寧波沿海陸源排污口藍(lán)藻(Cyanobacteria)和裸藻綱(Euglenoidea)生物的分布特點(diǎn)*

謝 利 王朝陽 張迪駿 周 君 司開學(xué) 張紅燕韓姣姣 崔晨茜 董麗莎 蘇秀榕①

(1. 國家海洋局北海環(huán)境監(jiān)測中心 青島 266033; 2. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波 315211)

藍(lán)藻(Cyanobacteria)又稱為藍(lán)細(xì)菌或藍(lán)綠藻,是一類進(jìn)化歷史悠久、革蘭氏染色陰性、無鞭毛、含葉綠素a(但不形成葉綠體)、能進(jìn)行產(chǎn)氧性光合作用的大型原核微生物。藍(lán)藻的分布廣泛, 從水生到陸生生態(tài)系統(tǒng), 從熱帶到南北極均有分布。藍(lán)藻是海洋生態(tài)系統(tǒng)和海洋初級生產(chǎn)力的重要組成部分(孫晟等, 2003; Paul, 2008)。藍(lán)藻結(jié)構(gòu)簡單, 細(xì)胞內(nèi)沒有真正的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)和色素體, 只有核質(zhì)和色素兩大部分。藍(lán)藻的繁殖方式有兩類, 一類為營養(yǎng)繁殖, 包括細(xì)胞直接分裂(即裂殖)、群體破裂和絲狀體產(chǎn)生藻殖段等幾種方法; 另一類為可產(chǎn)生內(nèi)生孢子或外生孢子等, 以進(jìn)行無性生殖。藍(lán)藻主要有微囊藻、螺旋藻、項圈藻、顫藻等, 其中微囊藻的危害最大(Asselman et al, 2014)。根據(jù)長期的觀測, 發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)情況下, 在特定湖區(qū)內(nèi), 這種突然“暴發(fā)”的水華是在適宜的氣象與水文條件下, 該湖區(qū)內(nèi)亦已存在的、懸浮于水體中的藍(lán)藻群體再加上其它湖區(qū)的水華藍(lán)藻, 隨著風(fēng)和湖流的驅(qū)動, 漂移到該湖區(qū)聚集上浮至水面, 并為人們?nèi)庋鬯姷倪^程(孔繁翔等, 2009; O’Neil et al, 2012)。藍(lán)藻作為河湖水華中的常見優(yōu)勢種群, 引起的藍(lán)藻事件是目前社會普遍關(guān)注的問題。藍(lán)藻水華的暴發(fā)是水體富營養(yǎng)化特征之一。藍(lán)藻通過產(chǎn)生毒素、死亡個體分解使水體缺氧和破壞正常的食物鏈威脅到飲用水安全、公眾健康和景觀, 會造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和社會問題(馬健榮等, 2013)。因此人們開始關(guān)注藍(lán)藻, 并取得一定的進(jìn)展。眼蟲門是一群鞭毛生物, 兼有葉綠素和眼點(diǎn), 兼有動物和植物的特性, 在植物學(xué)、藻類學(xué)中稱為“裸藻”, 而在原生動物學(xué)中稱為“眼蟲”, 因此眼蟲門也稱作裸藻門。眼蟲門主要有兩個綱: 裸藻綱和動質(zhì)體綱。在本次研究中的主要對象是裸藻綱,這類生物在水華和赤潮中也起一定的作用。

藻-菌關(guān)系一直是研究的熱點(diǎn)問題之一, 但目前主要集中在海洋、湖泊赤潮藻方面, 陸源排污口中的藍(lán)藻和裸藻綱生物未見報道。本文選取寧波沿海 10個主要的陸源排污口, 分別對排污口處和距排污口50m以外的 20個站位的水樣進(jìn)行分析, 對每個站點(diǎn)進(jìn)行總體和單獨(dú)分析, 研究藍(lán)藻和裸藻綱生物種類和分布特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取寧波沿海 10個陸源排污口和距離排污口50m以外的10個站位作為采樣位點(diǎn)(見圖1)。分別于2011年3月、5月、8月、10月進(jìn)行采集, 每次采集4L水樣。

圖1 采樣站位區(qū)域分布圖Fig.1 Map of sampling site

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取排污口的海水, 以0.22μm的微孔濾膜富集微生物, 利用試劑盒提取基因組DNA(美國Omega生物技術(shù)公司)。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 根據(jù)細(xì)菌16S rRNA的保守序列, 利用Primer Premier 5.0設(shè)計擴(kuò)增引物: 16S F(5’-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3’)和 16S R (5’-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG-3’)。

20μL 擴(kuò)增反應(yīng)體系: 10×buffer 2μL, MgCl22μL,dNTP 2μL, 上游引物和下游引物各 25μL, 0.2μL Taq DNA聚合酶和1μL DNA模版。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(Wang et al, 2014a, b)。

PCR擴(kuò)增條件: 94°C預(yù)變性4 min, 94°C變性30 s,退火溫度從65°C到55°C, 退火 30 s, 20個循環(huán); 72°C延伸 30 s, 94°C 變性 30 s, 55°C 退火 30 s, 72°C延伸30 s, 35個循環(huán); 最終72°C延伸10 min(劉兵等, 2009)。

1.2.3 測序與分析 將純化后的 PCR產(chǎn)物進(jìn)行454焦磷酸測序(Margulies et al, 2005; 王中華等,2014), 結(jié)果用羅氏軟件2.5.3進(jìn)行信號處理分析。根據(jù)藍(lán)藻細(xì)菌在文庫中出現(xiàn)的頻次數(shù)量, 進(jìn)一步用 R For Window 2.15.2、SPSS等進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 454測序分析裸藻綱和藍(lán)藻在排污口的分布

通過對 454高通量測序共檢出眼蟲門的裸藻綱(Euglenoidea)、藍(lán)藻門的集球藻目(Synechococcophycideae)、顫藻目(Oscillatoriophycideae)、念珠藻目(Nostocophycideae)、粘桿菌目(Gloeobacterophycideae),具體數(shù)量見表1。

表1 不同時間藍(lán)藻和裸藻綱生物檢出次數(shù)總體分析Tab.1 Results of detection on Cyanobacteria and Euglenoidea in percentage

2.2 排污口藍(lán)藻和裸藻綱生物的分布與季節(jié)的關(guān)系

通過對 454高通量測序平臺結(jié)果進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn): 在3月份, S4象山西周工業(yè)園區(qū)排污口、S7寧海西店崔家綜合排污口藍(lán)藻和裸藻綱生物數(shù)量最多,S7寧海西店崔家綜合排污口次之。在5月份, S4象山西周工業(yè)園區(qū)排污口的檢出次數(shù)最高, S6北侖三山排污口、S7寧海西店崔家綜合排污口和S8奉化下陳排污口次之。在8月份, S7寧海西店崔家綜合排污口的檢出次數(shù)最高, S9寧海顏公河入海排污口次之。在10月份, S6北侖三山排污口檢出次數(shù)最高, S7寧海西店崔家綜合排污口和S9寧海顏公河入海排污口次之。

3月份的藍(lán)藻和裸藻綱生物檢出次數(shù)最高, 8月份和10月份檢出次數(shù)較低。其原因是8月份東海海洋表面平均溫度達(dá)到年最高值約為 30—35°C, 高溫使部分工廠停產(chǎn)休息, 因此污水排放量減小(陳麗萍等, 2013), 3月份的時候排污量較多, 而且氣溫較低適于這兩類生物的生長, 因此檢出次數(shù)與季節(jié)溫度、空氣濕度有關(guān)(圖2)。

圖2 不同月份藍(lán)藻和裸藻綱生物在排污口的分布情況Fig.2 The distribution of Cyanobacteria and Euglenoidea in different sewage outlets and months

3月份, 距S7寧海西店崔家綜合排污口50m處藍(lán)藻和裸藻綱生物數(shù)量最多, 距 S4象山西周工業(yè)園區(qū)排污口50m處含量次之; 5月份, 距S7寧海西店崔家綜合排污口50m處含量最高, 距S4象山西周工業(yè)園區(qū)排污口50m處含量次之; 8月份, 距S7寧海西店崔家綜合排污口50m處含量最高, 距S6北侖三山排污口50m處含量次之; 10月份, 距S6北侖三山排污口50m處含量最高, 距S7寧海西店崔家綜合排污口50m處含量次之(圖3)。

藍(lán)藻和裸藻綱生物大量出現(xiàn)時, 附近水體一般呈藍(lán)色或綠色, 水面被大量藻體覆蓋。藍(lán)藻細(xì)胞尤其是微囊藻將毒素釋放到水里, 由于本身的機(jī)制使得其在夏天的富營養(yǎng)水體中容易大量暴發(fā)生長, 造成嚴(yán)重的水體生態(tài)災(zāi)難(Brescianiet al, 2014)。微囊藻毒素對人體肝功能有很大的傷害, 生活在湖邊、池塘邊和海邊的人容易通過飲用水和食用藻類中毒(王偉琴等, 2010; Urrutia-Corderoet al, 2013)。寧海西店鎮(zhèn)是中國著名的“牡蠣之鄉(xiāng)”, 牡蠣營養(yǎng)豐富, 具有各種人體必需氨基酸對降低血糖也有一定的作用(滕瑜等,2005), 冬季是西店牡蠣最盛產(chǎn)也是蠣肉最肥美的季節(jié)。而蠣肉品質(zhì)與海水的質(zhì)量有著緊密聯(lián)系, 某些藍(lán)細(xì)菌(如集球藻目)會通過內(nèi)吞的方式進(jìn)入牡蠣組織內(nèi)部達(dá)到寄生目的, 進(jìn)而在牡蠣組織內(nèi)部累積, 從而污染了牡蠣的肉質(zhì)(Avila-Povedaet al, 2014), 因此3月份應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)對 S7號排污口的監(jiān)控, 以免造成牡蠣污染和經(jīng)濟(jì)損失。

2.3 種類的分布

圖3 不同月份各排污口的藍(lán)藻和裸藻綱生物數(shù)量與50m的站位點(diǎn)的比較Fig.3 Comparison in Cyanobacteria and Euglenoidea quantity between each sewage outlet and a site 50m away in different months

在3月份, S4號象山西周工業(yè)園區(qū)排污口裸藻綱生物檢出頻次最高(排污口1906次, 距排污口50m處2223次), 占3月份所有檢出生物總量的20.83%, 藍(lán)藻檢出頻次則較少(排污口124次, 距排污口50m處106次); S2號象山水桶岱垃圾場排污口中兩類生物排出量最少(排污口0次, 距排污口 50m處 51次)。說明S2號3月份排污口排出的污染物中沒有這兩類微生物需要的營養(yǎng)。而其它排污口均是裸藻綱生物的檢出頻次最高(圖 4)。在 5月份, 各排污口藍(lán)藻檢出頻次均較少, S4號象山西周工業(yè)園區(qū)排污口裸藻綱生物檢出頻次最高(排污口 629次, 距排污口 50m處 557次), S6號北侖三山排污口裸藻綱生物檢出頻次也較高(排污口處231次, 距排污口50m處343次), S1號象山爵溪東塘排污口裸藻綱生物檢出頻次最低(排污口處3次, 距排污口50m處3次)。在8月份, S7號寧海西店崔家綜合排污口裸藻綱生物檢出頻次最高(排污口處1077次, 距排污口50m處2040次), 其它排污口裸藻綱生物檢出頻次都較低。各排污口集球藻目檢出頻次均偏低, 其中 S8號奉化下陳排污口檢出頻次最高(排污口處236次, 距排污口50m處4次), S6號北侖三山排污口集球藻目檢出頻次次之(排污口處180次, 距排污口50m處195次)。而S2、S3、S5號則沒有集球藻目。在10月份, S6號北侖三山排污口集球藻目檢出次數(shù)最高(排污口處 344次, 距排污口50m 處 249次), 而裸藻綱檢出頻次較低(排污口處129次, 距排污口50m處404次), S9寧海顏公河入海排污口葉綠體目檢出頻次最高(排污口 212次, 距排污口50m處193次), 集球藻目檢出次數(shù)則較低。

S7寧海西店崔家綜合排污口和距排污口50m處裸藻綱生物的檢出次數(shù)總數(shù)最高, 說明 S7號處的海水質(zhì)量更適合裸藻綱生物的生長。寧海西店崔家綜合排污口的主要污染物沒有氨氮化合物, 而其它排污口處氨氮濃度較高。裸藻綱生物的生長并不只是受氨氮含量的影響, 氮磷比對裸藻綱生物的生長影響較大, 在低磷情況下(0.02mg/L), 氮磷比為 4︰1—32︰1范圍內(nèi), 某些生物(如銅綠微囊藻和斜生柵藻)的生長均受到營養(yǎng)鹽的限制, 當(dāng)磷濃度達(dá)到 0.20mg/L時,這兩種藻類分別在在N/P比為32︰1和64︰1時生長速率達(dá)到最大值, 而在磷濃度升高到2mg/L時, 氮磷比對生長速率已經(jīng)沒有影響(Sabour et al, 2009; 許海等, 2011)。可以推測S7號排出的污水中氮磷比適合裸藻綱生物的生長, 因此應(yīng)該加強(qiáng)對 S7號氮磷含量的監(jiān)控, 以避免出現(xiàn)水華現(xiàn)象(圖4)。

2.4 藍(lán)藻和裸藻綱生物在重點(diǎn)排污口的分布

S9號寧海顏公河入海排污口和S5號象山墻頭綜合排污口為寧波市兩個重點(diǎn)沿海排污口。兩類生物檢出頻次在時間和數(shù)量上有明顯的差異。S9號寧海顏公河入海排污口中的裸藻綱檢出頻次最高為 3月份,高達(dá)1099次, 最低為5月份的35次, 藍(lán)藻的檢出次數(shù)在3、5、8、10月份檢出頻次均很少, 最高為8月份16次。S5號象山墻頭綜合排污口裸藻綱檢出頻次最高為5月份, 高達(dá)23次, 其它月份排污口裸藻綱的檢出頻次都在15次以下, 而藍(lán)藻在四個月份檢出頻次一共只有 3次(圖 5)。S9號寧海顏公河入海排污口和S5號象山墻頭綜合排污口排出的主要是裸藻綱。

S9號寧海顏公河入海排污口的主要污染物為磷和氨氮, S5號象山墻頭綜合排污口的主要污染為糞大腸菌群、苯胺、生化需氧量。這兩個重點(diǎn)排污口兩類生物檢出頻次均相對較少, 說明這兩個排污口污染物中氮磷比含量不適合它們生長。但是寧海顏公河排污口和象山墻頭綜合排污口分別在3月和5月裸藻綱的檢出量達(dá)到最大值, 寧海顏公河排污口3月份裸藻綱檢出頻次要高于象山墻頭綜合排污口在 5月份的檢出頻次, 這可能與寧波3月份和5月份氣溫有關(guān)系,3月份平均氣溫比5月份平均氣溫低10°C左右, 推測裸藻綱生物更適宜較低溫度生長; 藍(lán)藻檢出量分別在8月和5月達(dá)到最大值。寧波8月份日均最低溫度為25°C, 日均最高溫度為32°C; 5月份日均最低溫度為 17°C, 日均最高溫度為 25°C, 銅綠微囊藻在 15°C的生長速率和生長量低于在20°C、25°C下的生長速率, 20°C條件下銅綠微囊藻在前期的生長速率低于在 25°C下的生長速率, 而在 17d時兩種條件下的生長量開始相等。銅綠微囊藻更容易在5月份生長, 所以應(yīng)根據(jù)溫度變化做好對藍(lán)藻生長的防治, 以免其毒素在水產(chǎn)品中(如藻類、螺類、貝類和各種魚類)積累, 對人類健康造成危害(陳建中等, 2010)。

圖4 不同月份和不同站位排污口的藍(lán)藻和裸藻綱生物檢出次數(shù)Fig.4 The numbers of Cyanobacteria and Euglenoidea in the sewage outlets in different months

圖5 重點(diǎn)排污口藍(lán)藻和裸藻綱生物各月份檢出頻次Fig.5 The number of Cyanobacteria and Euglenoidea in major sewage outlets in different months

3 結(jié)論

利用454高通量測序技術(shù), 確定了寧波沿海2個重點(diǎn)排污口、8個一般排污口的20個站位的海水中,含有葉綠體的裸藻綱生物檢出量最高, 藍(lán)藻門的集球藻目次之。由于季節(jié)性的影響, 排污口的污染物和溫度也會發(fā)生相應(yīng)的變化, 進(jìn)而影響藍(lán)藻的生長。裸藻綱生物的檢出量也受各排污口中氮磷比含量影響較大, 不同的生物在不同的氮磷比的條件下生長速率也會不同, S7號排污口中污染源更適合裸藻綱生物的生長。S9號和S5號排污口作為寧波市兩個重點(diǎn)陸源排污口, 兩種生物檢出量均相對較低, 分別在3月份和5月份裸藻綱檢出量最大, 8月和5月藍(lán)藻檢出量達(dá)到最大值, 季節(jié)性溫度變化會影響這兩類生物的生長, 應(yīng)該依照不同季節(jié)和不同類型的排污口針對性地對藍(lán)藻進(jìn)行治理, 防止造成水體污染。

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