體外誘導(dǎo)實現(xiàn)豬的ips細胞向神經(jīng)干細胞分化

體外誘導(dǎo)實現(xiàn)豬的ips細胞向神經(jīng)干細胞分化

張鼎，張曉姍，王祎

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，北京100094)

摘要：項目的主要目標是實現(xiàn)豬的誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)向神經(jīng)干細胞(NSCs)體外誘導(dǎo)。在整個實驗探索的過程中，我們使用了傳統(tǒng)的誘導(dǎo)分化形成神經(jīng)干細胞(NSCs)的方法，即通過擬胚體(EB)的形成并添加維甲酸(RA)進行誘導(dǎo)。豬的誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)經(jīng)歷了傳代培養(yǎng)、擬胚體(EB)時期、誘導(dǎo)分化時期三個重要階段，生成一類新的細胞。最后我們使用免疫熒光法檢測到新的細胞中存在神經(jīng)干細胞的特異性標志物 Nestin、神經(jīng)元標志物β- tubulin III以及神經(jīng)膠質(zhì)細胞標志物GFAP表達，從而確定這類新的細胞為神經(jīng)干細胞?？梢?豬的誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)經(jīng)過這種傳統(tǒng)誘導(dǎo)分化方法培養(yǎng)可分化為具備基礎(chǔ)特征的神經(jīng)干細胞(NSCs)，能夠表達出神經(jīng)干細胞(NSCs)特異的標志分子nestin。

關(guān)鍵詞：豬；誘導(dǎo)性多能干細胞；神經(jīng)干細胞；體外誘導(dǎo)

文章編號：1672-6758(2015)06-0059-5

中圖分類號：Q28

2006年, Takahashi等將四種轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4導(dǎo)入已分化的小鼠皮膚成纖維細胞,獲得了類似于胚胎干細胞(ESCs)的多能性干細胞, 命名為“誘導(dǎo)多能干細胞”(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。[1]小鼠和人[2]的誘導(dǎo)多能干細胞系(iPSCs)最先被建立起來，不同種類的畜牧類動物的誘導(dǎo)多能干細胞系(iPSCs)也相繼被建立起來，如豬[3]、綿羊[4]。誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)作為一種新型的多能干細胞，儼然已經(jīng)成為干細胞界的寵兒，其開發(fā)的潛力也是無窮的。隨著研究的不斷深入，人們在對比誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)和胚胎干細胞(ESCs)的過程中，發(fā)現(xiàn)了誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)擁有很大的優(yōu)勢。一方面，誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)由受體自身的細胞重新編碼生成，不會誘發(fā)免疫反應(yīng)。例如，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療領(lǐng)域，結(jié)合不同的病情，使用誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)誘導(dǎo)分化成不同類型的神經(jīng)細胞，能夠有效地避免免疫排斥，為臨床治療打下了基礎(chǔ)。[5]另外一方面，誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)能夠有效地避免倫理學(xué)帶來的問題。雖然誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)依然存在著很多不穩(wěn)定的因素以及爭論，但是不可否認誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)為再生醫(yī)學(xué)提供了一個全新的方向。[6]

誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)的研究在小鼠和人的身上都得到了很大的進步，但是目前體內(nèi)試驗依舊局限于小鼠的誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)上。如果小鼠模型得到的實驗結(jié)果直接應(yīng)用到人的身上，是要承擔(dān)很大的風(fēng)險的。小鼠和人在生理結(jié)構(gòu)和免疫特性上區(qū)別很大，主要體現(xiàn)在兩個方面：1.干細胞系多能性維持的主要信號通路不同。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，小鼠誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)多能性維持因子是白血病抑制因子(leukemia inhibitor factor，LIF)、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal transducers and activators of transcription, STAT),即LIF/STAT3信號通路。[7]人的誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)多能性維持依賴于堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和激活素(Activin)/節(jié)點信號[6]。2.小鼠生命周期過短，是一種很難實現(xiàn)長時間追蹤的醫(yī)學(xué)模型。所以我們需要另外一種模式生物，實現(xiàn)小鼠和人之間的過渡。豬作為傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)模型，在生理學(xué)和解剖學(xué)與人類具有很高的相似性。[8]同時經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，豬和人的誘導(dǎo)多能干細胞系(iPSCs)在維持多能性方面的信號通路具有相似性。[9]而且豬和小鼠的生命周期相比較長，容易進行長時間的追蹤。

因為豬的誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)相對小鼠和人的誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)是一種新興的誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)，細胞系的建立自身也不是十分完善，很多地方存在缺陷。由于缺少相關(guān)文獻的支持，我們只能依照著胚胎干細胞(ESCs)定向誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)干細胞的傳統(tǒng)方法，即通過擬胚體的形成并添加維甲酸(RA)進行誘導(dǎo)。

1試劑與材料

(1)ES培養(yǎng)基的配制: KnockoutTM DMEM 培養(yǎng)基(Gibco)， ES FBS(15%)，Glutamin(100x)，NEAA(100x)，β-mer(1000x)，Lif(1000x)；

(2)ES培養(yǎng)基的配制: DMEM/F12(1︰1) 培養(yǎng)基(Gibco), ES FBS(15%)，Glutamin(100x)，NEAA(100x)，β-mer(1000x)；

(3)神經(jīng)樣細胞分化培養(yǎng)基的配置: DMEM/F12(1︰1)培養(yǎng)基(Gibco), ES FBS(15%)，Glutamin(100x)，IBMX(1M)，β-mer(1000x)，RA(4mM)；

(4)抗體：

一抗：mouse anti-Synaptophysin (BM0125) abbit anti-nestin(BA0275) 、rabbit anti-GABA(BA0601) 、rabbit anti-Serotonin (BA0121) ； Mouse anti-GFAP (Sigma, G3893), mouse anti-β-tubulin isotypeⅢ (Sigma, T8660), mouse anti-O4(MAB345)；

二抗：標記山羊抗兔IgG(ZF0316), FITC 標記山羊抗鼠IgG(ZF0312)。

2方法

2.1 小鼠的胚胎干細胞、豬的ips細胞的傳代培養(yǎng)。

得到小鼠胚胎干細胞系以及豬的ips細胞系, 接種在飼養(yǎng)層細胞上。飼養(yǎng)層細胞經(jīng)γ射線照射滅活有絲分裂活性,接種ES培養(yǎng)基上培養(yǎng), 每天更換培養(yǎng)液。

2.2 擬胚體(EB)培養(yǎng)。

在ES培養(yǎng)皿中加入適量的Tryple(酶)，37℃消化5min，用移液槍吹打細胞，把細胞懸浮起來。將細胞吸入離心管中，1000r離心5min后，再倒掉上清液，用1-2mlEB培養(yǎng)基把細胞吹起來。再將細胞加到培養(yǎng)皿中，用分化培養(yǎng)液重懸細胞。在培養(yǎng)皿中加入PBS，將每滴懸液滴至平皿上蓋表面，迅速扣在下蓋上，放入培養(yǎng)箱。培養(yǎng)4 d,隔天換液。

2.3 向神經(jīng)干細胞的誘導(dǎo)分化。

收集懸浮培養(yǎng)4 d的EB擬胚體，用已經(jīng)配好的神經(jīng)樣細胞分化培養(yǎng)基進行培養(yǎng)4 d,每2 d換液。

2.4 神經(jīng)干細胞鑒定。

(1)取出培養(yǎng)皿，拋棄培養(yǎng)體系，將培養(yǎng)液吸去，用PBS洗2次；

(2)固定：用4% PPA處理細胞，在搖床上晃動30 min，接著用PBS洗3次， 5 min/次；

(3)對核表達的蛋白：0.2% Triton-100于培養(yǎng)皿，在室溫下30 min，接著用PBS洗3次，5 min/次；

(4)加入3% BSA封閉，室溫1 h；

(5)3% BSA稀釋的一抗覆蓋所染部分，室溫1-2h。再用PBS洗上3次，5 min/次；

(6)3%BSA(1:500)稀釋的二抗覆蓋所染部分，室溫1h。棄二抗，PBS洗3次，5 min/次；

(7)加入 1 μg/mL DAPI(1:10000)室溫下2 min。再用PBS洗上3次，5 min/次；

(8)封片：在蓋玻片上加防淬滅劑，避光保存；

(9)利用熒光顯微鏡觀察并拍照，檢測Nestin、GFAP、tublin的表達。(免疫細胞化學(xué)熒光染色法)

3結(jié)果

3.1 豬的iPSCs以及小鼠的ESCs形態(tài)變化過程。

小鼠的ESCs和豬的iPSCs的誘導(dǎo)分化形成NSCs的過程中，形態(tài)上的變化是十分明顯的。從表觀上來看，小鼠的ES細胞和豬的iPS細胞形態(tài)上的變化基本是一致的。按照3個階段進行分析：

3.1.1 傳代培養(yǎng)。

復(fù)蘇后第1天，撥開飼養(yǎng)層細胞，可以觀察到細胞小、亮、圓,細胞核大, 核仁明顯，細胞核/質(zhì)比高。細胞排列致密, 邊界清晰,呈集落形狀生長。

復(fù)蘇后第3天, 細胞克隆進一步增大, 中央逐漸突起, 顯微鏡下觀察立體感更強, 細胞排列更緊密。

(a)生長旺盛的MES細胞(×40)

(b)生長旺盛的Pips細胞(×40)

3.1.2 擬胚體(EB)的形成。

去除飼養(yǎng)層細胞后，進行懸浮培養(yǎng)，細胞能夠逐步地形成擬胚體(EB)。擬胚體(EB)呈球形，胚體飽滿。內(nèi)細胞間黏附緊密,邊界清楚。

(a)MES的擬胚體 (×40)

(b)Pips的擬胚體 (×40)

3.1.3 誘導(dǎo)分化。

在加入了維甲酸(NA)后，ES細胞獲得了向某一特定方向誘導(dǎo)分化的趨勢。

加入了誘導(dǎo)劑后第1天細胞的形態(tài)發(fā)生改變，有產(chǎn)生區(qū)域化模式的趨勢，但不是十分清晰。

加入了誘導(dǎo)劑后3天，細胞的形態(tài)發(fā)生很大的改變，同時有細胞出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。區(qū)域化模式十分明顯，很清晰地看到了同一類型的細胞逐步靠攏。

3.2 豬iPS細胞以及小鼠ES細胞來源的神經(jīng)樣細胞的相關(guān)標志物的鑒定。

免疫熒光結(jié)果顯示誘導(dǎo)7d后的神經(jīng)球樣克隆表達NSCs標志物nestin，貼壁培養(yǎng)后的神經(jīng)球樣克隆表達神經(jīng)元標志物β-tubulin III和星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP。

小鼠：(a)單層神經(jīng)干細胞nestin陽性 (×100)

小鼠：(b)β-tubulin III陽性(×100)

小鼠：(c)GFAP陽性(×100)

豬：(d)單層神經(jīng)干細胞nestin陽性 (×100)

豬：(e)β-tubulin III陽性(×100)

豬：(f)GFAP陽性(×100)

4討論

誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)是一種新型的多能干細胞，具有類似于胚胎干細胞(ESCs)的特性。所以本實驗借鑒了胚胎干細胞(ESCs)向神經(jīng)干細胞(NSCs)誘導(dǎo)分化的方法。目前胚胎干細胞(ESCs)向神經(jīng)干細胞(NSCs)誘導(dǎo)分化方法主要有以下幾種: 維甲酸(RA)誘導(dǎo), PA6基質(zhì)細胞誘導(dǎo)，生長因子誘導(dǎo)，直接分化法。為何選擇維甲酸(RA)進行誘導(dǎo)時基于3個方面進行考慮：

(1)維甲酸(RA)作為一種傳統(tǒng)的分化誘導(dǎo)劑，它可誘導(dǎo)類胚體分化成多種細胞類型，其分化方向以及程度取決于維甲酸的劑量及作用階段。[10]

(2)生長因子誘導(dǎo)、PA6基質(zhì)細胞誘導(dǎo)這兩種方法涉及的誘導(dǎo)成分過于復(fù)雜，而且對于培養(yǎng)的要求也是極高的。

(3)直接分化法操作簡單，效率很高，是現(xiàn)在主流的分化方法。但是，缺少了擬胚體(EB)向神經(jīng)干細胞(NSCs)過渡這一步，不利于結(jié)果分析。[11]

實驗的過程中，豬的誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)在經(jīng)歷傳代培養(yǎng)、擬胚體(EB)的形成、維甲酸(RA)誘導(dǎo)分化以后，得到了懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)球。神經(jīng)球能夠表達NSCs標志物, 這說明豬的誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)已經(jīng)分化為NSCs。但是，對比小鼠的胚胎干細胞(ESCs)以及豬的誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)在分化過程中的區(qū)別還是十分明顯的。分化的第3d，我們在小鼠神經(jīng)樣細胞分化培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)貼壁生長的擬胚體(EB)中央出現(xiàn)特有的環(huán)狀空腔結(jié)構(gòu),我們推測是神經(jīng)祖細胞特有的環(huán)狀rosette空腔結(jié)構(gòu)，一種類似于早期的神經(jīng)管結(jié)構(gòu)。[12]但是，豬的胚胎干細胞(ESCs)卻沒有出現(xiàn)這種rosette空腔結(jié)構(gòu)。

雖然我們最終得到了神經(jīng)干細胞(NSCs)，但是我們并沒有檢測分化最終的效率，這是實驗的一個遺憾之處。如果要進行更加深入的實驗，我們有必要對于這種分化方法的效率進行探索?，F(xiàn)在主流的檢測分化效率的方法：RNA的分離和定量PCR分析——首先使用RNeasy Mini Kit這種提取試劑盒去實現(xiàn)對這個體系中所有細胞RNA的提取，再利用SuperScript III第一鏈合成系統(tǒng)進行逆轉(zhuǎn)錄得到細胞的互補DNA(cDNA)。在完成這些準備工作后，我們再利用SYBR Green mix對cDNA進行染色，最終可以利用Roche LightCycler 5480等儀器進行數(shù)據(jù)分析。[13]

經(jīng)過以上的研究表明，通過誘導(dǎo)分化傳統(tǒng)的方法即通過擬胚體的形成并添加RA進行誘導(dǎo)，的確可以使得豬的誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)形成神經(jīng)干細胞(NSCs)。但是，這得到的僅僅是初步的結(jié)果，至于得到的神經(jīng)干細胞(NSCs)是否具有終末分化能力、是否有成瘤性、能否發(fā)揮相應(yīng)的功能等, 都需要進一步深入研究。

5展望

隨著iPS細胞技術(shù)的發(fā)展，人們逐步建立起了家畜類動物的iPS細胞系，如豬、綿羊。對于家畜類動物而言，iPS細胞技術(shù)的出現(xiàn)為這些很難建立ES細胞系的物種建立多能干細胞系帶來了希望。因為家畜類動物ES細胞系長期培養(yǎng)后易出現(xiàn)分化現(xiàn)象，所以建立的ES細胞系難度大。如果成功建立家畜iPS細胞系，利用其獨特的優(yōu)勢，將iPS細胞誘導(dǎo)技術(shù)與相關(guān)技術(shù)相結(jié)合，如嵌合體技術(shù)，在家畜動物的異種器官移植、品種改良以及人源性疾病動物模型的制作[14]等方面都具有廣闊的開發(fā)前景。

雖然部分家畜類動物的iPS細胞系得到了建立，但是依舊存在很多不足。由于iPS細胞是通過體外重新編碼形成的，即使豬作為最早建立iPS細胞系的家畜類動物，依舊很難確定重新編碼的基因是否繼續(xù)表達從而能使得細胞定向分化的過程變得復(fù)雜化。比如豬ID6細胞系[15]已被用于產(chǎn)生視網(wǎng)膜前體細胞，可以用來恢復(fù)視網(wǎng)膜的能力。[16]但是通過使用誘導(dǎo)人類ES細胞系的方法，在驅(qū)動豬ID6細胞系定向分化的過程中很難出現(xiàn)內(nèi)胚層或中胚層細胞。這與各大實驗室得到的結(jié)論：由iPSC形成的擬胚體中必定存在這樣的結(jié)構(gòu)，相違背。[17]

實驗表明,通過在神經(jīng)退行性疾病動物模型中移植神經(jīng)干細胞(NSCs),神經(jīng)干細胞(NSCs)可以通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子(Neurotrophin，NT)，如神經(jīng)生長因子(Nerve Growth Factor, NGF)、腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)等，保護神經(jīng)元并引起神經(jīng)再生效應(yīng)。[18]Parkinson可見神經(jīng)干細胞(NSCs)在臨床治療方面具有很大的開發(fā)價值。隨著iPS細胞技術(shù)的發(fā)展，誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)定向誘導(dǎo)分化成神經(jīng)干細胞(NSCs)必將成為神經(jīng)干細胞(NSCs)的主要來源。

2014年，一名罹患退行性眼病的日本患者成為全球使用誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)進行治療的第一人，[19]這意味著通過iPS技術(shù)所代表的克隆技術(shù)治療人類疾病的設(shè)想將首次付諸實踐。雖然還需要后續(xù)的研究，才能確定這一實踐的最終效果，但是不可否認這是一步很大的跨越，為干細胞療法的臨床實踐打開了一個新的篇章。由于iPS細胞系的建立方式以及遺傳穩(wěn)定性依然存在著很多不確定性的因素，iPS細胞技術(shù)還需要更深入研究和探索。

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Inducing Porcine iPS Cells into Neural Stem Cellsinvitro

Zhang Ding，Zhang Xiaoshan，Wang Yi

(School of Biological Sciences, China Agriculture University, Beijing 10094, China)

Abstract：The major objective of our study is to induce porcine iPS cells into neural stem cells in vitro. During the whole process of experimental exploration, we induced porcine iPS cells into neural stem cells by using a traditional method: inducing embryoid body(EB) into neural stem cells by adding Retinoic acid(RA) in vitro. Porcine iPSCs underwnet subculture、embryoid body(EB)、inducing differentiation three important stages to form another kind of cells.Finally，we validated the newly formed cell is neural stem cells by using immunofluorescence assay to detect the neural stem cell specific marker Nestin、the neuronal marker β- tubulin III and glial cell marker GFAP in the new formed cell. As a result, porcine iPSCs induced by this traditional method can successfully induced into neural stem cells and express nestin.

Key words：pig；iPS cells；neural stem cells(NSCs)；induceinvitro

Class No.:Q28Document Mark：A

(責(zé)任編輯：宋瑞斌)