新型甾體N，N-二甲基縮氨硫腙類化合物的合成及其抗腫瘤活性*

黃燕敏，鄭嘉樺，趙丹丹，戚斌斌，楊春暉，盛海兵，甘春芳，崔建國(guó)(廣西師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，廣西南寧　530001)

?

新型甾體N，N-二甲基縮氨硫腙類化合物的合成及其抗腫瘤活性*

黃燕敏，鄭嘉樺，趙丹丹，戚斌斌，楊春暉，盛海兵，甘春芳，崔建國(guó)
(廣西師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，廣西南寧530001)

摘要:以乙醇(或甲醇為溶劑)，冰醋酸為催化劑，去氫表雄酮、孕烯醇酮、雌酮和3，5-二羥基-6-甲?；?B-降膽甾烷分別與N，N-二甲基硫代氨基脲經(jīng)縮合反應(yīng)，合成了4個(gè)新型的具有不同甾核結(jié)構(gòu)特征的甾體N，N-二甲基縮氨硫腙類化合物(1～4)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR，IR和HR-EI-MS表征。采用MTT法測(cè)定了1～4對(duì)肝癌細(xì)胞(HepG)、人鼻咽癌細(xì)胞(CNE-2)和人腎上皮細(xì)胞(HEK-293T)的體外抑制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性。結(jié)果表明:1～3對(duì)HepG和CNE-2具有明顯的抑制活性。

關(guān)鍵詞:甾酮; 3，5-二羥基-6-甲?；?B-降膽甾烷; N，N-二甲基甾體縮氨硫腙;合成;抗腫瘤活性

Tel.0771-3101180，E-mail:huangyanmin828@163.com

通信聯(lián)系人:崔建國(guó)，教授，Tel.0771-5530019，E-mail:cuijg1954@126.com

近來，人們發(fā)現(xiàn)在甾體化合物中引入氮，硫原子或與含氮，硫等雜原子的藥效基團(tuán)拼合后，會(huì)產(chǎn)生獨(dú)特的生物活性，用于治療不同的疾?。?－6］。腙類化合物是有機(jī)化學(xué)家關(guān)注的焦點(diǎn)［7－8］，許多結(jié)構(gòu)獨(dú)特的甾體腙類化合物已相繼被合成，并且許多具有良好的抗腫瘤、抗菌及抗病毒活性［9－11］。其中，縮胺硫腙化合物因其良好的腫瘤細(xì)胞毒性、抗菌活性及抗病毒活性，日益受到藥物學(xué)家關(guān)注。在甾體中引入縮胺硫腙藥效團(tuán)的化合物有很好的鎮(zhèn)痛、抗菌、抗真菌及抗炎活性［12－16］。但至今為止，具有抗腫瘤活性的甾體縮胺硫腙化合物報(bào)道較少。

Scheme 1

本課題組曾分別以膽固醇、孕烯醇酮、豆甾醇等為原料，合成了一系列甾體肟類及縮氨硫腙類化合物。體外抗腫瘤活性研究發(fā)現(xiàn)其有較好的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性［17－20］。2010年，Huang H等［21］設(shè)計(jì)并合成了一系列結(jié)構(gòu)新穎的稠環(huán)類縮胺硫腙化合物，并深入研究了其抗腫瘤活性和作用機(jī)制。其中部分化合物表現(xiàn)出顯著抑制人腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性，特別是具有N，N-二甲基縮氨硫腙結(jié)構(gòu)的化合物TSC24(Chart 1)活性最強(qiáng)，對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株抑制活性的IC50值在2 μmol· L－1～830 μmol·L－1

Chart 1

受此啟發(fā)，本文在文獻(xiàn)［21］方法的基礎(chǔ)上，以乙醇(或甲醇為溶劑)，冰醋酸為催化劑，去氫表雄酮、孕烯醇酮、雌酮和3，5-二羥基-6-甲酰基-B-降膽甾烷分別與N，N-二甲基硫代氨基脲經(jīng)縮合反應(yīng)，合成了4個(gè)新型的具有不同甾核結(jié)構(gòu)特征的甾體N，N-二甲基縮氨硫腙化合物(1～4，Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR，IR和HR-EI-MS確證。測(cè)定了1～4對(duì)腫瘤細(xì)胞［肝癌細(xì)胞(HepG)、人鼻咽癌細(xì)胞(CNE-2)和人腎上皮細(xì)胞(HEK-293T)］的生長(zhǎng)增殖活性，希望利用甾體化合物滲透細(xì)胞膜的功能，獲得具有更好抗腫瘤活性的甾體縮氨硫腙化合物。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

X6型顯微熔點(diǎn)儀(溫度未校正); Bruker AV-300型超導(dǎo)核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)); Thermo Scientific Nicolet IS-10型傅立葉紅外光譜儀(KBr壓片); Agilent 6210 TOFMS型質(zhì)譜儀; MLLTISKAN MK3型分光光度儀。

3，5-二羥基-6-甲?；?B-降膽甾烷參考文獻(xiàn)［19］方法合成;去氫表雄酮、孕烯醇酮，雌酮和N，N-二甲基硫代氨基脲，百靈威科技有限公司;薄層層析板和硅膠，安徽良臣硅源材料有限公司;其余所用試劑均為分析純，溶劑按常規(guī)方法干燥除水。

1.2 1～4的合成通法

在反應(yīng)瓶中加入甾醇0.40 mmol，N，N-二甲基氨基硫脲0.41 mmol和無水乙醇25 mL，于75℃攪拌使其完全溶解;加入冰醋酸0.5 mL，反應(yīng)4 h(TLC跟蹤)。減壓蒸除大部分溶劑后加入蒸餾水20 mL，用乙酸乙酯(3×20 mL)萃取，合并有機(jī)相，依次用飽和碳酸氫鈉溶液(30 mL)和飽和氯化鈉溶液(30 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥;減壓蒸除溶劑后經(jīng)柱層析［洗脫劑:V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶1］純化得白色固體1～3和棕色油狀液體4。

N，N-二甲基-去氫表雄酮-17-縮氨硫腙(1):產(chǎn)率32%，m.p.200℃～202℃;1H NMR δ:0.92(s，3H，18-H)，1.04(s，3H，19-H)，3.33(s，6H，NCH3)，3.48～3.59(m，1H，3-Hα)，5.37(d，J=4.8 Hz，1H，6-H)，7.87(br s，1H，NH);13C NMR δ:16.8(C18)，19.4(C19)，20.5(C11)，23.5(C15)，29.7(C16)，31.2(C8)，31.3(C7)，31.6(C2)，33.9(C12)，34.0(C10)，36.6(NCH3)，37.2(C1)，42.2(C4)，44.5(C13)，50.3(C9)，53.8(C14)，71.6(C3)，121.0(C6)，141.0(C5)，165.8(C17)，182.9(C=S); IR ν:3 424，2 925，1 644，1 539，1 464，1 364，1 260，1 118，1 053，908，734 cm－1; HR-EI-MS m/z:Calcd for C22H36N3OS{［M +H］+}390.257 9，found 390.258 6。

N，N-二甲基孕甾-20-縮氨硫腙(2):產(chǎn)率42%，m.p.217℃～218℃;1H NMR δ:0.67(s，3H，18-H)，1.02(s，3H，19-H)，1.26(s，3H，21-CH3)，3.31(s，6H，NCH3)3.48～3.59(m，1H，3-Hα)，5.36(d，J=4.8 Hz，1H，6-H);13C NMR δ:13.5(C18)，19.4(C19)，20.9(C21)，21.0(C11)，23.7(C15)，24.2(C16)，29.7(C2)，31.6(C8)，32.1(C7)，36.5(C10)，36.5(NCH3)，37.3(C1)，38.4(C12)，42.2(C4)，45.2(C13)，50.0(C9)，56.3(C17)，58.0(C14)，71.7(C3)，121.2(C6)，140.8(C5)，152.1(C20)，183.0(C=S); IR ν:3 424，2 925，1 726，1 504，1 384，1 314，1 254，1 122，1 050，908，726 cm－1; HR-EI-MS m/z:Calcd for C24H40N3OS{［M + H］+} 418.289 2，found 418.290 3。

N，N-二甲基雌酮-17-縮氨硫腙(3):產(chǎn)率37%，m.p.183℃～185℃;1H NMR δ:0.93(s，3H，18-H)，2.84～2.89(m，2H，16-H)，3.37(s，6H，NCH3)，6.61(s，1H，4-H)，6.69(d，J=8.4 Hz，1H，2-H)，7.15(d，J=8.4 Hz，1H，1-H);13C NMR δ:17.1(C18)，23.2(C11)，26.1(C15)，27.1(C16)，29.5(C7)，29.7(C6)，34.1(C12)，38.1(NCH3)，40.0(C8)，44.0(C9)，45.0(C13)，52.6(C14)，112.9(C2)，115.3(C4)，126.4(C1)，132.0(C10)，138.0(C5)，153.7(C3)，166.0(C17)，182.7(C=S); IR ν:3 411，2 925，1 731，1 606，1 539，1 499，1 372，1 257，1 095，921，816，724 cm－1; HR-EI-MS m/z:Calcd for C21H30N3OS{［M + H］+} 372.211 0，found 372.211 7。

3，5-二羥基-N，N-二甲基-B-降膽甾-6-縮氨硫腙(4):產(chǎn)率58%;1H NMR δ:0.67(s，3H，18-H)，0.86(d，J=6.6 Hz，6H，26，27-H)，0.91(d，J=6.0 Hz，3H，20-H)，0.92(s，3H，19-H)，2.02(m，2H，4，8-H)，2.16(t，J=8.1 Hz，1H，7-H)，3.33(s，6H，NCH3)，4.10(br s，1H，3-H)，7.21(d，J=6.8 Hz，1H，6-H);13C NMR δ:12.5(C18)，18.6(C19)，18.8(C21)，21.6(C11)，22.5(C27)，22.8(C26)，23.8(C23)，24.6(C15)，27.9(C25)，28.0(C16)，28.5(C2)，35.6(C1)，36.2(C20)，39.5(C22)，39.7(C4)，43.0(C24)，43.2(C12)，43.0(NCH3)，43.7(C10)，44.7(C8)，45.2(C13)，51.3(C9)，53.4(C7)，55.6(C14)，56.2(C17)，67.1(C3)，83.7(C5)，150.7(C=N)，181.0(C=S); IR ν:3 422，2 940，2 866，1 719，1 614，1 547，1 467，1 377，1 365，1 270，1 235，1 123，1 078，1 016 cm－1; HR-EIMS m/z:Calcd for C30H54N3O2S{［M + H］+}，found 520.393 7。

1.3抗腫瘤活性測(cè)定

以順鉑為陽(yáng)性對(duì)照，采用MTT法測(cè)定了1～4 對(duì)HepG，CNE-2和HEK-293T的體外生長(zhǎng)增殖抑制活性。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分別以(3～4)×104個(gè)/mL的密度接種于96孔板中，每孔接種200 μL，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按預(yù)設(shè)的濃度梯度分別加入待測(cè)樣品，每一個(gè)濃度梯度設(shè)3個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)對(duì)照孔和空白孔。保持37℃在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。每孔加入20 μL的MTT(5 mg· mL－1)溶液，再于CO2培養(yǎng)箱中溫育4 h。棄去上清液，加入DMSO 200 μL，混勻10 min，待沉淀完全溶解后，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定溶液的OD值，計(jì)算一定濃度下化合物對(duì)細(xì)胞的抑制率;以抑制率對(duì)藥物濃度作圖，分別求出每個(gè)樣品的IC50值。

2　結(jié)果與討論

2.1合成與表征

從去氫表雄酮、孕烯醇酮和雌酮出發(fā)，其17-位或20-位羰基與N，N-二甲基硫代氨基脲發(fā)生縮合反應(yīng)，引入N，N-二甲基氨基硫腙基團(tuán)，合成了1～3。

1的1H NMR分析表明，δ 3.33處單峰為6個(gè)氫［N(CH3)2，此處與氮原子相連的兩甲基是等位的，故表現(xiàn)為一個(gè)單峰］，δ 7.87處的寬單峰是與氮相連氫的吸收峰。13C NMR分析表明，δ 182.9處出現(xiàn)C=S吸收峰，δ 165.8處出現(xiàn)C=N吸收峰，去氫表雄酮17-位羰基碳在δ 220處的吸收峰消失，均表明去氫表雄酮中的17-羰基已與N，N-二甲基硫代氨基脲縮合合成了1。2和3的表征與1類似。

4的1H NMR分析表明，δ 7.21處的吸收峰是與氮相連6-位氫吸收峰，δ 4.10處的吸收峰是與羥基相連3-位氫吸收峰，δ 3.33處的單峰是與氮相連的兩個(gè)甲基的6個(gè)氫吸收峰。13C NMR分析表明，δ 67.1和δ 83.6吸收峰分別是與羥基相連的C3和C5;δ 180.9處吸收峰歸屬C=S，δ 150.7處吸收峰則歸屬C=N，進(jìn)一步結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)可確定4的結(jié)構(gòu)。

2.2抗腫瘤活性

1～4的抗腫瘤活性見表1。由表1可見，1～4對(duì)所測(cè)試的腫瘤細(xì)胞株均具有一定的抑制生長(zhǎng)增殖活性，其中1對(duì)CNE-2的IC50為15.4 μmol· L－1，優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照物順鉑; 2對(duì)HepG的IC50為

表1　化合物的抗腫瘤活性*Table 1　Anti-tumor activities of compounds

10.7 μmol·L－1。有趣的是具有17-縮氨硫腙結(jié)構(gòu)的化合物1和3對(duì)HEK-293T沒有明顯的細(xì)胞毒性，值得進(jìn)一步深入研究。

3　結(jié)論

以具有不同甾核結(jié)構(gòu)特征的甾酮或甾醛作為原料，合成了4個(gè)具有不同結(jié)構(gòu)特征的N，N-二甲基甾體縮氨硫腙類化合物?？鼓[瘤活性研究結(jié)果表明:所有化合物對(duì)所測(cè)試的腫瘤細(xì)胞都表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)增殖抑制活性。其中，具有17-縮氨硫腙結(jié)構(gòu)的化合物對(duì)人腎上皮正常細(xì)胞HEK-293T沒有表現(xiàn)出明顯的抑制活性。以上結(jié)果為新的甾體抗腫瘤藥物的設(shè)計(jì)合成提供參考。

參考文獻(xiàn)

［1］Mohared R M，Elmegged G A，Abdel-Salam O M E，et al.Synthesis of modification as a novel class of nonulcerogenic，anti-inflammatory and anti-nociceptive agent［J］.Steroid，2011，76:1190－1203.

［2］Natalija M，Krsti?N M，Mira S，et al.New androst-4-en-17-spiro-1，3，2-oxathiaphospholanes.Synthesis，assignment of absolute configuration and in vitro cytotoxic and antimicrobial activities［J］.Steroids.，2012，77:558－565.

［3］Festi D，Montagnani M，Azzaroli F，et al.Clinical efficacy and effectiveness of ursodeoxycholic acid in cholestatic liver diseases［J］.Curr Clin Pharmacol，2007，2(2):155－177.

［4］Chen S J，Cui J G，Li Y，et al.Recent advance of steroidal hydrazone with biological activities［J］.Chinese J Org Chem，2011，31:187－192.

［5］Traf D T P.Hydride aza-steroid-alkylators in the treatment of colon cancer［J］.Cancer Lett，2006，243:202－210.

［6］范良華，崔建國(guó)，甘春芳，等.具有生物活性氮雜甾體化合物的研究進(jìn)展［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2012，24:8－15.

［7］Lebrecht D，Geist A，Ketelsen U P，et al.The 6-maleimidocaproyl hydrazone derivative of doxorubicin(DOXO-EMCH)is superior to free doxorubicin with respect to cardiotoxicity and mitochondrial damage ［J］.Inter J Cancer，2007，120(4):927－934.

［8］El-Hawash S A M，Wahab A E A.Synthesis and in vitro anticancer and antimicrobial evaluation of some novel quinoxalines derived from 3-phenylquinoxaline-2(1H)-thione［J］.Archiv der Pharm，2006，339(8):437－447.

［9］Loncle C，Brunel J M，Vidal N，et al.Synthesis and antifungal activity of cholesterol-hydrazone derivatives ［J］.Euro Med Chem，2004，39:1067－1071.

［10］Kemertelidze E P，Papadopoulos K，Men＇shova N I.Some derivatives of 5α-ketosteroid hydrazones:Synthesis from tigogenin and antituberculosis activity ［J］.Russ Bioorg Chem，2004，30(5):497－501.

［11］Khan S A，Asiria A M，Yusuf M.Synthesis and biological evaluation of some thiazolidinone derivatives of steroid as antibacterial agents［J］.Eur Med Chem，2009，44:2597－2600.

［12］Khan S A，Kumar P，Joshi R，et al.Synthesis and in vitro antibacterial activity of new steroidal thiosemicarbazone derivatives［J］.Eur Med Chem，2008，43:2029－2034.

［13］Khan S A.Synthesis，characterization and in vitro antibacterial activity of new steroidal 5-en-3-oxazolo and thiazoloquinoxaline［J］.Eur Med Chem，2008，43:2040－2044.

［14］Khan S A，Saleem K，Khan Z.Synthesis，characterization and in vitro antibacterial activity of new steroidal thiazolo quinoxalines［J］.Eur Med Chem，2007，42:103－108.

［15］Khan S A，Yusuf M.Synthesis，spectral studies and in vitro antibacterial activity of steroidal thiosemicarbazone and their palladium［Pd(II)］complexes［J］.Eur Med Chem，2009，44:2270－2274.

［16］Khan S A，Saleem K，Khan Z.Synthesis，structure elucidation and antibacterial evaluation of new steroidal-5-en-7-thiazoloquinoxaline derivatives［J］.Eur Med Chem，2008，43:2257－2261.

［17］Gan C F，Lin Q F，Cui J G，et al.Synthesis and in vitro antiproliferative evaluation of some novel B-norcholesterols［J］.Steroids，2014，79:37－43.

［18］Gan C F，Cui J G，Su S Y，et al.Synthesis and antiproliferative activity of some steroidal thiosemicarbazones，semicarbazones and hydrozones［J］.Steroids，2014，87:99－107.

［19］Gan C F，F(xiàn)an L H，Cui J G，et al.Synthesis of novel ring B abeo-sterol derivatives and their antiproliferative activities［J］.Steroids，2012，77:1061－1068.

［20］Gan C F，F(xiàn)an L H，Huang Y M，et al.Synthesis of novel ring B abeo-sterol derivatives and their antiproliferative activities［J］.Med Chem，2013，9:846－854.

［21］Huang H，Chen Q，Ku X，et al.A series of alphaheterocyclic carboxaldehyde thiosemicarbazones inhibit topoisomerase IIα catalytic activity［J］.J Med Chem，2010，53(8):

Synthesis and Anti-tumor Activities of
Novel Steroidal N，N-dimethylthiosemicarbazone Compounds

HUANG Yan-min，ZHENG Jia-hua，ZHAO Dan-dan，QI Bin-bin，YANG Chun-hui，SHENG Hai-bing，GAN Chun-fang，CUI Jian-guo
(College of Chemistry and Materials Science，Guangxi Teachers Education University，Nanning 53001，China)

Abstract:Four novel N，N-dimethylthiosemicarbazone compounds(1～4)were synthesized by condensation reaction of dehydroepiandrosterone，pregnenolone，estrone，3，5-dihydroxy-6-formyl-B-norcholestane with N，N-dimethylthiosemicarbazide，respectively，using EtOH(or MeOH)as solvent and HAc as catalyst.The structures were characterized by1H NMR，13C NMR，IR and HR-EI-MS.The anti-tumor activities of 1～4 against human hepatoma cells(HepG)，nasopharyngeal carcinoma cells(CNE-2)and normal kidney epithelial cells(HEK293T)were investigated by MTT method.The results showed that 1～3 had better antiproliferative activities against HepG and CNE-2.

Keywords:sterone; 3，5-dihydroxy-6-formyl-B-norcholestane; steroidal N，N-dimethylthiosemicarbazon; synthesis; anti-tumor activity

作者簡(jiǎn)介:黃燕敏(1973－)，女，漢族，廣西隆安人，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事甾體化合物的制備和抗腫瘤活性研究。

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21462009);南寧市科技開發(fā)項(xiàng)目(20145203)

收稿日期:2015-09-09

DOI:10.15952/j.cnki.cjsc.1005－1511.2015.12.1106 *

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

中圖分類號(hào):O629.21; R914.5