MALDI-TOF MS在中段尿樣本細(xì)菌直接檢測中的應(yīng)用

王　琳，　李佳萍，　陳功祥，　張　嶸

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院檢驗科，浙江 杭州 310009)

MALDI-TOF MS在中段尿樣本細(xì)菌直接檢測中的應(yīng)用

王琳，李佳萍，陳功祥，張嶸

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院檢驗科，浙江 杭州 310009)

摘要：目的運用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)鑒定系統(tǒng)對中段尿樣本中的細(xì)菌進行直接快速檢測，以建立快速的細(xì)菌檢測方法便于臨床應(yīng)用。方法692例中段尿樣本接種于固體培養(yǎng)基上，利用MALDI-TOF MS和Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)(簡稱Vitek 2 Compact)對單個菌落進行鑒定；同時對尿液樣本進行前處理后直接進行質(zhì)譜分析。結(jié)果692例中段尿樣本中，98例單一菌感染且細(xì)菌數(shù)>104CFU/mL的樣本應(yīng)用MALDI-TOF MS直接檢測出74株菌，檢出率達75.5%，其中大腸埃希菌39株，檢出率達79.6%；糞腸球菌23株，檢出率為100.0%；摩根摩根菌5株，檢出率為100.0%。64例樣本為2種菌混合感染，采用MALDI-TOF MS直接檢測出44例樣本中的1種優(yōu)勢細(xì)菌。質(zhì)譜直接檢測尿液的鑒定結(jié)果與單菌落質(zhì)譜鑒定結(jié)果及Vitek 2 Compact鑒定結(jié)果完全一致，符合率為100.0%。 結(jié)論MALDI-TOF MS可用于直接檢測尿液樣本中的細(xì)菌，檢出率高，結(jié)果可靠；MALDI-TOF MS對混合菌感染的樣本有一定鑒定能力；該方法可比常規(guī)尿培養(yǎng)鑒定方法提早42 h報告鑒定結(jié)果，是對臨床尿液樣本細(xì)菌鑒定的一大革命性進步。

關(guān)鍵詞：基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜；中段尿；細(xì)菌直接檢測

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)02-0108-05R446.5

文獻標(biāo)志碼：碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.02.003

Abstract:ObjectiveTo construct rapid identification method for clinical laboratory with the use of matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) for the direct identification of bacteria in midstream urine samples. MethodsA total of 692 midstream urine samples were cultivated on agar，and were identified by MALDI-TOF MS and Vitek 2 Compact automated microbial amalyslis system (Vitek 2 Compact). Direct identification of midstream urine samples were also conducted by MALDI-TOF MS after preparation. ResultsOf the 692 midstream urine samples, 98 samples were positive for one kind of bacteria (>104CFU/mL). The overall detection rate of direct identification by MALDI-TOF MS was 75.5%，and 74 isolates were identified，among which 39 isolates were Escherichia coli with the detection rate of 79.6%，23 isolates were Enterococcus faecalis with the detection rate of 100.0%，and 5 isolates were Morganella morganii with the detection rate of 100.0%. Among the 64 midstream urine samples with multiple microorganisms，44 samples were detected with a dominant bacteria by direct identification. The consistency rate was 100.0% among the results by direct identification，the identification of colony by MALDI-TOF MS and Vitek 2 Compact. ConclusionsMALDI-TOF MS could be applied to identify directly bacteria in midstream urine samples with high detection rate and accuracy, and MALDI-TOF MS also shows certain performance in identifying samples containing multiple bacteria. The identification results could be 42 h earlier available than regular methods. It is a revolutionary improvement for the clinical identification of bacteria in urine samples.

作者簡介：王琳,男,1981年生,學(xué)士,主管技師,主要從事微生物檢驗工作。

通訊作者：陳功祥，聯(lián)系電話：0571-87783646。

收稿日期：(2014-10-28)

Application of MALDI-TOF MS for identifying bacteria directly in midstream urine samplesWANGLin,LIJiaping,CHENGongxiang,ZHANGRong.(DepartmentofLaboratoryMedicine,theSecondAffiliatedHospitalofZhejiangUniversitySchoolofMedicine,ZhejiangHangzhou310009)

Key words: Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry;Midstream urine;Bacterial direct identification

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)是近些年發(fā)展起來的一種新型的細(xì)菌鑒定技術(shù)。它主要根據(jù)不同細(xì)菌具有不同的蛋白質(zhì)指紋圖譜，通過Biotyper鑒定系統(tǒng)將獲得的蛋白質(zhì)指紋圖譜與數(shù)據(jù)庫中已知的各菌種的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進行比對，從而完成對各種微生物的鑒定。該方法無需進行常規(guī)的革蘭染色、氧化酶、觸酶、生化反應(yīng)，僅在幾分鐘之內(nèi)就可完成鑒定比對，操作簡便、快速、高通量、低耗材成本。目前MALDI-TOF MS主要應(yīng)用于對經(jīng)培養(yǎng)的單個菌落的鑒定，它能夠快速準(zhǔn)確地鑒定臨床常見細(xì)菌和真菌[1]，被認(rèn)為是最有效率的鑒定方法之一。

MALDI-TOF MS應(yīng)用于臨床樣本的直接檢測也越來越受到重視。國外已有商品化試劑盒Sepsityper配合MALDI-TOF MS直接用于檢測陽性血培養(yǎng)瓶中的細(xì)菌，無需18～24 h的轉(zhuǎn)種培養(yǎng)過程，顯著縮短細(xì)菌鑒定時間，對于臨床血流感染患者及早準(zhǔn)確用藥有著重要意義[2]。而MALDI-TOF MS在其它體液樣本(包括尿液)細(xì)菌鑒定中的應(yīng)用報道較少[3-4]，本研究旨在應(yīng)用MALDI-TOF MS快速直接檢測中段尿樣本中的細(xì)菌，以建立合適的方法便于臨床推廣應(yīng)用。

材料和方法

一、樣本來源

尿液樣本為2014年8至9月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院門診及住院患者無菌采集的中段尿樣本，共692例，患者男339例，女353例，年齡(42.0±1.3)歲。

二、試劑和儀器

Microflex LT MS儀購自德國布魯克-道爾頓公司；MALDI-TOF MS所用試劑包括三氟乙酸、α-氰-4-羥基本丙烯酸、色譜級乙腈、甲酸和無水乙醇均購自美國Sigma公司。Vitek 2 Compact全自動微生物分析儀(簡稱Vitek 2 Compact)及其配套的細(xì)菌鑒定卡購自法國生物梅里埃公司。哥倫比亞血平板、中國藍平板購自杭州威晟生物科技公司。MALDI-TOF MS校準(zhǔn)株為大腸埃希菌DH5α。Vitek 2 Compact質(zhì)控菌株為陰溝腸桿菌(ATCC 700323)和鉛黃腸球菌(ATCC 700327)。

三、方法

1. 尿液樣本的常規(guī)培養(yǎng)和鑒定用定量接種環(huán)將中段尿樣本接種于哥倫比亞血平板、中國藍平板，37 ℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng)18～24 h。待菌落形成后挑取單個菌落均勻涂布于MALDI-TOF MS專用不銹鋼基質(zhì)靶板上，進行MALDI-TOF MS快速鑒定。同時按照其操作指南挑取單個菌落制備一定濁度的菌懸液于Vitek 2 Compact上機鑒定。

2. 尿液樣本質(zhì)譜分析前處理吸取6 mL尿液樣本于無菌離心管中，2 000×g離心4 min去除蛋白。離心完畢后盡可能小心地取出離心管，將上清液轉(zhuǎn)移至另一無菌離心管中，在20 ℃下12 000×g離心5 min。棄上清，在沉淀中加入1 mL 0.45%無菌生理鹽水，充分震蕩混勻后12 000×g離心5 min。棄上清，用1 mL去離子水洗滌沉淀，同樣轉(zhuǎn)速和時間離心棄上清液。用加樣器吸取1 μL沉淀均勻涂布于96孔靶板上，自然干燥待用。

3．MALDI-TOF MS分析靶板上的每個已點樣的靶點覆蓋1 μL基質(zhì)液(50%乙腈+2.5%三氟乙酸配制的飽和α-氰基-4-羥基肉桂酸溶液)。大腸埃希菌DH5α的蛋白抽提液作為蛋白校準(zhǔn)品，測定時用于儀器的校準(zhǔn)和陽性對照。樣本干燥后將靶板放入MALDI-TOF MS儀檢測。儀器參數(shù)設(shè)置為正線性操作模式，MALDI-TOF MS收集的質(zhì)量范圍為2 000～20 000，加速電壓為20 kV，提取電壓為18.6 kV，聚焦電壓為6.5 kV，提取延遲時間為150 ns。每次實驗前都要在采集數(shù)據(jù)的質(zhì)量范圍內(nèi)(2 000～20 000)用校準(zhǔn)肽蛋白進行質(zhì)量校正，校正完畢后方可進行質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)的采集，圖譜采集使用Flex Control 3.0軟件，圖譜數(shù)據(jù)比對使用Bruker Biotyper 3.0軟件與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫進行比對，使用分值量化和判定結(jié)果，評分>2.0可鑒定到種的水平，評分<2.0而>1.7可鑒定到屬的水平，評分<1.7則表示無法給出可靠的鑒定結(jié)果。

結(jié)果

一、菌落MALDI-TOF MS鑒定與Vitek 2 Compact鑒定結(jié)果的比較

692例中段尿樣本中，98例只培養(yǎng)到1種細(xì)菌且細(xì)菌數(shù)量>104CFU/mL，菌落MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果與Vitek 2 Compact上機鑒定結(jié)果一致。

二、單一菌感染的中段尿樣本MALDI-TOF MS直接檢測與菌落MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果的比較

本研究中MALDI-TOF MS直接檢測尿液所得評分>1.7即認(rèn)為檢出，尿液直接MALDI-TOF MS分析得到74個陽性結(jié)果，總檢出率為75.5%，具體檢出情況見表1。尿培養(yǎng)結(jié)果表明，革蘭陰性菌為尿路感染主要致病菌，占76.5%，其中大腸埃希菌最為常見(占50.0%)，肺炎克雷伯菌次之(占15.3%)；革蘭陽性菌相對較為少見，僅見糞腸球菌(占23.5%)。與培養(yǎng)結(jié)果比較，MALDI-TOF MS對不同菌種的檢出情況有所差異，糞腸球菌、摩根摩根菌、弗勞地枸櫞酸桿菌和克氏枸櫞酸桿菌檢出率較高(100.0%)，肺炎克雷伯菌次之(86.7%)，繼而是大腸埃希菌(79.6%)、鮑曼不動桿菌(50.0%)和陰溝腸桿菌(50.0%)。

三、混合菌感染的中段尿樣本MALDI-TOF MS直接檢測與菌落MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果的比較

64例尿液樣本培養(yǎng)到2種細(xì)菌，而MALDI-TOF MS直接從44例尿液樣本中檢出優(yōu)勢生長菌(>104CFU/mL)，非優(yōu)勢菌主要為表皮葡萄球菌、科氏葡萄球菌、無乳鏈球菌、棒狀桿菌、惡臭假單胞菌等常見的污染菌，具體檢出情況見表2?；旌细腥緲颖局写竽c埃希菌最為常見，共檢出25株，占混合感染樣本中所有檢出菌株的56.8%。

表1　單一菌感染的中段尿樣本菌種檢出情況

注：*質(zhì)譜評分>1.7的菌株；#指質(zhì)譜儀上無峰圖顯示和評分<1.7的菌株

表2　混合菌感染的中段尿樣本的菌種檢出情況

注：*其它包括表皮葡萄球菌、科氏葡萄球菌、無乳鏈球菌、棒狀桿菌、惡臭假單胞菌

討論

臨床微生物實驗室中，MALDI-TOF MS在單菌落鑒定上的應(yīng)用因其獨特的優(yōu)勢——快速、準(zhǔn)確、操作簡便而迅速得到推廣。對于臨床常見菌，MALDI-TOF MS可將84.1%～93.6%的細(xì)菌準(zhǔn)確鑒定至菌種水平[1]。至于臨床難培養(yǎng)的細(xì)菌，MALDI-TOF MS更展現(xiàn)出常規(guī)生化反應(yīng)方法無法企及的優(yōu)勢。SCHMITT等[5]報道MALDI-TOF MS可將70.8%的厭氧菌準(zhǔn)確鑒定到種，91.7%準(zhǔn)確鑒定到屬。隨著數(shù)據(jù)庫的不斷擴充，MALDI-TOF MS對軍團菌[6]、分枝桿菌[7]等苛養(yǎng)菌和緩生菌的鑒定能力越來越強。近年來，MALDI-TOF MS開始被應(yīng)用于細(xì)菌耐藥性研究，主要用于檢測革蘭陰性桿菌中的β-內(nèi)酰胺酶尤其是碳青霉烯酶[8]。我們成功應(yīng)用MALDI-TOF MS檢測腸桿菌科細(xì)菌KPC-2型碳青霉烯酶[9]和克雷伯菌屬細(xì)菌中外膜蛋白OmpK36的缺失[10]。

MALDI-TOF MS對體液樣本細(xì)菌的直接檢測逐漸開始應(yīng)用，主要為血培養(yǎng)和尿液樣本。國外學(xué)者應(yīng)用MALDI-TOF MS直接檢測尿液細(xì)菌主要關(guān)注菌量>105CFU/mL的樣本，F(xiàn)ERREIRA等[3-4]報道MALDI-TOF MS直接檢測尿液樣本在菌種水平準(zhǔn)確率為91.8%，而菌屬水平準(zhǔn)確率為92.7%。本次研究應(yīng)用MALDI-TOF MS對菌量>104CFU/mL的尿液樣本進行檢測，總的檢出率為75.5%。世界衛(wèi)生組織推薦抗菌藥物使用比例不超過30%，而在中國50.3%的門診患者接受抗菌藥物治療?；颊咴谀蚺囵B(yǎng)之前接受經(jīng)驗性的抗菌藥物治療可顯著影響尿培養(yǎng)結(jié)果。不足量或不正確的抗菌治療可在一定程度抑制細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長，使得尿培養(yǎng)菌落計數(shù)偏少。此外，尿培養(yǎng)結(jié)果報告革蘭陰性菌菌量在104CFU/mL數(shù)量級，對臨床尿路感染的診斷有一定的意義。而MALDI-TOF MS對菌量<104CFU/mL的尿液樣本的檢測隨著菌量的減少峰圖信號愈差，檢測能力降低。因此，本次研究關(guān)注菌量>104CFU/mL的尿液樣本。MALDI-TOF MS直接檢測法與菌落MALDI-TOF MS鑒定存在差異，可能受以下2個因素影響：(1)MALDI-TOF MS直接檢測的尿液樣本經(jīng)離心處理，菌與蛋白混于沉淀中且分布不均，從而導(dǎo)致質(zhì)譜信號不好；(2)尿液未經(jīng)過培養(yǎng)增菌，菌量少，信號差，甚至有的樣本菌量低于檢出限而導(dǎo)致MALDI-TOF MS檢測不出，這可能是影響MALDI-TOF MS直接檢測尿液樣本細(xì)菌的主要因素。

在檢測單一菌種的樣本時，MALDI-TOF MS對同一菌種的不同樣本檢測結(jié)果各不相同。如49例大腸埃希菌陽性的尿樣本，26例直接檢測評分>2.0，而13例評分介于1.7～2.0之間，1例評分<1.7，剩余9例無圖譜。造成這一現(xiàn)象最主要的原因是菌量多少不一，菌量多的峰圖信號好，因而檢測結(jié)果可靠，分值高；而菌量少的峰圖信號不好，檢測結(jié)果不好，準(zhǔn)確性不高，至于未檢出的則可能是菌量過少，低于檢出限，且蛋白等雜質(zhì)干擾掩蓋檢測信號。因此，必須完善質(zhì)譜前處理流程，以盡量去除蛋白，富集細(xì)菌，提高檢出率。

WANG等[11]研究發(fā)現(xiàn)尿液樣本中2種菌以1∶1或1∶2混合時，MALDI-TOF MS直接檢測時能夠同時檢測到2種菌，而當(dāng)兩者以1∶9比例混合時，只有優(yōu)勢菌能夠被檢出。而在本研究中，MALDI-TOF MS檢測混合菌感染的尿液樣本時，同一樣本中的多種細(xì)菌計數(shù)在同一數(shù)量級時可互相干擾MALDI-TOF MS峰圖導(dǎo)致無法鑒定；當(dāng)非優(yōu)勢菌數(shù)量比優(yōu)勢菌低一個數(shù)量級，且非優(yōu)勢菌為表皮葡萄球菌、科氏葡萄球菌、無乳鏈球菌、棒狀桿菌、惡臭假單胞菌等可疑污染菌時，優(yōu)勢菌的MALDI-TOF MS峰圖受非優(yōu)勢菌的干擾較少，甚至幾乎不受干擾。

尿路感染是人類最常見的感染之一，據(jù)文獻報道門診患者中大于80%的尿路感染是由大腸埃希菌引起，而導(dǎo)管相關(guān)性尿路感染是最常見的醫(yī)院性感染，大多由大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌等所致[11]。社區(qū)獲得性尿路感染同樣以大腸埃希菌最為常見[12]，由于中段尿培養(yǎng)需要時間長、費用高，所以臨床治療尿路感染多以經(jīng)驗治療為主。臨床上尿液樣本中細(xì)菌的鑒定常規(guī)方法從培養(yǎng)到鑒定需要36～48 h，應(yīng)用MALDI-TOF MS儀只需簡單前處理可直接檢測，可在2 h內(nèi)完成菌種鑒定，比尿培養(yǎng)加MALDI-TOF MS菌落鑒定提前平均20 h，而比常規(guī)的尿培養(yǎng)加Vitek 2 Compact上機鑒定提前平均34～46 h。應(yīng)用這種快速方法，可省去耗時的培養(yǎng)過程，臨床醫(yī)生可以提前42 h結(jié)合患者癥狀對患者進行診斷并針對病原菌予以合適的抗菌治療，提高有效治愈率。MALDI-TOF MS直接檢測方法還可克服尿培養(yǎng)結(jié)果受前期經(jīng)驗性用藥影響的缺陷，幫助臨床醫(yī)生及時更改治療方案，減少經(jīng)驗性用藥，防止耐藥菌的產(chǎn)生。MALDI-TOF MS對于混合菌感染的中段尿樣本的檢測更是凸顯一定的優(yōu)勢，MALDI-TOF MS可報告優(yōu)勢菌，省去分離純培養(yǎng)的時間，相比常規(guī)方法可提早46～64 h。毋庸置疑，MALDI-TOF MS直接檢測尿液樣本中的細(xì)菌是對基于培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法的革命性創(chuàng)舉。雖然目前要獲得藥物敏感性試驗結(jié)果仍然需要對尿液樣本進行培養(yǎng)和常規(guī)的藥物敏感性試驗，但MALDI-TOF MS在檢測超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、碳青霉烯酶方面已有應(yīng)用[8]，假以時日，MALDI-TOF MS將細(xì)菌鑒定和藥物敏感性聯(lián)合直接檢測尿液樣本，將為尿培養(yǎng)細(xì)菌的鑒定和藥物敏感性提供更快捷、更準(zhǔn)確的途徑。

參考文獻

[1]BIZZINI A，GREUB G. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，a revolution in clinical microbial identification [J]. Clin Microbiol Infect，2010，16(11): 1614-1619.

[2]LAGACé-WIENS PR，ADAM HJ，KARLOWSKY JA，et al. Identification of blood culture isolates directly from positive blood cultures by use of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry and a commercial extraction system: analysis of performance，cost，and turnaround time [J]. J Clin Microbiol，2012，50(10): 3324-3328.

[5]SCHMITT BH，CUNNINGHAM SA，DAILEY AL，et al. Identification of anaerobic bacteria by Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry with on-plate formic acid preparation [J]. J Clin Microbiol，2013，51(3): 782-786.

[6]MOLINER C，GINEVRA C，JARRAUD S，et al. Rapid identification ofLegionellaspeciesby mass spectrometry [J]. J Med Microbiol，2010，59(Pt 3): 273-284.

[7]EL KHéCHINE A，COUDERC C，F(xiàn)LAUDROPS C，et al. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry identification ofmycobacteriain routine clinical practice [J]. PLoS One，2011，6(9): e24720.

[9]胡燕燕，孫謙，蔡加昌，等. 基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜儀檢測KPC型碳青霉烯酶的研究 [J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2012，32(6): 561-565.

[10]CAI JC，HU YY，ZHANG R，et al. Detection of OmpK36 porin loss inKlebsiellaspp. by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry [J]. J Clin Microbiol，2012，50(6): 2179-2182.

[11]WANG XH，ZHANG G，F(xiàn)AN YY，et al. Direct identification of bacteria causing urinary tract infections by combining matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry with UF-1000i urine flow cytometry [J]. J Microbiol Methods，2013，92(3): 231-235.

[12]徐志江，徐軍，張嶸，等. 社區(qū)獲得性尿路感染菌群分布及耐藥性分析 [J]. 檢驗醫(yī)學(xué)，2006，21(4): 402-404.

(本文編輯：姜敏)