制草烏水煮法炮制工藝質(zhì)量研究

制草烏水煮法炮制工藝質(zhì)量研究

傅素華1，韓 鵬2*，田利洪2，蔣桂池2，葉興法2

(1. 紹興市食品藥品檢驗所，紹興312000； 2. 浙江景岳堂藥業(yè)有限公司，紹興312025)

摘要：目的研究制草烏水煮法炮制工藝的最佳參數(shù)。方法 選擇加水量、浸泡時間、水煮時間3個因素，以炮制前后烏頭類雙酯型總生物堿和烏頭類單酯型總生物堿的含量為考察指標(biāo)，優(yōu)選炮制工藝參數(shù)。結(jié)果 最佳工藝參數(shù)為：加水量5倍，水煮時間2 h，浸泡時間8 d。結(jié)論 依據(jù)該工藝參數(shù)，經(jīng)3批大生產(chǎn)樣品驗證，均符合《中國藥典》2010年版一部制草烏項下有關(guān)規(guī)定，表明該工藝穩(wěn)定可行，適用于規(guī)?；a(chǎn)。

關(guān)鍵詞：草烏；制草烏；炮制；總生物堿

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.03.008

中圖分類號：R284

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1004-2407(2015)03-0244-03

Abstract:ObjectiveTo investigate the optimal processing parameters of water-boiling method for prepared Kusnezoff monkshood root. MethodThe effects of three factors on the processing were investigated including the amount of water，the soaking time and the boiling time. The total aconitine-type diester-diterpenoid alkaloids and the total aconitine-type monoester alkaloids detected before and after processing were taken as indices. ResultsThe optimal processing parameters were as follows:the amount of water:5 folds, the boiling time:2 hours，the soaking time:8 days.ConclusionUnder the processing parameters， three production lots of prepared Kusnezoff monkshood root all met the requirements of Chinese Pharmacopoeia (in 2010 eaition).The optimized processing parameters is stable，feasible and suitable for large-scale production

作者簡介：傅素華，男，主管中藥師

收稿日期：(2014-11-04)

Study on the water-boiling process method of prepared Kusnezoff monkshood root

FU Suhua1，HAN Peng2*，TIAN Lihong2，JIANG Guichi2， YE Xingfa2(1.Shaoxing Institute for Food and Drug Control，Shaoxing 312000， China； 2.Zhejiang Jingyuetang Pharmaceutical Limited Company， Shaoxing 312025,China)

Key words:Kusnezoffmonkshoodroot； preparedKusnezoffmonkshoodroot； processing； total alkaloid

*通信作者：韓鵬，女，高級工程師

草烏為常用毒性中藥，性辛、苦、熱 有大毒，歸心、肝、腎、脾經(jīng)，功能主治為祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛，用于風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛及麻醉止痛。其主要成分為烏頭類雙酯型生物堿，包括烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，該類生物堿具有鎮(zhèn)痛、麻醉、抗炎、降壓等作用，但毒性極強，成人口服0.2 mg即產(chǎn)生中毒反應(yīng)，2~4 mg·kg-1可致人死亡[1]。一般多經(jīng)炮制減毒后使用，草烏的炮制方法很多，有蒸法、清水煮法、豆腐煮法等炮制方法， 其中以清水煮法工藝最為簡單、常用，且其“去毒”效果較好[2]，經(jīng)炮制后烏頭類雙酯型生物堿大大減少，而水解后烏頭類單酯型生物總堿，包括苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿的量會增加，其毒性為原雙酯類生物堿的1/2 000~1/4 000[3]。草烏及制草烏被歷版《中國藥典》及多個省市中藥飲片炮制規(guī)范所收載，但《中國藥典》2010年版顯著提升了制草烏的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[4]，其中草烏藥材項下規(guī)定烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的含量總和應(yīng)控制在0.10%~0.50%，炮制后其烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的含量總和控制不得超過0.040%，水解產(chǎn)物苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿的總和控制在0.020%~0.070%，而按以往傳統(tǒng)炮制經(jīng)驗參數(shù)加工，產(chǎn)品出現(xiàn)較多不合格情況，但藥典標(biāo)準(zhǔn)制法中又缺乏具體的工藝參數(shù)，因此，希望通過實驗研究掌握各參數(shù)變化規(guī)律，并為制草烏炮制工藝確定具體的參數(shù)值。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-15C高效液相色譜儀(島津儀器(蘇州)有限公司)； AE200電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；DL-480E超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)； DFT-200高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；DHG-9140A電熱恒溫干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；藥典標(biāo)準(zhǔn)三號篩。

1.2試藥對照品：烏頭堿(批號110720-200410)，新烏頭堿(批號110799-200404 )，次烏頭堿(批號110798-200404)，苯甲酰新烏頭原堿(批號110795-201102)，苯甲酰次烏頭原堿(批號111796-201102)，均由中國食品藥品檢定研究院提供；苯甲酰烏頭原堿對照品(批號130513，由上海哈靈生物制品有限公司提供)；乙腈、四氫呋喃為色譜純；水為超純水；醋酸銨、冰醋酸、異丙醇、三氯甲烷、氨、乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯均為分析純。

草烏藥材由浙江景岳堂藥業(yè)有限公司提供，產(chǎn)地為四川，經(jīng)鑒定，為毛莨科植物北烏頭AconitumkusnezoffiiReichb.的干燥塊根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱為Ultimate AQ-C18(水性，250 mm ×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-四氫呋喃(25∶15)為流動相A，以0.1 mol· L-1醋酸銨溶液(每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL)為流動相B，按藥典草烏含量測定項下規(guī)定的方法進行梯度洗脫；檢測波長為235 nm。理論板數(shù)按新烏頭堿峰計算應(yīng)不低于2 000。

2.2 對照品溶液的制備 取烏頭堿對照品、次烏頭堿對照品、新烏頭堿對照品、苯甲酰烏頭原堿對照品、苯甲酰次烏頭原堿對照品、苯甲酰新烏頭原堿對照品，精密稱定，加異丙醇-三氯甲烷(1∶1)混合溶液分別制成每1 mL含烏頭堿30 μg、次烏頭堿10 μg、新烏頭堿50 μg、苯甲酰烏頭原堿20 μg、苯甲酰次烏頭原堿0.1 mg、苯甲酰新烏頭原堿80 μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備取本品粉末(過3號篩)約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz；水溫在25℃以下)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，在40 ℃以下減壓回收溶劑至干，殘渣精密加入異丙醇-三氯甲烷(1∶1)混合溶液3 mL溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.5 炮制方法 按《中國藥典》2010年版規(guī)定草烏的炮制方法：取草烏，大小個分開，用水浸泡至內(nèi)無干心，取出，加水煮至取大個切開內(nèi)無白心、口嘗微有麻舌感，取出，晾至六成干后切片，干燥。本實驗中采用個頭大小均勻的草烏，參考《浙江省中藥炮制規(guī)范》2005年版[5]，切成1~2 mm后的薄片，曬干。

2.6 不同加水量的影響 固定浸泡時間8 d，水煮時間2 h，選擇加水量分別為5，10，15 和20倍進行研究。實驗結(jié)果表明，在上述固定浸泡時間和水煮時間情況下，加水量對炮制品生物堿含量變化的影響不大，烏頭堿和新烏頭堿均幾乎水解完全，次烏頭堿尚有極少量未水解，測定結(jié)果見表1。

表1 不同加水量的影響實驗結(jié)果

Tab.1 Results of sample detection for different water amount

影響因素烏頭堿/%次烏頭堿/%新烏頭堿/%總雙酯型生物堿/%苯甲酰烏頭原堿/%苯甲酰次烏頭原堿/%苯甲酰新烏頭原堿/%總單酯型生物堿/%原藥材0.0320.0630.3680.463000.0240.0245倍水00.00900.0090.0070.0110.0330.05110倍水00.00500.0050.0040.0070.0350.04615倍水00.00600.0060.0030.0050.0320.04020倍水00.00600.0060.0030.0050.0360.044

2.7不同水煮時間的影響 固定浸泡時間為8 d，加水量為5倍，選擇水煮時間分別為0.5，1，2和3 h進行研究。實驗結(jié)果表明，在固定上述浸泡時間和加水量情況下，水煮時間對炮制品生物堿含量變化有一定的影響，其中烏頭堿水解的速度最快，幾乎完全水解，新烏頭堿水解速度稍慢，經(jīng)2 h方水解完全，次烏頭堿水解速度最慢，經(jīng)3 h仍有部分未水解。測定結(jié)果見表2。

表2 不同水煮時間的影響實驗結(jié)果

Tab.2 Results of sample detection for different boiling time

影響因素烏頭堿/%次烏頭堿/%新烏頭堿/%總雙酯型生物堿/%苯甲酰烏頭原堿/%苯甲酰次烏頭原堿/%苯甲酰新烏頭原堿/%總單酯型生物堿/%原藥材0.0320.0630.3680.463000.0240.0240.5h00.0330.0240.0570.0050.0120.1270.1441h00.0250.0120.0370.0070.0150.0630.0852h00.0090.0060.0150.0020.0060.0410.0493h00.0030.0040.0070.0050.0080.0320.045

2.8 不同浸泡時間的影響 固定加水量為5倍，水煮時間為2 h，選擇浸泡時間分別為4，6，8和10 d進行研究。實驗結(jié)果表明：在固定上述水煮時間和加水量的情況下，浸泡時間對炮制品生物堿含量變化影響最大，其中浸泡時間為8和10 d 2種條件下，總單酯型生物堿總量在合格范圍內(nèi)(0.02%~0.07%)。測定結(jié)果見表3。

表3不同浸泡時間的影響實驗結(jié)果

Tab.3 Results of sample detection for different soaking time

影響因素烏頭堿/%次烏頭堿/%新烏頭堿/%總雙酯型生物堿/%苯甲酰烏頭原堿/%苯甲酰次烏頭原堿/%苯甲酰新烏頭原堿/%總單酯型生物堿/%原藥材0.0320.0630.3680.463000.0240.0244d00.0370.0380.0750.0140.0220.2140.2506d00.0270.0150.0420.0060.0120.0860.1048d00.0060.0030.0090.0040.0060.0390.04910d00.0050.0060.0110.0070.0050.0350.047

2.9 結(jié)論 分別取草烏50 kg，按照擬定的炮制方法試制樣品3批進行驗證，結(jié)果表明，3批樣品(批號20140201，20140202，20140203)的烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的含量總和分別為0.008%，0.007%和0.010%，含苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿及苯甲酰新烏頭原堿的總量分別為0.048%，0.051%和0.048%(以上結(jié)果均按干燥品計算)，結(jié)果均符合藥典有關(guān)規(guī)定，表明工藝參數(shù)可控，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。建議最佳工藝參數(shù)確定為：加水量5倍，水煮時間2 h，浸泡時間8 d。樣品的含量測定色譜圖見圖1。

圖1HPLC圖

A.對照品；B.生草烏；C.制草烏；1.苯甲酰新烏頭原堿；2.苯甲酰烏頭原堿；3.苯甲酰次烏頭原堿；4.新烏頭堿；5.次烏頭堿；6.烏頭堿

Fig.1 HPLC chromatograms

A. reference substance；B.Kusnezoffmonkshoodmother-root sample；C. preparedKusnezoffmonkshoodroot sample；1.benzoylmesaconine；2.benzoylaconine；3.benzoylhypacoitine；4.mesaconitine；5.hypaconitine； 6. aconitine

3 討論

草烏經(jīng)炮制后，雙酯型生物堿明顯降低，單酯型生物堿明顯增加，符合酯型生物堿的水解原理，但從研究數(shù)據(jù)中無法尋找到明顯的線性變化規(guī)律。通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，浸泡時間是最重要的影響因素，加水量幾乎沒有影響。烏頭類雙酯型生物總堿水解比較完全，容易達到指標(biāo)。該類成分雖然是毒性成分，但也具有藥理活性，因此認為不是水解越完全越好，適當(dāng)保留更為合理。

烏頭類單酯型生物堿的產(chǎn)生和進一步降解是比較難掌控的，浸泡時間在6 d內(nèi)，苯甲酰新烏頭原堿多為超標(biāo)，但延長浸泡時間、或延長煎煮時間，會使該類生物堿低于下限。同時，炮制品的干燥溫度也是重要的影響因素，本研究中采用傳統(tǒng)曬干操作，參考其他文獻和實驗，建議干燥溫度不超過40 ℃。

經(jīng)不同浸泡時間炮制的制草烏外觀性狀略有不同，浸泡時間越短，表面顏色越深，越接近黑色，但仍符合《中國藥典》黑褐色的要求。

綜合本研究數(shù)據(jù)中兩類生物堿的含量變化規(guī)律，留待今后與其他炮制方法進一步進行研究比對。

HPLC法測定2種烏頭藥材中生物堿的含量可為內(nèi)標(biāo)法[6]和外標(biāo)法，本文采用《中國藥典》制草烏項下外標(biāo)法同時測定6種生物堿。

參考文獻：

[1]周遠鵬，江京莉. 附子的研究-Ⅵ: 附子中烏頭堿及其有關(guān)化合物的藥理作用[J].中國藥理與臨床，1992，8(5)：45-49.

[2]鄧廣海，林華，龔又明.草烏及其炮制品中6種生物堿成分的含量測定[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19(7)：35-38.

[3]杜貴友，方文賢.有毒中藥現(xiàn)代研究與合理應(yīng)用[M] .北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：561.

[4]國家藥典委員會.中國藥典2010年版[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:220-221.

[5]浙江省衛(wèi)生廳.浙江省中藥炮制規(guī)范[S]. 杭州：浙江科學(xué)技術(shù)出版社，2005:73.

[6]柳文媛，劉靜涵.HPLC法測定兩種烏頭藥材中生物堿的含量[J].西北藥學(xué)雜志，1998，13(1): 8-9.