四倍體矮稈小麥拔節(jié)期赤霉素合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)分析

胡召杉， 巫有霞，2， 楊在君， 王清海， 彭正松

（1.西華師范大學(xué)西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 四川 南充637009；2.西昌一中， 四川 西昌615000）

小麥（Triticvum aestivum）是主要的糧食作物之一。研究表明，株高這一農(nóng)藝學(xué)性狀能夠影響小麥的產(chǎn)量，同時(shí)，矮化植株抗倒伏能力更強(qiáng)［1］。小麥矮化育種和推廣利用獲得的成果顯示，小麥矮化育種主要與矮桿基因（Dwarfing gene）有關(guān)［2］。在小麥育種實(shí)踐中利用Rht（Reduced height）基因降低株高，有助于加大矮稈基因在小麥產(chǎn)量提高和品種遺傳改良方面的應(yīng)用。迄今，已鑒定并統(tǒng)一編號(hào)的矮稈基因有21個(gè)，從Rht 1到 Rht 20及 Rht 22。有人報(bào)道 Rht 21基因，后來(lái)被證實(shí)并不存在［3－4］。21個(gè)矮桿基因中天然產(chǎn)生的有8個(gè)，理化因素誘變的有13個(gè)。小麥中的Rht基因大部分源于六倍體，來(lái)自四倍體的只有7個(gè)，分別為Rht 14、Rht 15 、Rht 16、Rht 18、Rht 19、RhtB 1（IC 12196）和 Rht 22。在這7個(gè)基因中，Watanabe［5］報(bào)道了一個(gè)來(lái)源于自然變異的 Rht基因，即 Rht－B 1（IC 12196），它位于4B染色體上，但還沒(méi)證實(shí)它就是一個(gè)新基因；而Peng等［6］從矮桿番麥中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)控制其半矮桿性狀的新基因，即Rht 22［7］，該基因也來(lái)源于自然變異并被定位于7A染色體上。其余5個(gè)矮桿基因 Rht 14、Rht 15、Rht 16、Rht 18和 Rht 19都是通過(guò)輻照或化學(xué)誘變獲得［8］。Haque M 等［9］利用 Rht 14、Rht 16、Rht 18等矮稈基因構(gòu)建了硬粒小麥近等基因系。

赤霉素（gibberellin，GA）是一種重要的植物激素。赤霉素參與調(diào)節(jié)植物、真菌、細(xì)菌等的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，包括種子的萌發(fā)、根和莖的延伸、葉片的伸展等［10］。赤霉素缺陷型突變體通常表現(xiàn)出植株矮化等性狀［11］。GA 的合成過(guò)程十分復(fù)雜［12－13］，合成途徑中需要多種酶的參與，如古巴焦磷酸合成酶（CPS）、內(nèi)根－貝殼杉烯合成酶（KS）、內(nèi)根－貝殼杉烯19－氧化酶（KO）、內(nèi)根－貝殼杉烯酸7β羥化酶、GA－7－氧化酶（GA 7ox）、GA－13－羥化酶（GA 13ox）、GA 20－氧化酶（GA 20ox）和 GA 2－氧化酶（GA 2ox）等［14］；同時(shí)，14－3－3、RSG、GID 1、GA－MYB、GAI、GIP、XET 等多種調(diào)控基因也參與了GA的生物合成途徑［15］。

本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)GA合成途徑中的14種關(guān)鍵酶基因在四倍體矮桿小麥及其高桿對(duì)照品系中的時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行了分析，以期為小麥的矮化育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料選用四倍體（AABB）圓錐小麥地方品種矮稈番麥，硬粒小麥矮桿近等基因系A(chǔ)NW 16D、ANW 16F、ANW 16G，以高桿品種小麥LD為對(duì)照。

其中LD、ANW 16D、ANW 16F、ANW 16G由日本岐阜大學(xué)農(nóng)業(yè)學(xué)院N.Watanabe提供，矮稈番麥來(lái)自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所，由西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。在拔節(jié)期取穗下第一莖節(jié)節(jié)間部分于RNA保存液中并置于－70℃冰箱中保存待用。

1.2 引物合成

表1 各基因及內(nèi)參基因RT－PCR引物序列

根據(jù)赤霉素生物合成過(guò)程中涉及到的關(guān)鍵基因GA 20ox、CPS、GA 2ox、KAO、KO、KS、GA 3ox、GID 1、GA－MYB、XET、GIP、GAI、RSG、14－3－3和2個(gè)內(nèi)參基因Actin、GAPDH 的cDNA 序列，利用 Primer Express 3.0（Applied Biosystems）設(shè)計(jì)定量PCR的引物，引物序列及相關(guān)參數(shù)如表1所示，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 總RNA提取

總 RNA的提取按照EZgeneTM Plant Easy Spin RNA Miniprep Kit試劑盒（Biomega，R 6611），將所得RNA溶解在DEPC－treated ddH2O中。然后用1%瓊脂糖凝膠電泳和NANODROP 2 000c紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 cDNA的合成

以總RNA為模板，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript Perfect Real－Time RT Reagent Kit（TaKaRa）步驟反轉(zhuǎn)錄出cDNA鏈。80μL反應(yīng)體系：5×Primescript buffer 16μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 4μL，Oligo dT Primert 4μL，Random 6mers 4μL，模板RNA根據(jù)濃度計(jì)算，剩余用水補(bǔ)足80μL。反應(yīng)程序：37℃15min，85℃5s，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光定量檢測(cè) （Realtime－PCR）

根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因的反應(yīng)參數(shù)，按照SYBR Premix Ex Tap 試劑盒（TaKaRa，中國(guó)），對(duì)反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA進(jìn)行5倍梯度稀釋，進(jìn)行Real－time PCR反應(yīng)，繪制相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)5個(gè)小麥品種的總RNA 反 轉(zhuǎn) 錄 樣 品 于 Bio－RAD c 1 000TMThermal Cycler儀器上進(jìn)行SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，使用CFX 96TM系統(tǒng)對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行熒光采集。通過(guò)檢測(cè)其熒光值，繪制溶解曲線［16］。

2 結(jié)果與分析

GA合成途徑中的14個(gè)關(guān)鍵酶基因，除14－3－3和CPS未檢測(cè)到表達(dá)量外，其它12個(gè)基因在矮桿品種和高桿對(duì)照的拔節(jié)期節(jié)間均有不同程度的表達(dá)（圖1）。GA 2ox在ANW 16F中的表達(dá)量最高，其次是LD，而在 ANW 16D、ANW 16G和矮稈番麥中表達(dá)量較低（圖1a）。GA 3ox在 ANW 16D、ANW 16 F、LD以及矮稈番麥中表達(dá)量極低，僅為ANW 16F中 GA 3ox表達(dá)量的1／40（圖1b）；GA 20ox在LD中表達(dá)量最高，其次依次是ANW 16D、矮稈番麥，在ANW 16F和ANW 16G中表達(dá)量最低（圖1c）；GAI在ANW 16F的表達(dá)量最高，ANW 16G中次之，矮稈番麥中表達(dá)量?jī)H次于ANW 16G，LD和ANW 16D表達(dá)量最低（圖1d）；GA－MYB在LD中表達(dá)量最高，其次是 ANW 16G，僅為 LD 中表達(dá)量的一半，ANW 16D中表達(dá)量?jī)H次于ANW 16G，矮稈番麥中表達(dá)量則僅次于ANW 16D，ANW 16F表達(dá)量最低，僅為L(zhǎng)D的1／16（圖1e）；GID 1在 ANW 16F中的表達(dá)量最高，其次是ANW 16D，再次為ANW 16G、LD，矮稈番麥中的表達(dá)量最低，僅為ANW 16F中的1／6（圖1f）；KAO在 ANW 16F中表達(dá)量最高，其次是ANW 16G，剩余3種材料中表達(dá)量均較低，依次為L(zhǎng)D、ANW 16G、矮稈番麥，矮稈番麥中表達(dá)量?jī)H為ANW 16D中的1／11（圖1g）；KO在5種材料中的表達(dá)量與GID 1相似，在ANW 16F中的表達(dá)量最高，其次是ANW 16D、ANW 16G、LD，矮稈番麥中的表達(dá)量最低，僅為 ANW 16F中的1／4（圖1h）；RSG 在ANW 16F中的表達(dá)量最高，其次依次為ANW 16D、ANW 16G、矮 稈 番 麥、LD，LD 中 表 達(dá) 量 僅 為ANW 16F的1／9（圖1i）；XET在 ANW 16F中的表達(dá)量最高，其次為 LD、ANW 16G、矮 稈番麥、ANW 16D，ANW 16G與矮稈番麥中XET表達(dá)量相近，ANW 16D中的表達(dá)量最低（圖1j）；KS在 ANW 16D中表達(dá)量最高，ANW 16F和ANW 16G次之，ANW 16D中表達(dá)量大約是ANW 16F和ANW 16G表達(dá)量的一倍，在LD和矮稈番麥中幾乎沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)（圖1k）；GIP在ANW 16D的表達(dá)量最高，其次是矮稈番麥，LD、ANW 16F和 ANW 16G中的表達(dá)量相近且較低，僅為ANW 16D表達(dá)量的1／5（圖1l）。

GA 20ox和GA－MYB在矮稈小麥和高稈小麥中的表達(dá)模式相似，均是高稈小麥中的表達(dá)量高于其余4種矮稈小麥中的表達(dá)量。

3 討 論

小麥的株高主要通過(guò)莖的伸長(zhǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，而拔節(jié)期則是小麥長(zhǎng)高最關(guān)鍵的時(shí)期［17］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)4個(gè)矮桿小麥品系和高稈對(duì)照品系小麥拔節(jié)期節(jié)間部分各赤霉素關(guān)鍵酶基因的Real－time PCR檢測(cè)分析得出，CPS與14－3－3基因在5種小麥材料中均沒(méi)有表達(dá)。前體物質(zhì)GGPP合成GA的第一個(gè)階段，在柯巴焦磷酸合成酶的催化下，生成柯巴焦磷酸（ent－copalyl pyrophosphate，CPP）［18－19］。CPS可能為赤霉素合成途徑中前體物質(zhì)GGPP轉(zhuǎn)化為CPP的催化酶，是赤霉素合成途徑的最開(kāi)始階段，由于拔節(jié)期是一個(gè)時(shí)間段而不是一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在取材的這個(gè)時(shí)間點(diǎn)上CPS可能已經(jīng)完成了催化任務(wù)，因此檢測(cè)不到表達(dá)量。14－3－3是RSG的負(fù)調(diào)控因子，拔節(jié)期需要赤霉素促進(jìn)莖的伸長(zhǎng)，此時(shí)RSG的活性不應(yīng)該受到抑制，因此檢測(cè)不到表達(dá)量也是合理的。GA 20ox、GA 2ox、KAO、KO、KS、GA 3ox、GID 1、GA－MYB、XET、GIP、GAI、RSG在5種小麥材料中都有表達(dá)，其中GA 20ox和GA－MYB在高稈小麥和矮稈小麥中的表達(dá)模式相同，均是高稈小麥中的表達(dá)量略高于矮桿小麥。這與Zhang等［20］的研究結(jié)果類似，GA 20ox過(guò)表達(dá)的植物通常表現(xiàn)為節(jié)間伸長(zhǎng)的特征。在拔節(jié)期，具有生物活性的GA的量將影響小麥莖的伸長(zhǎng)程度，因而拔節(jié)期小麥內(nèi)源赤霉素缺失就會(huì)抑制小麥莖節(jié)間的伸長(zhǎng)［21］。高桿小麥和矮桿小麥株高差異的關(guān)鍵時(shí)期就在于拔節(jié)期，莖桿在該時(shí)期迅速伸長(zhǎng)，植株也迅速增高，該時(shí)期對(duì)GA的需求量可能是最大的。GA 20ox在矮稈中的表達(dá)量較高桿小麥中低，這可能導(dǎo)致矮桿小麥ANW 16D、ANW 16F、ANW 16G和矮稈番麥在拔節(jié)期因赤霉素量合成不足而影響了細(xì)胞的伸長(zhǎng)，最終導(dǎo)致 ANW 16D、ANW 16F、ANW 16G和矮稈番麥出現(xiàn)矮化性狀。此外，GA－MYB在高稈小麥中的表達(dá)量略高于矮桿小麥。Zhang等研究表明，GA－MYB是赤霉素合成途徑中一個(gè)重要的正向調(diào)節(jié)器，提高GA－MYB基因的表達(dá)量，可以提高赤霉素合成水平或赤霉素信號(hào)的靈敏度，使細(xì)胞伸長(zhǎng)，植株增高［20］。本實(shí)驗(yàn)中，GA－MYB的表達(dá)量在拔節(jié)期矮稈小麥ANW 16D、ANW 16F、ANW 16G和矮稈番麥較LD低，這可能導(dǎo)致在矮化小麥中赤霉素的合成途徑受阻或使其對(duì)赤霉素的信號(hào)靈敏度降低，從而導(dǎo)致ANW 16D、ANW 16F、ANW 16G和矮稈番麥的株高較LD矮小。

圖1 GA 2ox、GA 3ox、GA 20ox、GAI、GAMYB、GID 1、KAO、KO、RSG、XET、KS、GIP基因在不同小麥拔節(jié)期的表達(dá)情況

在小麥、水稻等禾本科作物中，莖的伸長(zhǎng)一般都是由細(xì)胞有絲分裂增加細(xì)胞數(shù)目以及使細(xì)胞伸長(zhǎng)增加細(xì)胞長(zhǎng)度兩方面作用的共同結(jié)果［22］。拔節(jié)期是小麥莖稈伸長(zhǎng)最迅速的時(shí)期，但在檢測(cè)到表達(dá)量的12個(gè)基因中只有2個(gè)基因在高稈小麥和矮稈小麥中差異性表達(dá)，但是這種差異并不大，不能夠認(rèn)定為拔節(jié)的原因。這與蔡鵬［23］對(duì)簇毛麥（Dasypyrum villosum）矮化突變體的研究結(jié)果一致。

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