p53突變型結直腸癌組織中miR-4484的表達變化及意義

王新，耿文文，畢冬松(沂南縣人民醫(yī)院，山東沂南7600;山東大學齊魯醫(yī)院青島院區(qū);山東大學齊魯醫(yī)院)

p53突變型結直腸癌組織中miR-4484的表達變化及意義

王新1，耿文文2，畢冬松3
(1沂南縣人民醫(yī)院，山東沂南276300;2山東大學齊魯醫(yī)院青島院區(qū);3山東大學齊魯醫(yī)院)

摘要:目的觀察p53野生型和p53突變型結直腸癌組織中微小RNA-4484(miR-4484)的表達及轉染抗miR-4484后癌細胞增殖的變化。方法采用實時定量PCR方法檢測p53野生型和突變型結直腸癌組織及癌旁組織中miR-4484的表達;將抗miR-4484和空載體分別轉入p53野生型結直腸癌細胞HCT116和p53突變型結直腸癌細胞HT29中，采用MTT法檢測細胞增殖情況。結果p53突變型、野生型結直腸癌組織中miR-4484高表達者分別占68.1%、14.4%，二者比較P＜0.05。轉染抗miR-4484后，HCT116細胞OD值無明顯變化(P＞0.05)，HT29細胞OD值顯著下降(P＜0.05)。結論p53突變型結直腸癌組織中miR-4484呈高表達，轉染抗miR-4484可抑制HT29細胞增殖，miR-4484可能成為p53突變型結直腸癌的治療靶點。

關鍵詞:腸腫瘤;結直腸癌;微小RNA-4484; p53突變;細胞增殖

結直腸癌是常見的胃腸道惡性腫瘤。p53是目前研究最廣泛的抑癌蛋白，已用于腫瘤常規(guī)病理檢查，p53突變提示患者預后較差。miRNA是生物體內的非編碼RNA分子，通過參與細胞增殖、分化以及凋亡等多項生命活動調控生物體的發(fā)育、衰老及腫瘤發(fā)生等一系列生理病理過程［1］。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關［2～5］。2014年6月～2015年2月，我們檢測了p53野生型與p53突變型結直腸癌組織中miR-4484的表達，觀察癌細胞轉染抗miR-4484后細胞增殖的變化，探討其臨床意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取191例結直腸癌患者，男117例、女74例，年齡40～60歲，TNM分期T1～T3期。均行手術切除，病理檢查確診。其中p53陰性(野生型)97例，p53陽性(突變型)94例。野生型中復發(fā)7例，遠處轉移38例;突變型中復發(fā)12例，遠處轉移49例。

1.2相關指標觀察

1.2.1miR-4484檢測采用實時定量PCR方法。取結直腸癌組織及癌旁組織各0.5 g，加入TRIzol提取miRNA，紫外分光光度計測其濃度。取2 μg模版RNA，逆轉錄成cDNA。以cDNA為模版進行PCR擴增。反應條件: 95℃3min預熱，95℃12 s、62℃40 s共40個循環(huán)。以U6作為內參，使用實時定量PCR儀進行擴增。應用2－ΔΔCt法計算表達量。以腫瘤組織相應的癌旁組織miRNA表達量作為標準，判定腫瘤組織中miRNA的表達水平高低。

1.2.2細胞增殖檢測將p53野生型結直腸癌細胞株HCT116及p53突變型結直腸癌細胞株HT29分別加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期HCT116和HT29，分別用DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基配制成濃度2×104/mL的細胞懸液，以100 μL/孔接種于96孔板，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h。按照Lipofectamine 2000說明書步驟將抗miR-4484和空載體分別轉入HCT116和HT29中，采用MTT法檢測細胞增殖情況，用酶標儀測定波長490 nm處的OD值，連續(xù)觀察5d。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，比較采用χ2檢驗;計數(shù)資料的比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1野生型與突變型結直腸癌組織中miR-4484表達比較97例p53野生型結直腸癌組織中，miR-4484高表達14例(14.4%)、低表達83例(85.6%); 94例p53突變型結直腸癌組織中，miR-4484高表達64例(68.1%)、低表達30例(31.9%)。p53野生型與突變型miR-4484高表達率比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2野生型與突變型結直腸癌細胞增殖情況比較見表1。

表1　HCT116和HT29細胞增殖的OD值比較()

表1　HCT116和HT29細胞增殖的OD值比較()

注:與轉染空載體比較，*P＜0.05。

細胞類型OD 值第2天　　第3天　　第4天　　第5天HCT116轉染空載體　0.033±0.003 0.058±0.007 0.096±0.002 0.209±0.008轉染抗miR-4484 0.033±0.002 0.068±0.003 0.119±0.003 0.244±0.007 HT29轉染空載體　0.045±0.002 0.078±0.009 0.159±0.008 0.321±0.011轉染抗miR-4484 0.027±0.002 0.045±0.004*0.078±0.009*0.151±0.007*

3　討論

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用［6］。miRNA能夠特異性識別靶基因的mRNA并與之結合，從而干擾mRNA的翻譯，促進mRNA降解［7］，具有與抑癌基因相似的作用，能夠調節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［8］;另一方面，miRNA也受到其他分子的精細調控，以發(fā)揮其正常生理功能［9］。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA相關基因可作為預測結直腸癌患者的治療反應及預后的標志［10～12］。p53是重要的抑癌基因，參與多種基因的轉錄調控［13］。p53突變是人類結直腸癌細胞常見的突變類型，p53突變往往提示結直腸癌惡性程度較高，預后較差［14］。本研究結果顯示，p53野生型結直腸癌組織中miR-4484高表達率顯著低于p53突變型。提示miR-4484表達與p53基因狀態(tài)有關，其表達可能受到p53的負向調節(jié)，miR-4484可能成為p53突變型結直腸癌的治療靶點。

為了進一步明確miR-4484對腫瘤增殖的影響，我們檢測了miR-4484水平下調時癌細胞的增殖情況。結果顯示，轉染抗miR-4484的HCT116細胞與轉染空載體的HCT116細胞相比，細胞增殖無明顯變化，表明miR-4484表達對p53野生型癌細胞的增殖率無明顯影響;而轉染抗miR-4484的HT29細胞與轉染空載體的HT29細胞相比增殖明顯下降，表明HT29細胞的增殖與miR-4484表達呈正相關，提示miR-4484可能對p53突變型結直腸癌細胞的增殖具有促進作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，p53能夠通過反饋機制對miRNA的表達水平及功能進行調節(jié)［15］，但p53對miR-4484的調節(jié)機制是否也依賴于反饋環(huán)的形成仍有待研究。p53作為核心抑癌分子，亦有可能通過對miR-4484下游分子通路的抑制發(fā)揮其抑癌功能。

綜上所述，miR-4484的表達水平及對直結腸癌細胞增殖的作用與p53狀態(tài)有關，p53可能通過反饋作用負向調控miR-4484的表達，亦可能通過對miR-4484下游通路的負向調控抑制miR-4484的功能，其確切機制有待進一步研究。

參考文獻:

［1］Goulart LF，Bettella F，Snderby IE，et al.MicroRNAs enrichment in GWAS of complex human phenotypes［J］.BMC Genomics，2015，16(1): 304.

［2］Chae YS，Kim JG，Lee SJ，et al.AmiR-146a polymorphism(rs2910164)predicts risk of and survival from colorectal cancer ［J］.Anticancer Res，2013，33(8): 3233-3239.

［3］Tokarz P，Blasiak J.The role ofmicroRNA inmetastatic colorectal cancer and its significance in cancer prognosis and treatment［J］.Acta Biochim Pol，2012，59(4): 467-474.

［4］Hansen TF，Christensen Rd，Andersen RF，et al.MicroRNA-126 and epidermal growth factor-likedomain 7-an angiogenic couple of importance inmetastatic colorectal cancer.Results from the Nordic ACT trial［J］.Br J Cancer，2013，109(5): 1243-1251.

［5］Pardini B，Rosa F，Barone E，et al.Variation within 3'-UTRs of base excision repair genes and response to therapy in colorectal cancer patients: A potentialmodulation ofmicroRNAs binding ［J］.Clin Cancer Res，2013，19(21): 6044-6056.

［6］Stahlhut C，Slack FJ.MicroRNAs and the cancer phenotype: profiling，signatures and clinical implications［J］.Genomemed，2013，5(12): 111.

［7］Krol J，Loedige I，F(xiàn)ilipowicz W.The widespread regulation ofmicroRNA biogenesis，function anddecay［J］.Nat Rev Genet，2010，11(9): 597-610.

［8］Tang J，Tao ZH，Wend，et al.MiR-612 suppresses the stemness of liver cancer via Wnt/β-catenin signaling［J］.Biochem Biophys Res Commun，2014，447(1): 210-215.

［9］Han Y，Liu Y，Zhang H，et al.Hsa-miR-125b suppresses bladder cancerdevelopment bydown-regulating oncogene SIRT7 and oncogenic long noncoding RNAmALAT1［J］.FEBS Lett，2013，587(23): 3875-3882.

［10］Ryan BM，McClary AC，Valeri N，et al.rs4919510 in hsa-mir-608 is associated with outcome but not risk of colorectal cancer ［J］.PLoS One，2012，7(5): 36306.

［11］Boni V，Zarate R，Villa JC，et al.Role of primarymiRNA polymorphic variants inmetastatic colon cancer patients treated with 5-fluorouracil and irinotecan［J］.Pharmacogenomics J，2011，11(6):429-436.

［12］Zhang W，Winder T，Ning Y，et al.A let-7microRNA-binding site polymorphism in 3'-untranslated region of KRAS gene predicts response in wild-type KRAS patients withmetastatic colorectal cancer treated with cetuximabmonotherapy［J］.Ann Oncol，2011，22(1): 104-109.

［13］Pflaum J，Schlosser S，Müllerm，et al.p53 Family and Cellular Stress Responses in Cancer［J］.Front Oncol，2014，21(4): 285.

［14］Suppiah A，Greenman J.Clinical utility of anti-p53 auto-antibody: systematic review and focus on colorectal cancer［J］.World J Gastroenterol，2013，19(29): 4651-4670.

［15］Hu Z，F(xiàn)an H，Lv G，et al.5-Aminolevulinic acid-mediated sonodynamic therapy induces anti-tumor effects inmalignantmelanoma via p53-miR-34a-Sirt1 axis［J］.Jdermatol Sci，2015，79(2): 155-162.

收稿日期:( 2015-04-01)

文章編號:1002-266X(2015)34-0070-02

文獻標志碼:B

中圖分類號:R735.3

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.34.031