基于變應原致敏組分T細胞表位的肽段免疫治療

姜楠楠，尹　佳

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應科，北京 100730)

變應原特異性免疫治療是唯一可以改變變態(tài)反應疾病進程的治療方法[1]，不僅用于吸入變應原引起的鼻炎和哮喘以及蜂毒所致的過敏性休克等疾病的治療[2]，還能阻止過敏性鼻炎發(fā)展為哮喘[3]。治療機制主要包括阻斷抗體(IgG4、IgA等)的產(chǎn)生，誘導外周T細胞耐受以及抑制效應細胞活化等[4]。傳統(tǒng)免疫治療應用的變應原提取液含有完整的變應原分子，這些分子的B細胞表位結合導致效應細胞(肥大細胞、嗜堿性粒細胞等)上變應原特異性IgE橋聯(lián)，導致不良反應的發(fā)生，有些不良反應甚至是致命的[1]，這使傳統(tǒng)變應原免疫治療的應用存在局限性。目前已發(fā)表了多種為降低免疫治療制劑變應原性，同時維持其免疫原性的方法，比如利用重組變應原或其組分，合成T細胞或B細胞表位肽段，變應原分子的物理修飾[與Toll樣受體(Toll-like rceptor,TLR)的配體偶聯(lián)，與含有CpG基序的DNA片段的偶聯(lián)等]以及佐劑(單磷酰脂質(zhì)A、氫氧化鋁、碳水化合物基等)的使用，DNA疫苗等[5- 6]。近年來已有多項研究評估基于變應原優(yōu)勢T細胞表位的合成肽段進行免疫治療的療效，包括動物實驗和臨床研究[7]。本篇文章將對近年來發(fā)表的基于T細胞表位的合成肽段進行免疫治療的文獻進行綜述。

T細胞表位肽段免疫治療的動物實驗及潛在的免疫學機制

早期的肽段免疫治療(peptide immunotherapy)研究主要關注自身免疫疾病(自身免疫性腦膜炎[8]、關節(jié)炎[9]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[10]等)，近年來在糖尿病[11]、惡性腫瘤[12]等領域也有研究。肽段免疫治療用于變態(tài)反應性疾病治療的研究相對發(fā)展較晚，近年多種氣傳變應原和食物變應原主要致敏組分的T細胞表位已被鑒定，為變應原特異性免疫治療奠定了基礎[13-14]。

同傳統(tǒng)特異性免疫治療機制相似，動物實驗中T細胞表位肽段免疫治療的主要機制包括誘導外周T細胞耐受以及抑制效應細胞活化等。Hoyne等[15]用屋塵螨主要致敏組分Der p1致敏的小鼠，予鼻內(nèi)吸入低劑量包含其優(yōu)勢T細胞表位的肽段Der p1(氨基酸111～139)治療，體外變應原刺激發(fā)現(xiàn)特異性T細胞增殖受到抑制，白細胞介素(Interleukin,IL)2和抗體產(chǎn)生量減少。Briner等[16]用來源貓毛主要致敏組分Fel d1的多肽(IPC-2)對Fel d1致敏的B6CBAF1小鼠進行皮下脫敏治療，結果亦顯示IL-2和特異性IgG產(chǎn)生減少。Astori等[17]在蜂毒過敏的CBA/J小鼠模型中，給予鼻內(nèi)吸入涵蓋有磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)全序列的三種長肽段混合物，可誘導小鼠對PLA2的特異性T細胞的免疫耐受，細胞免疫反應顯示由Th2型向Th1型偏倚，特異性IgE水平降低，King等[18]對BALB/c小鼠分別皮下注射包含蜂毒T細胞表位的肽段Api m4(氨基酸7～19)，Api m4致敏后，T細胞活化受到抑制，Api m4特異性IgE水平下降40%～65%，同樣品系的小鼠用胡蜂蜂毒的主要致敏原組分Dol m5(氨基酸41～60、141～160、176～195)三條肽段進行皮下注射，隨后用Dol m5致敏，Dol m5 sIgE水平在免疫反應的早期階段下降40%。而Campbell等[19]用Fel d1致敏小鼠轉(zhuǎn)基因表達人的HLA-DRB*0101分子后，以肽段 Fel d1(氨基酸29～45)治療，發(fā)現(xiàn)小劑量(1 μg)的肽段治療即可降低小鼠氣道高反應性，減少Th2型細胞因子及特異性IgE的產(chǎn)生，黏液分泌和氣道嗜酸粒細胞浸潤減少，該研究還發(fā)現(xiàn)免疫治療不僅可誘導T細胞對該肽段產(chǎn)生耐受，也同時誘導T細胞對該分子的其他肽段產(chǎn)生耐受，T細胞耐受依賴于IL-10。Bauer等[20]用Bet v1 T細胞表位肽段(氨基酸139～152)皮下注射治療Bet v1致敏的CBA/J小鼠，可下調(diào)T細胞誘導的免疫反應。Hiroi等[21]用表達柳杉主要致敏組分Cry j1和Cry j2優(yōu)勢T細胞表位的轉(zhuǎn)基因大米治療日本柳杉致敏的小鼠，可誘導小鼠對上述兩種致敏組分產(chǎn)生免疫耐受，在抗原激發(fā)后，小鼠鼻部癥狀減輕，外周血抗原特異性IgE水平降低，CD4+T細胞增殖受到抑制，Th2型的細胞因子(IL- 4、IL-5、IL-13)及組胺釋放減少。最近的一項研究顯示，Kawabe等[22]對柳杉致敏的小鼠進行口服表達Cry j1優(yōu)勢T細胞表位的轉(zhuǎn)基因雞蛋白的治療后，Cry j1特異性IgE和總IgE水平降低。

除了吸入性變應原的T細胞表位肽段免疫治療的研究，近年來，有研究開始關注食物變應原的T細胞免疫治療，主要是雞蛋、花生、蝦等致敏組分的肽段免疫治療研究。Rupa等[23]對雞蛋卵類黏蛋白(ovomucoid，OVM)致敏小鼠進行口服單個T細胞表位和多種T細胞表位免疫治療，結果顯示兩組小鼠免疫治療后臨床癥狀均得到改善，OVM血清特異性IgE降低而特異性IgA升高，Th2型的細胞因子IL- 4、IL-10濃度降低，單個T細胞表位治療組小鼠外周血CD4+Foxp3+T細胞和CD4+CD25+T細胞增多。Yang等[24]對雞蛋卵清蛋白(ovalbumin，OVA)致敏的小鼠用OVA的3個優(yōu)勢T細胞表位進行皮下免疫治療，OVA激發(fā)后，3種T細胞表位的肽段混合治療的小鼠，臨床癥狀積分顯著下降，同時血清中組胺和OVA特異性IgE的濃度降低，小鼠脾臟細胞和小腸上皮細胞Th1型的細胞因子[干擾素γ(interferon-γ](IFN-γ)分泌減少，而Th2型細胞因子(IL- 4)分泌增多，同時轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming grouth foutor-β,TGF-β)和Foxp3的mRNA表達增多，以上結果顯示黏膜局部的調(diào)節(jié)性T細胞在免疫耐受中起著重要作用。Su等[25]對OVA致敏的小鼠用OVA單個優(yōu)勢T細胞表位(氨基酸323～339)八聚體進行皮下免疫治療后，小鼠外周血、縱隔淋巴結以及脾臟中CD4+CD25+Foxp3+的調(diào)節(jié)性T細胞增多，肺泡灌洗液中IL-10水平增高，肺組織中IL-10、TGF-β以及Foxp3的表達上調(diào)，同時肺泡灌洗液中OVA特異性IgE水平降低，嗜酸性粒細胞和淋巴細胞浸潤減少，而在同樣的動物模型中用單一包含有T細胞表位OVA肽段進行免疫治療則沒有上述改變，顯示肽段的多聚體比單一肽段在免疫調(diào)節(jié)方面可能更有優(yōu)勢。Wai等[26]鑒定了蝦的主要致敏組分Met e1 T細胞表位，并用T細胞表位肽段口服治療蝦過敏的模型小鼠，臨床癥狀明顯改善，Th2免疫反應受抑制，特異性IgE水平下降，同時IgG2a水平升高，Th2型細胞因子(IL- 4、IL-5、IL-13)水平下降。

T細胞表位肽段免疫治療的臨床研究

肽段免疫治療在臨床的研究進展相對較慢，目前已開展在多發(fā)性硬化病、1型糖尿病[27]、類風濕性關節(jié)炎[28-29]等領域的臨床研究。在變態(tài)反應性疾病領域內(nèi)肽段免疫治療還僅局限于貓毛過敏和蜂毒過敏，其他變應原的肽段免疫治療的臨床試驗正在進行中(http：//www.circassia.co.uk)。

Fel d1 T細胞表位肽段治療貓毛過敏患者安全性和有效性評價

1993年，Briner等[16]鑒定出貓毛的致敏組分Fel d1的T細胞表位，隨后研制出第一個應用于臨床的肽段疫苗(Allervax Cat)，Allervax Cat由兩條包含有Fel d1 T細胞表位的27個氨基酸的肽段組成(IPC-1和IPC-2)，多項研究對其治療的有效性和安全性進行了評價。1996年，Norman等[30]發(fā)表了第一個隨機對照研究，將95例貓毛過敏的患者按劑量不同隨機分為4組(安慰劑組、7.5 μg、75 μg、750 μg)，患者共注射4次，每周1次，治療結束6周后，75 μg和750 μg治療組肺和鼻部癥狀積分均有降低。Pene等[31]的研究中，25例貓毛過敏的患者接受6周(每周1次)Allervax Cat(7.5、75、750 μg)的皮下注射，治療結束6周后用Fel d1進行支氣管激發(fā)試驗，75 μg和750 μg組PD20 FEV1與基線相比有顯著差異，750 μg組血清IL- 4的水平下降。Marcotte等[32]對8例75 μg和7例750 μg治療患者的T細胞進行體外刺激，發(fā)現(xiàn)治療后肽段特異性T細胞系產(chǎn)生IL- 4量減少，并呈現(xiàn)劑量效應關系。Maguire等[33]通過多中心隨機雙盲安慰劑對照的研究評價Allervax Cat的有效性，治療組(75、750 μg)對貓毛耐受明顯增強，接受高劑量(750 μg/次)皮下注射的個體在治療3周后肺功能得到顯著改善。但Simons等[34]研究顯示，治療組接受4次250 μg Allervax Cat治療后，貓毛誘發(fā)的皮膚速發(fā)和遲發(fā)反應并未減輕，且治療后外周血單個核細胞分泌IL- 4、IL-10、IFN-γ水平未發(fā)生改變，提示肽段免疫治療并未減輕貓毛誘導的速發(fā)和遲發(fā)的皮膚反應，且不能誘導貓毛特異性Th1型細胞因子的產(chǎn)生。

盡管在上述研究顯示Allervax Cat治療有效，但治療相關不良反應發(fā)生率較高。Norman等[30]的研究發(fā)現(xiàn)，750 μg治療組的患者中，16例(67%)在第一次注射后出現(xiàn)了遲發(fā)型哮喘樣反應(late-asthmatic reactions，LAR)。同樣，Maguire等[33]的研究發(fā)現(xiàn)，750 μg治療組患者，44例(83%)出現(xiàn)了不同程度的不良反應，其中30例(56%)表現(xiàn)為LAR，9例(17%)出現(xiàn)了全身嚴重不良反應，不良反應的發(fā)生率隨著注射次數(shù)的增多而降低。Simons等[34]等研究顯示，250 μg治療組中有16例(76%)出現(xiàn)了鼻炎、哮喘和皮膚瘙癢等不良反應。

第二種貓毛肽段免疫治療的疫苗是包含F(xiàn)el d1 T細胞表位的11～12個重疊肽段的混合物[35- 41]。Oldfield等[35]對24例貓毛過敏的哮喘患者皮內(nèi)注射不同劑量(1、2.5、5 μg)的疫苗，8例患者接受單次5 μg治療2周后，皮下注射貓毛全變應原提取液，皮膚遲發(fā)反應明顯減輕，而速發(fā)反應無明顯改善，皮膚反應的改善與特異性T細胞增殖的減少和Th1、Th2型細胞因子釋放減少相關。該課題組隨后對這24例患者進行了一項雙盲安慰劑對照的臨床研究[36]，其中治療組16例，對照組8例，治療組每3～4 d接受1次遞增劑量的肽段治療，共4次(5、10、15、20 μg)，治療結束后4～8周和3～9個月分別進行隨訪。在兩個隨訪階段，治療組對貓毛和Fel d1 的皮膚遲發(fā)反應均明顯減輕，在第二個隨訪階段，治療組皮膚對Fel d1速發(fā)反應明顯減輕，但對貓毛的速發(fā)反應沒有明顯改善。體外試驗顯示，治療組3～9個月后外周特異性外周血單個核細胞增殖與基線組相比明顯減弱，IL- 4、IL-13、IFN-γ水平降低，同時調(diào)節(jié)性細胞因子IL-10分泌增多。治療過程中未發(fā)生急性的治療相關不良事件，4例患者在第一次注射后出現(xiàn)了LAR，再次注射后該不良反應消失。Alexander等[38]的研究中，患者每兩周接受一次遞增劑量的皮下注射(0.1、1、5、10、25 μg)，治療結束后氣道反應性降低，皮膚遲發(fā)型反應受到抑制，這可能與皮膚中的CD4+IFN-γ+T細胞與CD4+CD25+T細胞增多相關。

與Allervax Cat相比，第二種疫苗治療過程中不良反應發(fā)生率降低，LAR最為常見，未發(fā)生急性的治療相關不良事件。Oldfield等[35]研究中，4例(25%)在第一次注射后出現(xiàn)了LAR，再次注射后未發(fā)生LAR。Alexander等[38]研究中患者并未出現(xiàn)LAR，可能是與該研究免疫治療的起始治療劑量較低有關。

第三種貓毛肽段免疫治療疫苗為包含有Fel d1 7個 T細胞表位的肽段疫苗(Toleranceomune Cat?)。Patel等[42]評價了該疫苗的治療有效性，研究顯示接受4次6 nmol該疫苗治療后的效果優(yōu)于接受8次3 nmol治療。Haselden等[41]通過36例貓毛過敏的個體通過皮內(nèi)注射或者皮下注射不同劑量(0.3～20 nmol)的肽段疫苗來評價其安全性。結果顯示患者對該疫苗耐受良好，無嚴重過敏反應發(fā)生。皮內(nèi)注射3 nmol的疫苗能最大程度抑制皮膚遲發(fā)反應。

Api m1 T細胞表位治療蜂毒過敏的安全性與有效性評價

目前僅有3項研究關注蜂毒過敏的個體肽段免疫治療。3項研究均為小樣本，且不是雙盲安慰劑對照研究，但目前的數(shù)據(jù)支持Api m1 T細胞表位治療蜂毒過敏患者的有效性。1993年，Carballido等[43]鑒定出了蜂毒過敏的主要致敏蛋白Api m1優(yōu)勢T細胞表位。Müller等[44]用PLA2 3個T細胞表位的混合物(氨基酸45～62、82～92、113～124)皮下注射治療5例蜂毒過敏的患者，患者每周接受1次遞增劑量的皮下注射，初始劑量為0.1 μg，維持劑量為100 μg，總劑量為397.1 μg，治療結束1周后5例患者對皮下注射10 μg磷脂酶A能耐受，2周后有3例能耐受，其他2例發(fā)生了輕度的局部不良反應。體外試驗顯示，3例治療成功患者的外周血單個核細胞的磷脂酶A和肽段增殖反應均受到抑制，Th2型(IL- 4、IL-5、IL-13)和Th1型(INF-γ、IL-2)的細胞因子水平均下降，肽段治療60 d后特異性IgE和IgG4的水平均有不同程度的下降。

Texier等[45]研究發(fā)現(xiàn)Api m1(氨基酸81～97)含有多個HLA分子結合的活性區(qū)域，能與不同的HLA-DR分子結合，可以作為免疫治療的候選肽段，它也是Müller等[44]用于治療的三條肽段之一。Tarzi等[46]用此肽段治療重度蜂毒過敏的患者，12例蜜蜂蜂毒過敏的患者接受9次皮下免疫治療，治療組蜂毒和PLA2激發(fā)后皮膚遲發(fā)型反應明顯減弱，PLA2刺激后外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)增殖減弱，IL-13、IFN-γ分泌減少，產(chǎn)生IL-10的水平增加。

Fellrath等[47]對蜂毒過敏的患者采用快速脫敏治療的方式，治療應用3段長的合成肽段覆蓋了Api m1的全序列。初始劑量為0.1 μg，受試者每30 min接受增量為250 μg的治療。在免疫治療的第4、7、14、42和70天接受維持劑量為100 μg或300 μg的治療，抗原特異性T細胞的增殖增多，同時還有IFN-γ和IL-10水平增多，但是Th2細胞因子未發(fā)現(xiàn)。

小　　結

包含變應原致敏組分的T細胞表位短合成肽段能夠降低抗原特異性IgE橋聯(lián)，因此基于T細胞表位的肽段免疫治療是一種可降低變應原抗原性的治療手段，這種低變應原性使免疫治療安全性增加。肽段特異性免疫治療誘導產(chǎn)生了一群調(diào)節(jié)性T細胞或抑制性T細胞，從而調(diào)節(jié)了很多抗原暴露的癥狀，如：變應原激發(fā)后皮膚反應，非特異性氣道高反應性，癥狀積分，生活質(zhì)量和對自然變應原暴露的耐受。

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