雷帕霉素及環(huán)孢素對人類外周血CD4+CD2+5調節(jié)性T細胞體外增殖的影響

趙冰清，朱志軍，王永磊(天津市第二人民醫(yī)院，天津009;首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院;天津醫(yī)院)

雷帕霉素及環(huán)孢素對人類外周血CD4+CD2+5調節(jié)性T細胞體外增殖的影響

趙冰清1，朱志軍2，王永磊3
(1天津市第二人民醫(yī)院，天津300192;2首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院;3天津醫(yī)院)

摘要:目的觀察雷帕霉素與環(huán)孢素對人類外周血CD4+CD2+5調節(jié)性T細胞(Treg)體外增殖的影響。方法利用免疫磁珠法提取健康成人外周血CD4+CD2+5Treg，流式細胞儀檢測CD4+CD2+5Treg純度;將羧基熒光素乙酰乙酸進行標記的CD4+CD2+5Treg分為A、B、C組，分別加入100 nmol/L雷帕霉素、410 nmol/L環(huán)孢素及空白培養(yǎng)基;培養(yǎng)7d后上流式細胞儀，計算原代細胞所占比例。結果A組原代細胞所占比例為8.8%±3.2%，B組為48.9%± 7.0%，C組為33.2%±4.3%; A、B組分別與C組比較，P均＜0.05。結論雷帕霉素可促進CD4+CD2+5Treg的體外增殖，有利于移植后患者免疫耐受的形成;而環(huán)孢素則抑制CD4+CD2+5Treg的體外增殖，不利于免疫耐受的形成。

關鍵詞:調節(jié)性T細胞;雷帕霉素;環(huán)孢素;免疫耐受;細胞培養(yǎng)

Effect of rapamycin and ciclosporin on proliferation of human periheral blood CD4+CD2+5regulatory T cells

ZHAO Bing-qing1，ZHU Zhi-jun，WANG Yong-lei
(1 Tianjin Second People's Hospital，Tianjin 300192，China)

Abstract:Objective To observe the influence of rapamycin and ciclosporin on the proliferation of human periheral blood CD4+CD2+5regulatory T cells.Methods The CD4+CD2+5regulatory T cells(Treg cells)from human peripheral blood were isolated by immunomagnetic bead separation，the purity of CD4+CD2+5Treg wasmeasured by flow cytometry.Wedivided the CD4+CD2+5Treg into the groups A，B and C，which were added with 100 nmol/L rapamycin，410 nmol/L cyclosporine and the blank culturemedium.After 7days'culture，we calculated the percentage of primary Treg cells ofdifferent groups by flow cytometry.Results The percentage of primary Treg cells in the groups A，B and C were 8.8%±3.2%，48.9%±7.0% and 33.2%±4.3%，respectively.Significantdifference was found when we compared groups A and B with group C，respectively(all P＜0.05).ConclusionRapamycin can significantly promote the proliferation of CD4+CD2+5Treg in vitro，and it promotes the formation of immune tolerance in patients after transplantation; but cyclosporine inhibits the proliferation of CD4+CD2+5Treg and hampers the progression.

Key words:regulatory T cells; rapamycin; ciclosporin; immune tolerance;cell culture

雷帕霉素和環(huán)孢素是器官移植患者常用的免疫抑制類藥物，具有減少免疫細胞的增殖和活化、抑制移植排斥反應、延長移植物存活時間的作用。CD4+CD2+5調節(jié)性T細胞(Treg)可誘導患者免疫耐受形成，從而減少甚至避免免疫抑制劑的應用。2012 年3月～2013年1月，我們觀察了雷帕霉素和環(huán)孢素對CD4+CD2+5Treg體外活化增殖的影響?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1材料以天津市第一中心醫(yī)院移植外科工作人員9人作為志愿者，每人采集外周血50～100mL。人類CD4+CD2+5Treg分選試劑盒、磁式細胞分選器、LD分選柱、MS分選柱及CD4+CD2+5Treg增殖試劑盒購于德國美天旎生物技術有限公司; APCCD25抗體、FITC-CD4抗體及PE-Foxp3抗體購于美國eBioscience公司;雷帕霉素購于美國惠氏制藥公司;環(huán)孢素購于瑞士諾華制藥有限公司; FACSCalibur流式細胞儀購于美國BD公司。

1.2CD4+CD2+5Treg細胞的提取及功能驗證取外周血樣本，采用免疫磁珠法提取CD4+CD2+5Treg，按

試劑盒說明書操作。利用流式細胞儀檢測CD4+CD2+5Treg純度，純度均達到97.0%±0.8%，細胞內Foxp3表達率均達到99%以上。

1.3細胞增殖情況觀察將CD4+CD2+5Treg用羧基熒光素乙酰乙酸(CFSE)染色標記，然后平均分成A、B、C組進行培養(yǎng)，每組至少設3個復孔。培養(yǎng)過程中，在加入必需培養(yǎng)基(含抗CD3/CD28單抗所包被的磁珠及高濃度重組人IL-2的RPMI-1640完全培養(yǎng)基)的基礎上，A組添加雷帕霉素100 nmol/L，B組添加環(huán)孢素410 nmol/L，C組不添加任何其他試劑。各組細胞于相同環(huán)境下(37.5℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱)培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基并添加相應試劑;培養(yǎng)7d后上流式細胞儀檢測，計算原代細胞所占比例，根據(jù)原代細胞所占比例判斷CD4+CD2+5Treg增殖活性，原代細胞所占比例越少，說明CD4+CD2+5Treg增殖活性越高。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，結果以x珋±s表示，組間比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

培養(yǎng)7d后，流式細胞儀檢測各組細胞增殖情況見圖1。如圖所示，原代細胞CFSE熒光強度最高(A組中M2，B組中M2，C組中M3)，而傳代細胞熒光強度則呈對半遞減趨勢。經(jīng)統(tǒng)計，A組原代細胞所占比例為8.8%±3.2%，B組為48.9%±7.0%，C組為33.2%±4.3%; A、B組與C組比較，P均＜0.05。

圖1　各組CD圖4+CD圖2+圖5Treg細胞增殖情況

3　討論

研究表明，雷帕霉素在細胞內與FK506結合蛋白12(FKBP12)結合形成雷帕霉素-FK-BP12復合物，后者作用于哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，抑制mTOR信號通路的作用，從而阻斷IL-2受體或生長因子受體激活的下游通路，阻斷T淋巴細胞從G1期到S期的進程，使T淋巴細胞的活化停滯在G1期，進而抑制T細胞增殖發(fā)揮免疫抑制作用［1］。另外，雷帕霉素還能夠抑制在細胞周期中有關鍵作用的原癌基因Bcl-2的轉錄，減少Bcl-2的表達，促使活化的淋巴細胞凋亡。體外實驗證實，雷帕霉素能促進小鼠CD4+CD2+5Treg增殖［2～4］，增殖后產(chǎn)生的細胞同樣能夠抑制同源的效應性T淋巴細胞。Blaha等［5］研究表明，雷帕霉素并不阻礙移植耐受，而鈣調蛋白抑制劑卻阻礙移植耐受。

本研究顯示，雷帕霉素對體外培養(yǎng)的CD4+CD2+5Treg增殖有明顯促進作用。雷帕霉素與環(huán)孢素或他克莫司等聯(lián)合應用時均有良好的協(xié)同作用，考慮其可能是通過CD4+CD2+5Treg這一途徑間接增強免疫抑制效果。目前，有關雷帕霉素與CD4+CD2+5Treg之間相互影響的研究很多，但多集中在檢測用藥前后人體內CD4+CD2+5Treg比例的變化、相關細胞因子的變化等。相關實驗顯示，雷帕霉素促進CD4+CD2+5Treg增殖的效應與TGF-β和IL-10等細胞因子關系密切。TGF-β和IL-10是CD4+CD2+5Treg分泌的主要免疫抑制性因子［6］。大鼠應用雷帕霉素喂養(yǎng)后，外周血中TGF-β、IL-10、Foxp3mRNA含量明顯高于對照組，表明雷帕霉素可一定程度上誘導CD4+CD2+5Treg增殖，提示雷帕霉素實現(xiàn)免疫抑制作用可能與CD4+CD2+5Treg分泌的細胞因子有密切關系［7］。Bocian等［8］研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素組中外周血中TGF-β1含量明顯較環(huán)孢素組及空白對照組多。結合TGF-β1在CD4+CD2+5Treg增殖及功能維持方面的重要作用，推測雷帕霉素可能通過某種機制促進TGF-β1表達，進而有利于CD4+CD2+5Treg擴增。Yamazaki等［9］證實，雷帕霉素可誘導CD4+CD2+5T淋巴細胞轉化為CD4+CD2+5Treg進而發(fā)揮免疫抑制作用。

環(huán)孢素屬于鈣調磷酸酶抑制劑(CaN)，其與嗜環(huán)蛋白形成復合物，抑制鈣調磷酸酶的活化，阻礙活化T細胞核因子(NFAT)的去磷酸化與核轉位，從而阻斷IL-2轉錄和T細胞活化，發(fā)揮免疫抑制作用［10］，用于心、肝、腎、肺、胰腺、骨髓等器官的移植均獲得滿意效果。IL-2是T細胞增殖的主要生長因子，同時對CD4+CD2+5Treg的產(chǎn)生、功能維持等起重要作用。而雷帕霉素雖能抑制T細胞mTOR通路，但對IL-2未見影響。Kim等［11］提出，CaN及IL-2受體單克隆抗體減少腎移植患者外周血液中CD4+CD2+5Treg數(shù)量，且隨著FK506濃度增加，

CD4+CD2+5Treg數(shù)量逐漸減少。另有研究顯示，F(xiàn)oxp3能夠通過NFAT途徑來控制CD4+CD2+5Treg的增殖及免疫功能［12］，而CaN也可能參與為CD4+CD2+5Treg傳導TGF-β1這一生長所必需的信號。可見，作為CaN的環(huán)孢素必然會對CD4+CD2+5Treg的增殖及功能造成負面影響。此外，有學者發(fā)現(xiàn)，環(huán)孢素能夠促進CD4+CD2+5Treg的增殖分化。杜美蓉等［13］通過建立小鼠自然流產(chǎn)模型，研究其妊娠及母胎免疫耐受，發(fā)現(xiàn)孕鼠妊娠第4天經(jīng)腹腔注射環(huán)孢素可以顯著降低其外周免疫細胞對父系抗原的增殖能力與IL-2分泌，并促進脾臟CD4+CD2+5Foxp3+調節(jié)性T細胞亞群的擴增，使CD4+CD2+5Treg比例明顯高于自然流產(chǎn)組孕鼠，而與正常孕鼠無統(tǒng)計學差異。

綜上所述，雷帕霉素可促進CD4+CD2+5Treg的體外增殖，有利于移植后患者免疫耐受的形成;而環(huán)孢素則抑制CD4+CD2+5Treg的體外增殖，不利于免疫耐受的形成。

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·基礎研究·

收稿日期:( 2015-05-28)

作者簡介:第一趙冰清(1986-)，男，住院醫(yī)師。研究方向為門脈高壓的診治。E-mail: zhaobingqing1986@ hotmall.com

文章編號:1002-266X(2015)34-0019-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R318

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.34.007