鹽脅迫下黑果枸杞未萌發(fā)種子活力探究

羅佳佳， 田 濤， 周 程

（蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 甘肅 蘭州730000）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）是茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium）多年生耐鹽、抗旱落葉灌木，生長(zhǎng)于鹽堿地、沙地、戈壁、路邊等，具有強(qiáng)抗逆性，耐干旱、鹽堿、寒冷的生物學(xué)特征，是改良荒漠化土壤、防風(fēng)固沙、保持水土的優(yōu)良植物，具有很高的生態(tài)學(xué)價(jià)值，是世界上三大堿性土壤指示植物和先鋒植物之一［1］，枸杞在多地區(qū)已經(jīng)進(jìn)行育苗實(shí)驗(yàn)［2－4］，在中國(guó)的人工種植面積也在逐漸擴(kuò)大［5］。黑果枸杞是我國(guó)西北荒漠特有的、亟待開發(fā)的野生植物，是鹽漬荒漠植被群落中的優(yōu)勢(shì)種，具有非常突出的地位和作用，但它屬于有性種群，幼苗稀少，其種群已趨于衰?。?］，由于人為過(guò)度破壞導(dǎo)致整個(gè)生態(tài)環(huán)境日趨惡化，黑果枸杞資源銳減，資源瀕臨枯竭，此外，黑果枸杞是枸杞資源中的研究熱點(diǎn)［7］，其應(yīng)用價(jià)值較大?；诤诠坭降母邞?yīng)用價(jià)值和瀕臨滅絕的現(xiàn)狀，對(duì)黑果枸杞進(jìn)行了多方面的研究，主要集中在種子萌發(fā)、葉片的解剖結(jié)構(gòu)、營(yíng)養(yǎng)成分和微量元素、組織培養(yǎng)、多糖的提取、色素等方面［8－9］，其中種子萌發(fā)的研究占了很大比重，但這些研究的關(guān)鍵問(wèn)題是在實(shí)驗(yàn)室黑果枸杞種子萌發(fā)困難。黑果枸杞種子萌發(fā)較難［10］，但有大量研究報(bào)道了解除種子休眠的方式［11－12］。參考大量報(bào)道后實(shí)驗(yàn)室用不同濃度GA3、濃H2SO4、NaOH及不同溫度水浴等不同時(shí)間浸種預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)濃H2SO4和植物激素是處理硬實(shí)種子最好的方法，這與許多其它研究的結(jié)果一致，例如：陳?？蛣⒖吮雽?duì)黑果枸杞種子的處理［13，10］以及其他硬實(shí)種子敖漢苜蓿［14］、長(zhǎng)萼雞眼草［15］、雞峰黃芪［16］、白三葉草［17］等的處理。但濃 H2SO4對(duì)種子容易造成酸害，且本實(shí)驗(yàn)中100mg／L的GA3浸種6h與濃H2SO4的效果相當(dāng)，故實(shí)驗(yàn)選擇前者進(jìn)行種子預(yù)處理。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間未萌發(fā)的種子表面光鮮、形態(tài)圓滑，水分吸收充足顯得飽滿，無(wú)腐爛、發(fā)霉等現(xiàn)象。目前，鹽脅迫對(duì)種子萌發(fā)［18－21］以及幼苗生理影響［22－25］的研究已經(jīng)很成熟。楊志江等的研究表明，NaHCO3和Na2CO3溶液及其造成的堿性環(huán)境對(duì)黑果枸杞種子的毒害比Na＋?。?6］，在NaCl中Cl－對(duì)種子也有毒害影響［27］，但對(duì)于未萌發(fā)種子活力情況的研究在國(guó)內(nèi)外均未曾報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)黑果枸杞種子進(jìn)行不同濃度的NaCl協(xié)迫，研究了Na＋和Cl－同時(shí)作用對(duì)黑果枸杞種子的影響，測(cè)定萌發(fā)率，及未萌發(fā)種子活力指標(biāo)，推究種子難萌發(fā)的原因，為解決種子不萌發(fā)難題找到突破口，為黑果枸杞的研究奠定基礎(chǔ)，為西北地區(qū)鹽漬土改良及鹽地藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)［28］，更有助于發(fā)揮黑果枸杞在防風(fēng)固沙中的先鋒作用，增加沙漠地區(qū)動(dòng)植物多樣性，維持生態(tài)平衡。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)選用采自甘肅民勤且干藏1年的黑果枸杞種子作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

種子篩選。種子采用水選法，剔除不飽滿的種子以及雜物，使種子均一，做到單一變量原則。將種子浸沒(méi)于100mg／L的GA3溶液中處理6h。浸種處理后的種子在超凈臺(tái)用自來(lái)水洗滌3～5次，后用雙蒸水洗滌2次，再用0.1%HgCl2溶液消毒處理10～15min，無(wú)菌水洗滌3～5次。

不同濃度培養(yǎng)基制備與處理。實(shí)驗(yàn)采用半固體瓊脂培養(yǎng)皿發(fā)芽法，運(yùn)用分析純的NaCl試劑配制瓊脂半固體培養(yǎng)基作為支持介質(zhì)，其濃度分別為0，50，100，150，200，250mmol／L，用120℃高溫滅菌配制。將消毒后的黑果枸杞種子均勻接種于培養(yǎng)基中，使種子半陷入培養(yǎng)基，以確保種子能吸收到充足的水分，每個(gè)培養(yǎng)皿種子50粒，各處理3次重復(fù)。將培養(yǎng)皿置于26℃、濕度適宜的培養(yǎng)箱中，并黑暗處理使種子萌發(fā)。每天觀察并記錄萌發(fā)情況，至連續(xù)5d以上無(wú)新的種子萌發(fā)時(shí)，表明萌發(fā)結(jié)束。結(jié)束萌發(fā)后，觀察并記錄未萌發(fā)種子的形態(tài)表現(xiàn)，后將未萌發(fā)的種子挑出，用蒸餾水洗滌3～5次，室溫晾24h以上使其充分干燥，測(cè)定其浸出液電導(dǎo)率和紫外吸光值。稱取各處理下黑果枸杞種子0.3g左右，以未經(jīng)鹽處理且具有活力的干種子作為對(duì)照，經(jīng)蒸餾水洗干凈后吸干，置于盛有10mL蒸餾水的試管中，室溫下浸泡，每隔3h用DDS－11A型電導(dǎo)儀測(cè)定種子不同浸泡時(shí)間的浸出液電導(dǎo)率［29］，同時(shí)每隔6h測(cè)定浸出液的紫外吸光值OD260［30］，以上測(cè)定均3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用 Excel、SPSS 19.0等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及處理，采用LSD法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果枸杞種子萌發(fā)率的測(cè)定結(jié)果

各濃度鹽脅迫下黑果枸杞種子萌發(fā)率均較低，且萌發(fā)趨勢(shì)未呈現(xiàn)規(guī)律性變化。由圖1可知，與對(duì)照（未經(jīng)NaCl處理）相比，NaCl濃度為100mmol／L的鹽脅迫下，種子萌發(fā)率最高，且種子萌發(fā)鹽度耐受范圍為0～150mmol／L。

圖1 100mg／L GA3 預(yù)處理下不同濃度 NaCl（mmol／L）脅迫黑果枸杞種子的萌發(fā)率

由圖2可知，黑果枸杞種子發(fā)芽率低，平均每天發(fā)芽種子數(shù)不足1粒。對(duì)照的種子萌發(fā)率最高，達(dá)到0.740 7粒／d，但仍未達(dá)到1粒／d，而其它鹽濃度處理下的種子萌發(fā)率則更低。這可能是種子萌發(fā)各外在條件未達(dá)到最適宜，種子不太適應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件，種子自身活力不太高，鹽脅迫造成抑制等因素綜合所致，具體原因有待進(jìn)一步探究。

圖2 100mg／L GA3 預(yù)處理下不同濃度 NaCl（mmol／L）脅迫黑果枸杞種子的平均每天發(fā)芽種子數(shù)

由圖3可知，在無(wú)菌寡營(yíng)養(yǎng)半固體培養(yǎng)基上，黑果枸杞種子萌發(fā)情況較差，但萌發(fā)后的種子長(zhǎng)勢(shì)較好，幼苗健壯。在黑暗條件以及無(wú)營(yíng)養(yǎng)元素的支持介質(zhì)上，萌發(fā)后的幼苗還能健康生長(zhǎng)，這充分說(shuō)明了黑果枸杞具有強(qiáng)抗逆性，所以黑果枸杞能突破萌發(fā)這一關(guān)，那么幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育就相對(duì)容易。經(jīng)觀察，培養(yǎng)30d后未萌發(fā)的種子形態(tài)渾圓，表面光滑且有光澤，水分吸收充足而顯得飽滿，種子顏色仍為深棕色，無(wú)腐爛、發(fā)霉等現(xiàn)象，可以推測(cè)種子可能仍具活力，未死亡。

2.2 不同鹽濃度處理下未萌發(fā)種子活力鑒定

2.2.1 未萌發(fā)種子不同浸泡時(shí)間的浸出液電導(dǎo)率

由圖4可知，100mg／L GA3預(yù)處理后各梯度NaCl濃度脅迫下未萌發(fā)種子浸出液的電導(dǎo)率之間呈顯著性差異，但電導(dǎo)率并沒(méi)有隨著鹽濃度的升高而呈上升趨勢(shì)，相反在NaCl濃度為200mmol／L時(shí)，未萌發(fā)種子浸出液電導(dǎo)率最低，且它與對(duì)照（干種子）的電導(dǎo)率相比差異不顯著（p＞0.05）。NaCl濃度為250 mmol／L時(shí)，未萌發(fā)種子電導(dǎo)率最高，與對(duì)照電導(dǎo)率差異顯著（p＜0.05）。與對(duì)照電導(dǎo)率相比，NaCl濃度為0，150，200mmol／L的脅迫下，未萌發(fā)種子電導(dǎo)率差異不顯著（p＞0.05），NaCl濃度為50，100，250mmol／L的脅迫下，未萌發(fā)種子電導(dǎo)率差異顯著（p＜0.05）且電導(dǎo)率均較大，這些差異顯著與否沒(méi)有規(guī)律，沒(méi)有統(tǒng)一的趨勢(shì)。依據(jù)對(duì)比推測(cè)，NaCl濃度為0，150，200 mmol／L的脅迫處理下培養(yǎng)30d未萌發(fā)的種子仍有活力，有萌發(fā)的潛能，但其未能萌發(fā)的原因是多方面的，要從種子自身?xiàng)l件和培養(yǎng)條件綜合分析。

圖3 100mg／L GA3預(yù)處理下不同濃度NaCl（mmol／L）脅迫黑果枸杞種子萌發(fā)情況

圖4 100mg／L GA3預(yù)處理接種30d后各處理下未萌發(fā)種子浸出液平均電導(dǎo)率［mS／（cm·g）］

2.2.2 未萌發(fā)種子浸出液紫外吸光值OD260的測(cè)定結(jié)果

由圖5可知，100mg／L GA3預(yù)處理接種30d后各處理下未萌發(fā)種子在浸泡時(shí)間為6h時(shí)，浸出液的OD260均為0，在浸泡12h時(shí)對(duì)照（干種子）和NaCl濃度為0mmol／L脅迫下，未萌發(fā)種子的OD260仍為0，而在18h時(shí)NaCl濃度為0mmol／L脅迫下，未萌發(fā)種子的OD260也為0，這表明是測(cè)量的系統(tǒng)誤差，應(yīng)忽略不計(jì)，不予討論。浸出液OD260隨時(shí)間出現(xiàn)遞增趨勢(shì)，在浸泡12h時(shí)，NaCl濃度為50，250mmol／L脅迫下，未萌發(fā)種子的OD260最高，彼此之間差異不顯著（p＞0.05）；NaCl濃度為100，150，200mmol／L脅迫下，未萌發(fā)種子的OD260最低，彼此之間差異不顯著（p＞0.05）。同樣，表明OD260未隨鹽濃度呈現(xiàn)某種趨勢(shì)性變化，無(wú)規(guī)律。在浸泡18h時(shí)，各處理下未萌發(fā)種子的OD260在數(shù)值上彼此之間差異不顯著（p＞0.05）。

圖5 100mg／L GA3預(yù)處理接種30d后各處理下未萌發(fā)種子浸出液OD260

3 討論與結(jié)論

鹽脅迫下種子的發(fā)芽情況是評(píng)價(jià)植物耐鹽性的一個(gè)重要標(biāo)志［31］。GA3能夠解除種子休眠，促使種子萌發(fā)［32］，故本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用預(yù)實(shí)驗(yàn)探究到的最佳濃度為100 mg／L的GA3對(duì)種子進(jìn)行浸種預(yù)處理，希望能夠提高種子的萌發(fā)率。在不同濃度NaCl脅迫中，黑果枸杞種子萌發(fā)率總體偏低，平均每天種子萌發(fā)數(shù)不到1粒（圖2），但不同種枸杞的發(fā)芽特性不同，其中黑果枸杞萌發(fā)率最低［33］，表明黑果枸杞本身具有萌發(fā)局限性；整體比較，低濃度NaCl對(duì)黑果枸杞種子萌發(fā)抑制作用較弱，且適宜低濃度鹽分（100mmol／L）對(duì)黑果枸杞種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用，但隨鹽濃度的增加，種子的萌發(fā)率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這與王桔紅等［31］、毛桂蓮等［34］的研究結(jié)果一致，說(shuō)明GA3對(duì)種子萌發(fā)的促進(jìn)作用未能很好的抵消阻礙黑果枸杞種子萌發(fā)的負(fù)因素。本實(shí)驗(yàn)表明，黑果枸杞種子最適萌發(fā)鹽濃度為100mmol／L，耐受鹽度為0～150mmol／L。而陳?？鹊难芯勘砻?，NaCl濃度在0.3%～0.4%之間黑果枸杞種子的萌發(fā)率最高，隨后隨鹽濃度的增加萌發(fā)數(shù)逐漸減少［35］。這可能是實(shí)驗(yàn)溫度、儀器、操縱人員等實(shí)驗(yàn)條件的不同造成了差異。

本實(shí)驗(yàn)萌發(fā)種子形成的幼苗在寡營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基以及黑暗環(huán)境條件下生長(zhǎng)健壯。王龍強(qiáng)等的研究也表明，寧夏枸杞和黑果枸杞在鹽脅迫下光合色素、脯氨酸和可溶性糖的含量均高于對(duì)照［36－37］，均表明黑果枸杞的強(qiáng)抗逆性。同時(shí)，觀察未萌發(fā)的黑果枸杞種子發(fā)現(xiàn)，種子圓潤(rùn)、飽滿且仍為深棕色，無(wú)腐爛、發(fā)霉等表現(xiàn)（圖3），故只要解決種子萌發(fā)的大難題，黑果枸杞在惡劣的環(huán)境中生長(zhǎng)發(fā)育就相對(duì)容易。介于黑果枸杞種子萌發(fā)不太理想，故準(zhǔn)確地研究實(shí)驗(yàn)未萌發(fā)種子存在活力與否便成必然。存活率、K＋／Na＋、丙二醛含量、脯氨酸含量是植物幼苗耐鹽性指標(biāo)篩選的通用指標(biāo)［38－40］，但這些指標(biāo)對(duì)種子均不實(shí)用，電導(dǎo)法和分光光度法是一種簡(jiǎn)便、快速、客觀的活力測(cè)定方法［30，41］，依據(jù)本實(shí)驗(yàn)對(duì)象（未萌發(fā)的種子）的情況，選擇電導(dǎo)率測(cè)定和紫外分光光度法法測(cè)定種子活力。本實(shí)驗(yàn)以干種子作對(duì)照，測(cè)得100mg／L GA3浸種預(yù)處理的種子在不同濃度NaCl脅迫培養(yǎng)下未萌發(fā)種子的電導(dǎo)率和OD260并不隨鹽濃度變化呈現(xiàn)規(guī)律性變化，反而在低鹽度處理下電導(dǎo)率和OD260出現(xiàn)較高的情況。由圖4可知，未萌發(fā)種子浸出液電導(dǎo)率先隨脅迫的NaCl濃度0～100mmol／L升高而升高，再隨濃度100～200 mmol／L升高而降低，最后隨濃度200～250mmol／L升高而升高，其中NaCl濃度為50～100mmol／L時(shí)，電導(dǎo)率較高，且與最高電導(dǎo)率和最低電導(dǎo)率差異顯著（p＜0.05）；NaCl濃度為150～200mmol／L時(shí)，電導(dǎo)率最低；NaCl濃度為250mmol／L時(shí)，電導(dǎo)率最高；由圖5可知，浸泡12h時(shí)，未萌發(fā)種子浸出液OD260隨NaCl濃度50～250mmol／L的升高呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。同時(shí)，OD260在 NaCl濃度為50～100mmol／L、150～200mmol／L、250mmol／L這3個(gè)階段其值與電導(dǎo)率呈現(xiàn)相同的規(guī)律；浸泡18h時(shí)，各OD260值在不同NaCl濃度脅迫下差異不顯著（p＞0.05）。

結(jié)合圖4和圖5的規(guī)律分析，可推測(cè)未萌發(fā)種子在較低NaCl濃度（50～100mmol／L）脅迫下活力較低；在中等 NaCl濃度（150～100mmol／L）脅迫下活力最高，且活力與干種子活力差異不顯著（p＞0.05）；在最高NaCl濃度（250mmol／L）脅迫下活力最低。表明黑果枸杞種子在耐受鹽度0～150mmol／L的脅迫下，長(zhǎng)時(shí)間未萌發(fā)的種子仍保持活力。

研究表明，鹽脅迫下脯氨酸和可溶性糖在根中的含量最高［37，42］，幼根在特定根段會(huì)迅速積累 Na＋和Cl－［43］。姜霞等的研究也表明，黑果枸杞根的耐鹽能力比莖和葉差［44］。在脅迫下，黑果枸杞種子根耐鹽性較差，生根困難，但種子仍保持活力，可能會(huì)等到適宜的條件再度萌發(fā)，這可能與其生存對(duì)策有關(guān)［45］。這種現(xiàn)象除與外界環(huán)境相關(guān)外，還與其遺傳因子相關(guān)［46］。不同枸杞種的抗逆性有差異，其所含種子蛋白也不同，具有特征蛋白質(zhì)［47］。所以下一步工作是對(duì)種子進(jìn)行抗逆蛋白、抗衰老因子等分子水平的研究，從根本上解決黑果枸杞種子難萌發(fā)的問(wèn)題。

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各類文獻(xiàn)規(guī)范數(shù)據(jù)選項(xiàng)表