他汀對兔急性心肌梗死不同部位瞬間外向鉀電流影響的研究*

實 驗 研 究

黃芪聯(lián)合應用阿托伐他汀對兔急性心肌梗死不同部位瞬間外向鉀電流影響的研究*

河北省中醫(yī)院心內(nèi)科

張鐵軍徐穎苗華為董燕平李霞周立穎△王思洲菅鵬輝△△(石家莊 050011)

提要目的：研究黃芪聯(lián)合應用阿托伐他汀對兔急性心肌梗死(AMI)后梗死邊緣區(qū)及非梗死區(qū)心肌細胞瞬間外向鉀電流(Ito)的影響。方法：建立AMI動物模型后，分別通過口服阿托伐他汀、腹腔注射黃芪注射液，酶解分離心室肌細胞,采用全細胞膜片鉗記錄技術(shù)記錄梗死邊緣區(qū)及非梗死區(qū)心外膜心肌細胞(Epicardium， Epi) Ito密度。結(jié)果：AMI梗死邊緣區(qū)及非梗死區(qū)Epi細胞Ito密度與正常心肌細胞相比存在差異性；阿托伐他汀和黃芪分別使受抑制的梗死邊緣區(qū)及非梗死區(qū)Ito密度恢復；阿托伐他汀和黃芪聯(lián)合應用使梗死邊緣區(qū)及非梗死區(qū)Ito密度進一步恢復。結(jié)論：AMI后梗死邊緣區(qū)及非梗死區(qū)Epi細胞Ito密度存在電生理異常；阿托伐他汀和黃芪對心肌梗死梗死邊緣區(qū)及非梗死區(qū)Ito密度的電生理異常有部分改善作用。

關(guān)鍵詞黃芪；阿托伐他汀；心肌梗死；胸痹；真心痛；室性心律失常；膜片鉗技術(shù)；瞬間外向鉀電流

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：碼：A

文章編號：號：1007-5615(2015)03-0001-04

AbstractObjective: to study the effect of Huangqi combined with Atorvastatin on moment outward potassium current Itoon epicardium of infarction marginal zone and non-infarction zone in rabbits with AMI. Methods: AMI animal models prepared, Ito density of Epi was recorded with patch clamp technique by taking orally atorvastatin, getting intraperitoneal injection with Huangqi, separating ventricular myocardium through enzymolysis. Results: there was difference between Itodensities of Epi of infarction zone and normal Epi; Atorvastatin and Huangqi could respectively restore the Itodensity of Epi of both zones; the combination could further restore the density. Conclusion: Itodensity of Epi of post-AMI infarction marginal zone and none-infarction zone has electrophysiological abnormality; Atorvastatin and Huangqi can improve the abnormality to a certain degree.

通訊作者：苗華為，男，教授，碩士研究生導師。

Effect of Huangqi Combined with Atorvastatin on Moment Outward

Potassium Current of Different Parts in Rabbits with AMI

Department of Cardiology, Hebei Hospital of Traditional Chinese Medicine

ZHANGTie-junXUYingMIAOHua-weiDONGYan-pingLIXiaHUXue-jing

WANGSi-zhouJIANPeng-hui(Shijiazhuang 050011)

Key wordsHuangqi; Avorvastatin; MI (myocardial infarction); pectoral stuffiness pain; angina pectoris; arrhythmia ventricular; patch clamp technique; moment outward potassium current

植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為“補藥之長”。臨床醫(yī)學觀察證實在急性心肌梗死病程中可能出現(xiàn)的室性心律失常是引起心源性猝死主要病因。在急性心肌梗死(AMI)臨床治療方案中，黃芪和他汀類藥物常常聯(lián)合應用，取得較好效果。在阿托伐他汀多效性研究中，其抗心律失常作用[1]被日益重視。本文通過全細胞膜片鉗研究方法觀察分別通過口服阿托伐他汀和腹腔注射黃芪對急性心肌梗死后兔心肌左室梗死邊緣區(qū)及非梗死區(qū)單個心外膜心室肌細胞(Epicardium，Epi)進行研究，以進一步了解黃芪和阿托伐他汀對急性心肌梗死后不同部位細胞離子通道影響機制。

*河北省科技支撐計劃項目：No 130202；2012年全國名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設(shè)項目資助。

△石家莊白求恩醫(yī)務(wù)士官學校

△△河北省寧晉縣醫(yī)院(055550)

1材料與方法

1.1實驗動物及分組本研究選用新西蘭純種大耳白兔50只,以上動物均由河北醫(yī)科大學實驗動物中心購買，雌雄不拘，體質(zhì)量1.5～2.0 kg。隨機分為5組，每組10只：正常對照組(CON組)；其它4組均采用結(jié)扎兔左前降支方法[2]以建立心肌梗死模型后，均為建立模型7天后分離心肌梗死梗死邊緣區(qū)(AMI-R)及非梗死區(qū)(AMI-N)細胞，其中分別為心肌梗死組(AMI組)；黃芪組為建立AMI動物模型后,從手術(shù)日開始用黃芪腹腔注射每只4 mL/d,共7天；阿托伐他汀組為建立AMI動物模型后,從手術(shù)日開始連續(xù)口服阿托伐他汀(5 mg/kg·d-1)，共7天；聯(lián)合組為建立AMI動物模型后,從手術(shù)日開始用黃芪腹腔注射每只4 mL/d,同時開始連續(xù)口服阿托伐他汀(5 mg/kg·d-1)，共7天。黃芪注射液由成都地奧制藥生產(chǎn)，阿托伐他汀由輝瑞公司生產(chǎn)。

1.2實驗方法

1.2.1液體配置：參見文獻[2]其中微電極電極內(nèi)液成分: KCl 140, MgCl20.53, EGTA 10, HEPES 10，采用KOH調(diào)節(jié) pH值至7.3。電極外液：在無鈣臺氏液基礎(chǔ)上，增加BaCl2用于阻斷內(nèi)向整流鉀電流，增加氯化鈷用以阻斷鈣電流和鈣依賴性瞬間外向鉀電流(Ito2)。

1.2.2梗死邊緣區(qū)及非梗死區(qū)心室肌細胞分離:建立兔急性心肌梗死模型7天后，猝擊兔頭顱枕部致昏后，開胸逐層分離組織切取心臟并保留主動脈，將心臟置于恒溫無鈣臺氏液中，迅速連接在Langendorff心臟灌流裝置上，將無鈣臺氏液(灌流壓70 cm水柱，恒溫36℃)經(jīng)主動脈根部灌流10 min，以沖去殘血，之后更換無鈣臺氏液(含I 型膠原酶、牛血清蛋白)反復灌流心臟10 min，采用眼科剪仔細剪下距梗死區(qū)邊緣2~4 mm心室壁，即梗死邊緣區(qū)及非梗死區(qū)[2]心室肌組織，以眼科剪、眼科鉗將心室壁橫向解剖，心外膜細胞位于為緊鄰心外膜側(cè)1.0～1.5 mm心肌,精確剪取并剪碎，置于稀釋1倍的酶液中攪拌，在保證氧氣沖入條件下，保持恒溫36℃分離細胞，靜止4～5 min棄去殘余心肌組織，并吸取少量細胞懸濁液，于顯微鏡下看到大量存活的心肌細胞后，過濾細胞懸濁液、離心保存在KB液中保存，靜置約1 h后待細胞膜恢復狀態(tài)后可選取細胞記錄電流。

參考文獻1.2.3心室肌細胞封接與全細胞膜片鉗記錄模式的建立：[3]建立全細胞膜片鉗記錄模式后分別記錄對照組、AMI組、阿托伐他汀組、黃芪組、聯(lián)合組梗死邊緣區(qū)及非梗死區(qū)的Epi心肌細胞Ito-V曲線及鉗制電壓為+70 mV時的電流，并進行組間比較。為消除細胞間誤差,電流值以電流密度(pA /pF)表示。

1.2.4Ito的記錄方法電流-電壓曲線(I-V曲線)：首先將細胞鉗制于-50 mV電壓,后超極化至-160 mV電壓，持續(xù)50 ms，然后去極化至-40 mV電壓，使鈉離子通道失活，于50 ms后去極化脈沖從-30 mV電壓躍升至+70 mV電壓，階躍為10 mV電壓，整個時程為250 ms。將不同鉗制電壓下的Ito強度繪成I-V曲線。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 15.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，所統(tǒng)計數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，5組間比較采用方差分析，顯著性水平以0.05和0.01為有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1Epi心肌梗死非梗死區(qū)細胞Ito電流密度的變化圖1為CON組、心肌梗死組和阿托伐他汀組、黃芪組、聯(lián)合組AMI-N的Epi細胞Ito細胞ItoI-V曲線，從圖1可見以上各組細胞電流曲線均呈電壓依賴的線性曲線，電流密度到+70 mV時達最大值，心肌梗死組AMI-N的Epi細胞的I-V曲線較CON組Epi細胞下降，黃芪組、阿托伐他汀和聯(lián)合組電流密度AMI-N的Epi細胞在+70 mV時較AMI組電流密度依次升高。CON組在+70 mV電流密度明顯大于AMI組AMI-N，差異有非常顯著性(P<0.01)。CON組、AMI組、阿托伐他汀組AMI-N的Epi細胞在+70 mV的Ito密度3組者之間差異有顯著性(P<0.05),黃芪組AMI-N的Epi細胞在+70 mV的Ito密度上升，與阿托伐他汀組之間差異無顯著性(P>0.05)。聯(lián)合組AMI-N的Epi細胞在+70 mV的Ito密度進一步上升與CON組、AMI組、阿托伐他汀組、黃芪組之間比較差異有顯著性(P<0.05)。具體數(shù)據(jù)詳見表1。

圖1　CON組、AMI組、阿托伐他汀組、黃芪組、聯(lián)合組的AMI-N的Epi細胞Ito I-V曲線

2.2心肌梗死梗死邊緣區(qū)CON組在+70 mV電流密度為明顯大于AMI組AMI-R的Epi細胞電流密度，差異有非常顯著性(P<0.01)；阿托伐他汀組AMI-R的Epi細胞在+70 mV的Ito密度上升，與CON組、AMI組3者之間差異有顯著性(P<0.05),黃芪組AMI-R的Epi細胞在+70 mV的Ito密度與阿托伐他汀組之間差異無顯著性(P>0.05)。聯(lián)合組AMI-R的Epi細胞在+70 mV的Ito密度進一步上升與CON組、AMI組、阿托伐他汀組、黃芪組之間比較差異有顯著性(P<0.05), 具體數(shù)據(jù)詳見表1。

表1CON組、AMI組、阿托伐他汀組、黃芪組、聯(lián)合組的AMI-N和AMI-R的Epi細胞Ito電流峰值

組別Ito電流峰值(pA/pF)AMI-RAMI-NAMI組52.75±9.94pA/pF﹟*(n=12cells)72.29±8.74pA/pF﹟*(n=15cells)阿托伐他汀組80.27±2.19pA/pF△*(n=13cells)86.15±2.64pA/pF△*(n=13cells)黃芪組74.81±11.21pA/pF△*(n=12cells)84.56±9.42pA/pF△*(n=13cells)聯(lián)合組91.50±5.12pA/pF(n=12cells)96.72±1.98pA/pF(n=12cells) CON組115.83±6.04*(n=15cells)

注：與聯(lián)合組比較，*P<0.05；與CON組比較，﹟P<0.01；與AMI組比較，△P<0.05

2.3心肌梗死梗死邊緣區(qū)與非梗死區(qū)阿托伐他汀組、黃芪組、聯(lián)合組的AMI-R和AMI-N的Epi細胞在+70 mV Ito電流密度之間差異無顯著性(P>0.05)。

3討論

心律失常的發(fā)生與心肌細胞膜多種離子通道電流的變化緊密相關(guān), 瞬間外向鉀電流作為心肌細胞復極化過程中起重要作用的電流成分之一，是構(gòu)成心肌細胞動作電位的1相切跡，并和鈣離子通道并影響動作電位平臺期的電位變化，從而影響復極過程中其他離子通道的活性， 本文中由于阻斷了鈣電流，故實際測定的Ito為Ito1,[2]Ito所介導的離子通道的2相折返機制是心肌缺血和再灌注惡性心律失常的發(fā)生機制之一。[4-5]文獻報道[2]兔左心室心外膜Ito電流密度最大，在一定病理情況下，部分心外膜細胞可能表現(xiàn)為全或無的復極模式，從而使心肌細胞動作電位的平臺期發(fā)生變化，相對正常組織的明顯平臺期會使細胞間的復極離散度增加，導致發(fā)生2相折返的機會增加。有研究證實急性心肌梗死后不同部位的心室心肌細胞發(fā)生不同的細胞電生理變化，伴隨心臟組織結(jié)構(gòu)的重構(gòu)，在心肌梗死后不同部位的的Ito電流密度變化均有變化。[6]本研究顯示兔急性心肌梗死后1周左室梗死邊緣區(qū)及非梗死區(qū)心外膜細胞Ito密度明顯下降，從而推測梗死邊緣區(qū)及非梗死區(qū)Epi心肌細胞的“峰和圓頂”消失，從而誘發(fā)心律失常的發(fā)生。

阿托伐他汀和黃芪分別能使急性心肌梗死梗死邊緣區(qū)及非梗死區(qū)細胞下降的Ito密度增加，且均使梗死邊緣區(qū)和非梗死區(qū)的電流密度無明顯差異，兩者聯(lián)用應用時可將本已下降的Ito電流密度進一步提高，從而在一定程度上減輕不同部位心室肌細胞Ito之間顯著的電壓梯度差異,緩解心肌梗死后不同部位心肌之間Ito的電生理差異，從而消除由于細胞間復極不一致性而產(chǎn)生的折返。

急性心肌梗死屬于中醫(yī)學“胸痹”和“真心痛”范疇，氣虛血瘀是胸痹心痛病的發(fā)病中的重要的病機之一，氣虛則無力推動血行，氣滯則血行不暢，形成血瘀，阻于經(jīng)脈，故發(fā)病為“胸痹”或“真心痛”。急性心肌梗死重要的病機之一為氣虛血瘀。黃芪，味甘微溫，走脾肺二經(jīng)，補氣升陽、托毒生肌，利尿消腫、脫毒生肌，還有益氣活血之功，其主要成分為黃酮、皂苷、生物堿、多糖及氨基酸等多種成分，故臨床用于急性心肌梗死急性期的治療。有研究報道黃芪能減低急性心肌缺血動物模型心律失常的發(fā)生率和持續(xù)時間,[7]考慮黃芪與影響蛋白激酶D表達從而改善心肌梗死后心室肌之間心肌纖維化形成并緩解心室重構(gòu)的作用有關(guān)及穩(wěn)定細胞膜、改善心肌細胞能量代謝及氧的代謝平衡相關(guān)。[8-9]推測阿托伐他汀影響急性心肌梗死后心室肌細胞的離子通道機制可能與他汀類藥物在通過改善血管內(nèi)皮細胞功能、穩(wěn)定血管斑塊[10]的機制相關(guān)。本研究通過心肌細胞離子通道機制方面推測黃芪在抗心律失常離子通道機制方面具有同阿托伐他汀類似的作用，對兩種藥物的聯(lián)合應用提供一定的理論參考，但其抗心律失常的具體機制有待于進一步深入探討。

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(2015-06-14收稿)

理論與臨床論著