miRNA-132通過靶向調(diào)控Bmi-1表達(dá)影響鼻咽癌細(xì)胞對放射治療敏感性

作者單位：529031 江門，廣東省江門市中心醫(yī)院 中山大學(xué)附屬江門醫(yī)院腫瘤科(譚潔媚，李明毅)；510000 廣州，中山大學(xué)腫瘤防治中心內(nèi)科(梁穎)

miRNA-132通過靶向調(diào)控Bmi-1表達(dá)影響鼻咽癌細(xì)胞對放射治療敏感性

譚潔媚李明毅梁穎

【摘要】目的研究miRNA-132對鼻咽癌細(xì)胞放射治療敏感性的影響。方法使用miRNA芯片技術(shù)，對比5-8F(親代細(xì)胞)和5-8F/R(放射治療抵抗細(xì)胞)中miRNA表達(dá)水平差異，從中挑選差異最為明顯的miRNA-132作后續(xù)研究。使用流式細(xì)胞儀檢測miRNA-132對細(xì)胞凋亡的影響。使用雙熒光報告素酶、蛋白免疫印跡法等方式驗(yàn)證miRNA-132的下游靶基因。結(jié)果miRNA-132可以促進(jìn)鼻咽癌5-8F/R細(xì)胞的凋亡，提高其對放射治療的敏感性，還可以抑制其體內(nèi)的生長能力。miRNA-132可以抑制Bmi-1信使RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)論miRNA-132可通過抑制下游靶基因Bmi-1來發(fā)揮其放射治療增敏功能。

【關(guān)鍵詞】miRNA-132；Bmi-1；鼻咽癌；放射治療增敏

DOI:10.3969/g.issn.0253-9802.2015.07.003

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of miRNA-132 on the sensitivity of nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells to radiotherapy. MethodsThe expression levels of miRNAs were compared between 5-8F parental cells and 5-8F/R radioresistant cells using a miRNA array; miRNA-132, which showed the most prominent changes between the two cell lines, was chosen for further study. The effect of miRNA-132 on apoptosis was examined using flow cytometry. A dual-luciferase reporter assay and western blotting were employed for the identification and verification of the downstream targets of miRNA-132. ResultsmiRNA-132 promoted apoptosis, enhanced radiosensitivity in 5-8F/R cells and inhibited the in vivo growth of 5-8F/R cells. In addition, miRNA-132 suppressed Bmi-1 expression at both the mRNA and protein levels. ConclusionmiRNA-132 enhanced the radiosensitivity of NPC cells via negative regulation of its downstream target Bmi-1.

收稿日期：(2015-01-06)

miRNA-132 affects the sensitivity of nasopharyngeal carcinoma cells to radiotherapy via targeted regulation of Bmi-1 expressionTanJiemei，LiMingyi,LiangYing.DepartmentofOncology,JiangmenHospitalofSunYat-senUniversity,Jiangmen529031,China

【Key words】miRNA-132；Bmi-1；Nasopharyngeal carcinoma；Radiosensitization

鼻咽癌是中國南方最主要的惡性腫瘤之一。目前，放射治療是鼻咽癌公認(rèn)的治療首選方式，但約55%的鼻咽癌在放射治療后5年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致治療失敗[1-2]。導(dǎo)致鼻咽癌對放射治療產(chǎn)生抵抗的原因很多，主要有癌基因的異常表達(dá)，腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性，相關(guān)信號通路的異常等[3-5]。近年來，越來越多的證據(jù)表明，miRNA不僅參與了正常組織的分化、發(fā)育，還參與了腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。同時，miRNA的異常表達(dá)還與腫瘤細(xì)胞對放射治療、化學(xué)治療產(chǎn)生抵抗密切相關(guān)[6-7]。有文獻(xiàn)表明，miRNA的異常表達(dá)常導(dǎo)致鼻咽癌對放射治療產(chǎn)生抵抗，這也是鼻咽癌患者復(fù)發(fā)的重要原因[8-10]。 本研究擬探索miRNA-132對鼻咽癌細(xì)胞放射治療敏感性的影響及其分子機(jī)制。

材料與方法

一、耐放射治療細(xì)胞株的構(gòu)建以及細(xì)胞培養(yǎng)

選取X射線對原代鼻咽癌細(xì)胞株5-8F進(jìn)行間歇性大劑量射線照射(每次4 Gy,共15次,總量60 Gy)，每次照射后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，待3～4周存活的細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長期后進(jìn)行下一次照射，整個照射及培養(yǎng)過程歷時6個月。培養(yǎng)所得的放射治療抗性細(xì)胞分別命名為5-8F/R。所有細(xì)胞株皆使用含10% 胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

二、實(shí)時熒光定量PCR及蛋白免疫印跡法試驗(yàn)

提取細(xì)胞RNA使用Trizol試劑法(Invitrogen公司)。miRNA-132的逆轉(zhuǎn)錄以及實(shí)時熒光定量PCR的試劑盒(qSYBR-green-containing PCR kit)均購自上海吉凱。提取細(xì)胞蛋白質(zhì)后，使用蛋白免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)水平。Bmi-1以及GAPDH抗體購自Santa Cruz公司。二抗購自中杉金橋。ECL顯色發(fā)光試劑盒購自康維世紀(jì)。

三、細(xì)胞凋亡試驗(yàn)

檢測細(xì)胞凋亡試劑盒(FITC-PI雙染色)購自凱基公司。細(xì)胞染色后，使用流式細(xì)胞儀檢測相關(guān)凋亡情況。

四、miRNA-132轉(zhuǎn)染細(xì)胞以及熒光素報告酶分析

miRNA-132 mimics以及miRNA control均購自廣州銳博公司。轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000購自Gibco公司。使用PCR把Bmi-1的全長3′-UTR擴(kuò)增之后，將其克隆入pGL3載體(Promega公司)中熒光素基因的下游。這個載體命名為wt-3′-UTR(野生型3′-UTR)。使用Quick change site-directed mutagenesis kit(Stratagene, Cedar Creek, USA)試劑盒對Bmi-1與miRNA-132的結(jié)合區(qū)域進(jìn)行突變，突變后的3′-UTR克隆入pGL3載體，將載體命名為mt-3′-UTR(突變型3′-UTR)。將miRNA-132 mimics，miRNA control和wt-3′-UTR、mt-3′-UTR分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)測量熒光素值。

五、 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)

將裸鼠隨機(jī)分成4組，每組5只。將1×106個細(xì)胞接種于裸鼠皮下，接種后5 d，按以下方式處理：第1組為空白對照組，第2組為單純放射治療組，第3組為miRNA-132過表達(dá)組，第4組為放射治療+miRNA-132過表達(dá)組。腫瘤體積每3 d監(jiān)測1次。腫瘤體積使用V=π/6(高度×長度×寬度)公式計算。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果

一、miRNA-132在放射治療抗性的鼻咽癌細(xì)胞株中表達(dá)水平下降

首先，我們通過miRNA芯片技術(shù)，對比了親代以及放射治療抵抗細(xì)胞株中miRNA表達(dá)水平的差異。芯片結(jié)果提示，較親代細(xì)胞相比，5-8F/R細(xì)胞株放射治療抗性細(xì)胞中miRNA-132的表達(dá)水平顯著降低(圖1A)。實(shí)時定量PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了miRNA芯片的結(jié)果(圖1B,t=6.8,P<0.05)。

圖1　放射治療抵抗細(xì)胞株中miRNA表達(dá)水平差異

A： 5-8F/R和5-8F細(xì)胞株中部分miRNA表達(dá)水平差異；B：q-RTPCR驗(yàn)證5-8F/R與5-8F細(xì)胞中 miRNA-132表達(dá)水平差異;*P<0.05

二、過表達(dá)miRNA-132后可提高鼻咽癌細(xì)胞株對放射治療的敏感性

我們使用miRNA control以及miRNA-132 mimics分別轉(zhuǎn)染5-8F/R細(xì)胞株，然后對比轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞對放射治療敏感程度的差異。凋亡試驗(yàn)結(jié)果提示，3種處理組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=18.36，P<0.05)。對2組之間差異分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miRNA-132可以促進(jìn)5-8F/R細(xì)胞的凋亡(圖2A,t=9.38,P<0.05)。MTT試驗(yàn)結(jié)果表明，和miRNA control(空白對照組)相比，轉(zhuǎn)染miRNA-132 mimics之后，5-8F/R細(xì)胞對放射治療的敏感性提高了(圖2B，t=11.28,P<0.05)。

圖2過表達(dá)miRNA-132后5-8F/R細(xì)胞凋亡率及對放射治療敏感性的變化

A：3種不同處理方式之間，5-8F/R細(xì)胞的凋亡率差異；B：3種不同處理方式之間，5-8F/R細(xì)胞對放射治療的敏感性差異

三、miRNA-132靶向調(diào)控Bmi-1的表達(dá)水平

使用Targetscan、miRNAanda等預(yù)測軟件，我們發(fā)現(xiàn)Bmi-1可能是miRNA-132的靶基因之一。Bmi-1mRNA 3′端非翻譯區(qū)(3′-UTR)包含有與miRNA-132種子區(qū)域互補(bǔ)配對的位點(diǎn)(圖3A)。為了確認(rèn)Bmi-1是miRNA-132直接靶標(biāo)，我們將Bmi-1的全長3′-UTR克隆入熒光素酶報告載體上面。然后用miRNA-132 mimics和含Bmi-1全長3′-UTR的質(zhì)粒載體共同轉(zhuǎn)染5-8F/R細(xì)胞。結(jié)果表明，與空白對照組相比，miRNA-132可以抑制Bmi-1的熒光素活性(圖3B，t=8.93,P<0.05)。實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示，與空載對照組相比，過表達(dá)miRNA -132后，Bmi-1的mRNA表達(dá)水平顯著下降(圖3C，t=10.93,P<0.05)。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，過表達(dá)miRNA-132可使Bmi-1的蛋白表達(dá)水平下降(圖3D)。

四、裸鼠體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證miRNA-132放射治療增敏作用

最后，我們使用裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA-132的放射治療增敏作用。通過對比4種處理方式之間成瘤能力的差異，我們發(fā)現(xiàn)，4組不同處理方式之間存在統(tǒng)計學(xué)差異(圖4A、B，χ2=9.87,P<0.05)。進(jìn)一步對不同處理組之間比較發(fā)現(xiàn)，放射治療聯(lián)合miRNA-132共同作用組較空白組(t=13.56,P<0.05)、miRNA-132單獨(dú)作用組(t=10.36,P<0.05)、放射治療單獨(dú)作用組(t=7.36,P<0.05)抑瘤效果更加明顯。

圖3　Bmi-1為miRNA-132的直接靶基因

A：miRNA-132與Bmi-1基因的3′-UTR結(jié)合位點(diǎn)。WT：野生型；MT：突變型；B：miRNA-132 mimics對Bmi-1野生型的熒光素酶活性的影響；C：miRNA-132對Bmi-1的mRNA表達(dá)水平的影響；D：過表達(dá)miRNA-132后抑制Bmi-1的蛋白表達(dá)水平

討論

鼻咽癌是東南亞，尤其是中國南方常見的一種頭頸部腫瘤。放射治療是鼻咽癌常規(guī)的重要治療方式，但是臨床治療中發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者對傳統(tǒng)的放射、化學(xué)治療相對不敏感，這也是鼻咽癌患者5年生存率不高的原因之一[11]。

miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，它們在動植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。而近期的研究表明，miRNA可參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并且調(diào)控著腫瘤細(xì)胞對放射治療、化學(xué)治療等治療方式的敏感性。miRNA-132普遍被認(rèn)為是一個可以抑制腫瘤進(jìn)展的miRNA。在胰腺癌里面，miRNA-132的啟動子發(fā)生甲基化，使其表達(dá)水平下降。而過表達(dá)miRNA-132之后，可以抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲水平[12]。在乳腺癌組織和細(xì)胞株中，miRNA-132的表達(dá)水平普遍下降。通過恢復(fù)其表達(dá)水平之后可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷徙和侵襲的能力[13]。在本研究中，我們通過對比親代和放射治療抵抗的鼻咽癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)在放射治療抵抗的鼻咽癌細(xì)胞株中，miRNA-132的表達(dá)水平是下降的。過表達(dá)miRNA-132之后，可以提高放射治療抵抗細(xì)胞對放射治療的敏感性。

圖4放射治療與miRNA-132聯(lián)合

作用明顯縮小腫瘤體積及生長速度

A：不同處理組之間，裸鼠皮下腫瘤生長體積的大小差異；B：不同處理組之間，裸鼠皮下腫瘤生長速度的差異

對miRNA-132放射治療增敏的分子機(jī)制進(jìn)一步分析之后，發(fā)現(xiàn)miRNA-132是通過調(diào)控Bmi-1表達(dá)水平來發(fā)揮其生物學(xué)功能的。Bmi-1基因是PcG家族中的核心成員之一，對胚胎期哺乳動物骨骼、造血及神經(jīng)的發(fā)育發(fā)揮重要作用。在腫瘤細(xì)胞中，Bmi-1呈高度表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、預(yù)后等病理指標(biāo)相關(guān)[14]。而近期研究表明，Bmi-1與放射治療抗性密切相關(guān)。例如，Bmi-1可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7發(fā)生放射治療抵抗性[15]。而在鼻咽癌細(xì)胞中，敲除Bmi-1之后，鼻咽癌細(xì)胞可恢復(fù)對放射治療的敏感性[16]。這些研究都充分表明，Bmi-1介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的放射治療抵抗性。本研究通過雙熒光素酶報告分析、蛋白免疫印跡法等實(shí)驗(yàn)方法，從多個層面驗(yàn)證了Bmi-1是miRNA-132的下游靶基因。過表達(dá)miRNA-132之后，可抑制Bmi-1的表達(dá)，從而發(fā)揮其放射治療增敏的作用。

綜上所述， miRNA-132調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞對放射治療的敏感性。當(dāng)然，miRNA調(diào)控腫瘤細(xì)胞放射治療敏感性的分子機(jī)理是較為復(fù)雜的，需進(jìn)一步的研究。

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(本文編輯：楊江瑜)

臨床研究論著