微量熱法研究殼聚糖銅對(duì)核桃內(nèi)生菌生長(zhǎng)代謝的影響

胡　帆,羅曉潔,劉玉青,盧　垚,夏彩芬

(湖北工程學(xué)院 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,湖北 孝感 432000)

微量熱法研究殼聚糖銅對(duì)核桃內(nèi)生菌生長(zhǎng)代謝的影響

胡帆,羅曉潔,劉玉青,盧垚,夏彩芬*

(湖北工程學(xué)院 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,湖北 孝感 432000)

摘要：使用加熱回流方式制備了配合物殼聚糖銅(CTS-Cu)，采用紅外光譜法和原子吸收光譜法對(duì)配合物進(jìn)行了表征，結(jié)果表明CTS中的-OH與-NH2可能參與了配位。采用原子吸收光譜法測(cè)定CTS-Cu溶液中Cu2+的含量，同時(shí)利用等溫微量熱方法研究了CTS-Cu、Cu2+和CTS分別對(duì)核桃內(nèi)生菌(XRS107)生長(zhǎng)代謝的影響，測(cè)定結(jié)果表明CTS-Cu參與了對(duì)XRS107的生長(zhǎng)代謝過(guò)程，并對(duì)XRS107的生長(zhǎng)代謝過(guò)程的影響表現(xiàn)出“低濃度刺激，高濃度抑制”的特征，而Cu2+和CTS對(duì)XRS107的生長(zhǎng)代謝過(guò)程無(wú)明顯影響。光密度法研究結(jié)果表明，經(jīng)不同濃度CTS-Cu作用后，XRS107的光密度值(OD)表現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞：殼聚糖銅(CTS-Cu)；核桃內(nèi)生菌(XRS107)；紅外光譜法；微量熱法

中圖分類(lèi)號(hào)：TS255.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：碼：A

文章編號(hào)：號(hào)：2095-4824(2015)06-0011-05

收稿日期：2015-09-13

作者簡(jiǎn)介：胡帆(1995- )，男，湖北漢川人，湖北工程學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院學(xué)生。

通信作者夏彩芬(1979- )，女，湖北武漢人，湖北工程學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院講師，博士，本文。

Abstract：In this paper, CTS-Cu was prepared by heating reflux, and the complex was analyzed by FTIR and AAS. The results showed -OH and -NH2could be involved in the coordination. The content of Cu2+in complex was calculated by AAS. Furthermore, the metabolism of walnut endophytes (XRS107) with CTS-Cu, Cu2+and CTS were detected by isothermal microcalorimetric method respectively. The results showed that the complex CTS-Cu was involved in the metabolic process of XRS107. In the CTS-Cu concentration range, the effect on the growth of XRS107 showed the characteristics of Hormesisi effect, while Cu2+and CTS had no obvious influence on XRS107 growth metabolism. In addition, the values of optical density(OD) of XRS107 was evaluated with low concentrations of CTS-Cu, and was dropped with high concentrations of CTS-Cu.

殼聚糖(Chitosan, CTS)是甲殼素脫乙?；蟮漠a(chǎn)物，主要存在于蝦、蟹、昆蟲(chóng)等動(dòng)物外殼及藻類(lèi)植物、菌類(lèi)的細(xì)胞壁中，為天然多糖中唯一的堿性多糖[1]。從分子結(jié)構(gòu)上看，殼聚糖分子內(nèi)含有大量的-NH2、-OH等典型的Lewis堿性配位基團(tuán)，從構(gòu)象上看都是平伏鍵，這種特殊的結(jié)構(gòu)使它們對(duì)具有一定離子半徑的某些金屬離子具有很強(qiáng)的螯合作用[2-5]。

微量熱法運(yùn)用于抗菌藥物的研究不但具有高靈敏度、高準(zhǔn)確度、重復(fù)性好、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，而且能夠?qū)崿F(xiàn)連續(xù)、實(shí)時(shí)、原位、定量的測(cè)量與分析，從而獲取豐富的熱力學(xué)與熱動(dòng)力學(xué)信息、定量構(gòu)效關(guān)系、甚至抗菌藥物的作用機(jī)制等信息。而且該方法對(duì)水溶性不好的樣品同樣適用，這有利于將抗菌藥物的篩選范圍擴(kuò)大，大大提高了先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的機(jī)會(huì)[6-8]。大量的研究結(jié)果證實(shí)：殼聚糖及其衍生物具有廣譜的抗菌性能，可抑制多種細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)，殼聚糖金屬配合物就是這樣一種具有特殊抑菌性的殼聚糖基衍生物[9-12]。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)中擬制備殼聚糖銅(CTS-Cu)配合物，并采用美國(guó)TA公司的八通道微量熱儀研究其對(duì)核桃內(nèi)生菌的作用效果，旨在為明確殼聚糖金屬配合物的抑菌機(jī)理提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

表1是實(shí)驗(yàn)所用的主要試劑。

表1　實(shí)驗(yàn)試劑

表2是實(shí)驗(yàn)所用的主要儀器。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1CTS-Cu的制備

將CTS和CuCl2·5H2O溶于50 mL的無(wú)水乙醇中，加入瓷子，加熱回流24 h，冷卻至室溫后，用無(wú)水乙醇洗滌，減壓抽濾，待濾液中無(wú)銅離子后，真空干燥成淡綠色晶體即可。

表2　實(shí)驗(yàn)儀器

1.2.2紅外光譜法

利用傅里葉紅外光譜儀分別測(cè)試CTS和CTS-Cu，并對(duì)二者圖譜進(jìn)行分析。

1.2.3原子吸收法

配制CTS-Cu溶液，利用原子分光光度計(jì)測(cè)試溶液中Cu2+的含量。

1.2.4微量熱實(shí)驗(yàn)

XRS107的代謝產(chǎn)熱過(guò)程由TAM air八通道恒溫微量熱儀系統(tǒng)監(jiān)測(cè)，該系統(tǒng)采用安瓿法進(jìn)行測(cè)定，儀器靈敏度為±200 nW。實(shí)驗(yàn)中，取TAM air 檢測(cè)系統(tǒng)配套的安瓿瓶8個(gè)，分別加入等量的XRS107及一定濃度梯度的CTS-Cu溶液，并以空白LB培養(yǎng)基補(bǔ)充至5 mL，嚴(yán)密封蓋后吊入量熱通道，將量熱系統(tǒng)溫度控制為28 ℃，等系統(tǒng)穩(wěn)定后,實(shí)時(shí)記錄不同濃度的CTS-Cu作用下XRS107代謝產(chǎn)熱數(shù)據(jù)。所有量熱實(shí)驗(yàn)中的XRS107均為低溫冰箱內(nèi)保存約10 h后才進(jìn)行使用。

1.2.5光密度法

配制不同CTS-Cu濃度作用下的XRS107菌懸液，采用紫外光譜儀，測(cè)定每個(gè)樣的OD600值(光密度值)。

2分析與討論

2.1配合物的表征

圖1是CTS(A)和CTS-Cu(B)的紅外光譜圖。由圖1知，曲線(xiàn)A與B十分相似，但是曲線(xiàn)A在3 423.4 cm-1處由-OH與-NH2的締合伸縮振動(dòng)吸收峰，在曲線(xiàn)B中移至3 438.9 cm-1處。同時(shí)，曲線(xiàn)A在1 654.6 cm-1處酰胺鍵中的C=O吸收峰，在曲線(xiàn)B移至1 633.7 cm-1處，表明CTS中的-OH與-NH2可能參與了配位。

圖1　CTS(A)和CTS-Cu(B)的紅外光譜圖

圖2是Cu2+原子吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，由圖2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可知，實(shí)驗(yàn)測(cè)出CTS-Cu中的Cu2+的含量為14.1%。由此可以得出1.5 g/L CTS-Cu中的Cu2+的含量為0.211 5 g/L。

圖2　Cu2+原子吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2微量熱法測(cè)定CTS-Cu對(duì)XRS107生長(zhǎng)代謝的影響

2.2.1 XRS107在CTS-Cu作用下的產(chǎn)熱曲線(xiàn)

在正常生理?xiàng)l件下，XRS107利用營(yíng)養(yǎng)底物，通過(guò)基質(zhì)中的LB培養(yǎng)基進(jìn)行有氧呼吸作用，轉(zhuǎn)化為ATP供細(xì)胞正常新陳代謝。本實(shí)驗(yàn)中選用XRS107作為實(shí)驗(yàn)生物材料，經(jīng)梯度離心提純后分析不同濃度CTS-Cu作用下XRS107的體外代謝產(chǎn)熱情況，結(jié)果如圖3所示。

恒溫條件下，使用XRS107和LB培養(yǎng)基時(shí)(即為對(duì)照組)，XRS107存在明顯的產(chǎn)熱效應(yīng)，說(shuō)明XRS107仍可進(jìn)行一些生物氧化反應(yīng)，借助營(yíng)養(yǎng)底物維持XRS107基本物質(zhì)代謝。由圖3(a)可知，在只有底物存在情況下XRS107產(chǎn)熱曲線(xiàn)可分為四個(gè)階段，即活性停滯期、恢復(fù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。從圖3(b)可見(jiàn)，由于CTS-Cu的存在，使XRS107能量釋放一開(kāi)始停滯，在熱譜圖上表現(xiàn)為一段很平的線(xiàn)段，然后恢復(fù)生長(zhǎng)，出現(xiàn)一段快速上升的曲線(xiàn)，且呈現(xiàn)出對(duì)數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)。緊接著進(jìn)入能量釋放的穩(wěn)定期，最后由于營(yíng)養(yǎng)物和安瓿瓶中氧氣逐漸耗盡，其能量釋放進(jìn)入衰竭期，圖譜上產(chǎn)熱曲線(xiàn)表現(xiàn)為逐漸下降趨勢(shì)。

(a)XRS107

(b)CTS-Cu和XRS107

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)，低濃度的CTS-Cu可以刺激XRS107代謝過(guò)程，最大產(chǎn)熱功率隨著濃度的增加而升高，高濃度的CTS-Cu則表現(xiàn)出明顯的抑制效應(yīng)，最大產(chǎn)熱功率隨著濃度的進(jìn)一步增加而減小，甚至使得XRS107本身受損，在外加營(yíng)養(yǎng)底物的情況下，仍然無(wú)法進(jìn)行代謝。

2.2.2速率常數(shù)和最大產(chǎn)熱功率

為定量地闡明濃度對(duì)XRS107代謝產(chǎn)熱過(guò)程的影響，可以借助熱動(dòng)力學(xué)方法進(jìn)行分析比較[13-14]。由圖4可知，在活性恢復(fù)期，XRS107代謝產(chǎn)熱曲線(xiàn)符合指數(shù)變化規(guī)律，即其代謝產(chǎn)熱的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)遵循指數(shù)變化規(guī)律。P0和Pt分別為t=0和t時(shí)刻的熱功率，則活性恢復(fù)期XRS107代謝熱動(dòng)力學(xué)方程為：

Pt=P0expkt或lnPt=lnP0+ kt

(1)

在活性恢復(fù)期，不同濃度CTS-Cu作用下XRS107代謝過(guò)程中的活性恢復(fù)期呈指數(shù)衰減模式。因此，根據(jù)上述方程，對(duì)活性恢復(fù)期的產(chǎn)熱功率取自然對(duì)數(shù)，并與相應(yīng)的時(shí)間作圖，根據(jù)圖3中的XRS107熱效應(yīng)曲線(xiàn)圖和圖4中得到的XRS107代謝k-c曲線(xiàn)，發(fā)現(xiàn)低濃度CTS-Cu對(duì)XRS107的代謝產(chǎn)熱作用在活性恢復(fù)期具有促進(jìn)作用。為進(jìn)一步確證上述結(jié)果，在0 ～ 1.05 g/L CTS-Cu作用下，對(duì)活性恢復(fù)期速率常數(shù)k與對(duì)應(yīng)的CTS-Cu濃度作圖，發(fā)現(xiàn)當(dāng)XRS107中加入的CTS-Cu的濃度從0增至0.30 g/L時(shí)，活性恢復(fù)期速率常數(shù)也逐漸增加，當(dāng)CTS-Cu濃度為0.30 g/L時(shí)，增至最大值作為0.014 min-1，也就是說(shuō)，低濃度(0～0.30 g/L)CTS-Cu明顯刺激了XRS107代謝產(chǎn)熱過(guò)程，隨著CTS-Cu的濃度進(jìn)一步增大，k則表現(xiàn)出減小趨勢(shì)，即高濃度(0.60～1.05 g/L)的CTS-Cu顯著抑制了XRS的代謝過(guò)程。

圖4　XRS107在CTS-Cu作用下k-c曲線(xiàn)

圖5　XRS107在CTS-Cu的作用下Q-c關(guān)系圖

不同濃度CTS-Cu對(duì)XRS107代謝過(guò)程總產(chǎn)熱量Q的影響如圖5所示。與CTS-Cu對(duì)最大產(chǎn)熱功率Pm的影響不同的是，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍含量?jī)?nèi)，CTS-Cu的加入對(duì)總產(chǎn)熱量沒(méi)有明顯影響。與對(duì)照組總產(chǎn)熱量相比，盡管不同含量CTS-Cu的加入會(huì)使得XRS107代謝總熱略有變化，但其數(shù)值基本不變，表明CTS-Cu雖然參與了XRS107代謝過(guò)程，但由于每個(gè)XRS107代謝系統(tǒng)中含有相同量的XRS107、營(yíng)養(yǎng)底物和空氣，因而總產(chǎn)熱量差別不大。

2.3光密度法(OD)

圖6　XRS-107在CTS-Cu作用下的OD600柱形圖

由圖6結(jié)果可以推測(cè),經(jīng)不同濃度CTS-Cu溫育10 h后，隨著CTS-Cu濃度升高，XRS107的光密度值(OD)表現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)。

2.4微量熱法測(cè)定CTS和Cu2+對(duì)XRS107生長(zhǎng)代謝的影響

2.4.1產(chǎn)熱曲線(xiàn)

檢測(cè)以L(fǎng)B培養(yǎng)基作為代謝底物的XRS107在不同濃度CTS和Cu2+作用下的體外代謝產(chǎn)熱情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。

圖7　XRS107在CTS作用下生長(zhǎng)代謝產(chǎn)熱曲線(xiàn)

可以看出，不同濃度的CTS對(duì)XRS107的生長(zhǎng)代謝沒(méi)有明顯的影響(同樣Cu2+對(duì)XRS107的代謝產(chǎn)熱曲線(xiàn)也沒(méi)有明顯影響，圖中未給出)。

2.4.2熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表3是不同濃度CTS對(duì)XRS107代謝過(guò)程代謝中速率常數(shù)k、最大產(chǎn)熱功率Pm和總產(chǎn)熱量Q的對(duì)比結(jié)果。可以看出，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，CTS的加入對(duì)代謝常數(shù)、最大產(chǎn)熱功率和總產(chǎn)熱量沒(méi)有明顯影響。與對(duì)照組總產(chǎn)熱量相比，盡管濃度為0 ～0.090 2 g/L的CTS的加入會(huì)使得XRS107代謝數(shù)據(jù)略有變化，但其數(shù)值變化不明顯，表明CTS雖然參與了XRS107代謝過(guò)程，但其影響基本可以忽略不計(jì)。

表3　XRS107在不同濃度CTS作用下的對(duì)照結(jié)果

表4是XRS107在Cu2+作用下的對(duì)比結(jié)果，表4的結(jié)果表明，雖然Cu2+參與了XRS107的代謝過(guò)程，但對(duì)代謝過(guò)程無(wú)明顯影響。

3結(jié)論

本文采用殼聚糖為原料制備了CTS-Cu配合物，并采用微量熱法和光密度值法聯(lián)合研究了CTS-Cu對(duì)XRS107代謝的影響。研究結(jié)果表明，CTS-Cu對(duì)XRS107的生長(zhǎng)代謝過(guò)程產(chǎn)生明顯的影響，其影響特點(diǎn)是低濃度刺激，高濃度抑制，而CTS和Cu2+對(duì)XRS107的生長(zhǎng)過(guò)程無(wú)明顯影響。

[參考文獻(xiàn)]

[1]解勝利, 茍建霞, 丁宗旺. 殼聚糖金屬鋅衍生物的制備常溫櫻桃保鮮研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,54(14): 3485-3488.

[2]Pedroni V I, Schulz P C, Gschaider M E, et al.Chitosan structure in aqueous solution[J].Colloid and Polymer Science,2003,282: 100-102.

[3]Chen D M, Li W, Wu Y R, et al. Preparation and characterization of chitosan/montmorillonite magnetic microspheres and its application for the removal of Cr(VI)[J]. Chemical Engineering Journal, 2013, 221: 8-15.

[4]Varma A J, Deshpande S V, Kennedy J F. Metal complexation by chitosan and its derivatives: a review. Carbohydrate Polymers, 2004, 55(1): 77-93.

[5]Lee S T, Mi F L, Shen Y J, et al.Equilibrium and kinetic studies of copper(II) ion uptake by chitosan-tripolyphosphate chelating resin[J].Polymer, 2001, 42: 1879-1892.

[6]劉蓮, 林貴梅, 邵偉. 微量熱技術(shù)在微生物和細(xì)胞研究方面的應(yīng)用[J].藥物生物技術(shù), 2010, 17(1): 79-82.

[7]胡艷軍, 蔣風(fēng)雷, 歐陽(yáng)宇,等. 微量熱法在藥物活性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[J].中國(guó)科學(xué):化學(xué), 2010 (9): 1276-1285.

[8]Shen X S, Jin M H, Liu Y, et al.Microcalorimetric study of the effect of artesunate on the growth metabolism of mitochondria isolated from rat liver[J].Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 2013, 111(3): 1947-1952.

[9]Wang X H, Du Y M, Fan L H, et al.Chitosan-metal complexes as antimicrobial agent: synthesis, characterization and structure - activity study[J].Polymer Bulletin, 2005, 55: 105-113.

[10]Kong M, Chen X G, Xing K, et al.Antimicrobial properties of chitosan and mode of action: A state of the art review[J].International Journal of Food Microbiology, 2010, 144: 51-63.

[11]馮小強(qiáng),李小芳,楊聲，等.殼聚糖金屬配合物對(duì)黑曲霉的抑制活性研究[J].食品科學(xué), 2011, 32(3): 152-155.

[12]劉揚(yáng),于靜濤,孫瑩瑩，等.殼聚糖及其衍生物抗菌性能研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)用口腔科雜志, 2011, 4(7): 437-439.

[13]Kong W J, Xing X Y, Xiao X H, et al.Effect of berberine on Escheerichia coli, Bacillus subtilis, and their mixtures as determined by isothermal microcalorimetry[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 96(2): 503-510.

[14]屈嘯聲, 林瑞森, 方文軍.環(huán)境氣氛對(duì)微量熱安瓿法測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)速率常數(shù)的干擾[J].化學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 68(1):50-54.

Microcalorimetric Study on Interaction of Chitosan

Copper and Endophyte of Walnut in Walnuton

Hu Fan, Luo Xiaojie, Liu Yuqing, Lu Yao, Xia Caifeng*

(SchoolofChemistryandMaterialsScience,HubeiEngineeringUniversity,Xiaogan,Hubei432000,China)

Key Words：chitosan-Cu(CTS-Cu);walnut endophyte(XRS107);infrared spectroscopy;microcalorimetry

(責(zé)任編輯：張凱兵)