微生物利用廢棄油脂合成PHA的研究進(jìn)展

劉慧,任連海

(北京工商大學(xué) 食品學(xué)院,北京 100037)

微生物利用廢棄油脂合成PHA的研究進(jìn)展

劉慧,任連海

(北京工商大學(xué) 食品學(xué)院,北京 100037)

摘要:指出了聚羥基脂肪酸酯(PHA)是細(xì)菌在碳源充足、氮源缺乏的情況下產(chǎn)生的作為胞內(nèi)碳源和能源儲(chǔ)存物的生物聚酯,PHA作為一種可降解高分子材料,可替代傳統(tǒng)塑料。然而高于傳統(tǒng)塑料5~10倍的生產(chǎn)成本是限制PHA大規(guī)模應(yīng)用的主要原因。以廢棄油脂為碳源生產(chǎn)PHA,不僅能有效降低PHA成本,同時(shí)可以為廢棄油脂的資源化提供合理的途徑。綜述了近年來(lái)廢棄油脂用于PHA合成的最新進(jìn)展。

關(guān)鍵詞:聚羥基脂肪酸酯(PHA);廢棄油脂;微生物合成

1引言

聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHA)是廣泛存在于微生物體內(nèi)的一類高分子生物聚酯,在生物體內(nèi)主要作為碳源和能量的貯藏物質(zhì),如圖1所示。PHA與傳統(tǒng)的、以石油為原料合成的塑料具有相似的材料學(xué)性質(zhì),但可以用可再生的資源合成,并且具有生物可降解性、生物相容性和不依賴化石資源等特性,可以完全降解進(jìn)入自然界的生態(tài)循環(huán),具有廣闊的應(yīng)用前景。因此,通過(guò)生物技術(shù)利用可再生資源生產(chǎn)PHA,獲得生物可降解聚合物以代替源自石油的普通塑料,受到相關(guān)領(lǐng)域研究者的普遍關(guān)注。

圖1　細(xì)胞內(nèi)的PHA

2PHA研究現(xiàn)狀

PHA在20世紀(jì)20年代就被發(fā)現(xiàn),當(dāng)時(shí)研究者發(fā)現(xiàn)其能被蘇丹染料染色,可溶于氯仿[1],但未給其命名。1926年,Lemoigne[2]在巨大芽抱桿菌中,也發(fā)現(xiàn)了此類物質(zhì),并首次給這類物質(zhì)命名。隨后研究發(fā)現(xiàn),很多菌株都能夠合成PHA。在這一階段,還研究了PHB的天然顆粒提取及提取的PHB的功能[3],并且對(duì)PHB合成和分解代謝[4]進(jìn)行了初步研究。1974年,Wallen和Rohwedder[5]發(fā)現(xiàn)了其它PHA,標(biāo)志PHA研究進(jìn)入發(fā)展階段。其他PHA的發(fā)現(xiàn)引發(fā)了人們研究PHA的興趣,中長(zhǎng)鏈PHA開始被人們廣泛認(rèn)識(shí)[6,7]。在以后的20多年里發(fā)現(xiàn)了多種各種各樣、性能各異的PHA。在這一時(shí)期,PHA的商業(yè)應(yīng)用研究也開始起步,第一個(gè)商業(yè)化產(chǎn)品3HB和3HV的異聚物也在這一時(shí)期誕生了。在各種各樣的細(xì)菌中都檢測(cè)到了PHA的存在。PHA合酶基因[8]的克隆標(biāo)志著PHA的研究進(jìn)入了迅猛發(fā)展階段。分子生物學(xué)的發(fā)展為在分子水平研究PHA提供了可能。在這一發(fā)展階段,研究者們主要進(jìn)行的是對(duì)合成這些聚酯分子生物學(xué)手段完美的應(yīng)用于PHA基因的克隆、缺失突變、嵌合研究中,提高了PHA的產(chǎn)量、產(chǎn)生了新型PHA。聚羥基脂肪酸酯作為一種可替代傳統(tǒng)塑料的新型材料已被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛研究,國(guó)內(nèi)的研究主要集中在利用基因修飾合成PHA[9~11],利用活性污泥合成PHA[12,13],以及PHA在微生物細(xì)胞內(nèi)的生物合成途徑和合成PHA的酶的研究[14]。

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3PHA的結(jié)構(gòu)及應(yīng)用

PHA具有多種單體,其結(jié)構(gòu)是一種帶有多羥基的鏈?zhǔn)骄酆衔?根據(jù)其支鏈的結(jié)構(gòu),進(jìn)行不同的命名。其結(jié)構(gòu)通式為如圖2所示。

圖2　PHA的分子結(jié)構(gòu)

其中n=1、2、3或4;通常m=1。n為聚合物單體的數(shù)目,多為100~3000,決定分子量的大小。R代表側(cè)鏈,可為飽和或不飽和、直鏈或含側(cè)鏈及取代基的烷基。根據(jù)單體中的碳原子數(shù),可將PHA分為兩類:短鏈PHA,單體中含有3~5個(gè)碳原子;中長(zhǎng)鏈PHA,單體中含有6~14個(gè)碳原子[15]。根據(jù)PHA單體成分是否唯一,也可將PHA分為均聚物和共聚物。在所有已發(fā)現(xiàn)的PHA中,除PHB、PHV為均聚物外,其余皆為共聚物。不同結(jié)構(gòu)的PHA是在與其單體結(jié)構(gòu)相關(guān)的底物培養(yǎng)中獲得的,這使得合成多種不同結(jié)構(gòu)的PHA成為可能。

自1926 年Lemoigne第一次在芽抱桿菌中發(fā)現(xiàn) PHB,到目前為止,研究人員已經(jīng)在300 多種細(xì)菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)了近百種不同脂肪酸構(gòu)成的 PHA單體,這些單體涵蓋了碳原子數(shù)從3到16的具有飽和或不飽和鍵或支鏈的脂肪族以及芳香族3-羥基脂肪酸[16-18],幾種常見的PHA分子式見表1。

表1　PHA的單體結(jié)構(gòu)

PHA具有良好的生物相容性能、生物可降解性、紫外穩(wěn)定性、生物組織相容性和塑料的熱加工性能、光學(xué)活性、壓電性、抗潮性、低透氣性等特殊性能,在日常生活、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、工業(yè)、環(huán)境保護(hù)等各個(gè)領(lǐng)域有著巨大的研究?jī)r(jià)值:①可降解包裝材料,由于PHA是類似聚丙烯的可降解材料,因此可應(yīng)用于制造可拋棄型的材料用具,如手袋,包裝膜,容器等。②醫(yī)藥行業(yè),PHA具有生物可降解性和生物相容性,可用作緩釋材料,當(dāng)其作為藥物基質(zhì)包埋藥物植入人體后,隨著藥物釋放,能降解為3HA,而3HA在人體中是一種正常存在物質(zhì),可被人體自行代謝,而不有任何毒副作用。PHA還可以用來(lái)生產(chǎn)手性單體。手性藥物的天然存在性使手性藥物使用起來(lái)更安全有效且使用劑量更小[19]。③組織工程,生物相容性、生物可降解性、無(wú)毒性、無(wú)刺激性、無(wú)免疫原性、不溶血及無(wú)致突變性、壓電性等特點(diǎn)使PHA在組織工程中廣泛應(yīng)用。比起傳統(tǒng)的組織工程材料,PHA的無(wú)毒可降解性使得患者在進(jìn)行手術(shù)時(shí)更加安全,且能減少再次創(chuàng)傷、減輕患者再次疼痛。④壓電性,PHB經(jīng)過(guò)80℃碾壓后再經(jīng)熱處理制成單軸定向的箔和薄膜后在45℃增加拉力或剪應(yīng)力,使其呈現(xiàn)表面壓電特性,即可應(yīng)用于壓力測(cè)試儀,點(diǎn)火器,診聽器,聲學(xué)儀器等儀器。⑤生物能源,PHA作為一種聚酯本身就具有可燃性,當(dāng)其經(jīng)甲酯化處理PHA即得到3-羥基脂肪酸甲酯,可以直接作為生物燃料,燃燒熱稍低于乙醇[20]。⑥其他應(yīng)用,PHA還具有光學(xué)活性,可應(yīng)用于色譜中分離手性物質(zhì)。此外,PHA可在農(nóng)業(yè)、環(huán)境中用作指示劑等,具有廣泛應(yīng)用。

4利用廢棄油脂合成PHA

雖然PHA聚合物具有在自然條件下能被完全降解的優(yōu)點(diǎn),可作為傳統(tǒng)塑料的替代物。但時(shí)至今日,PHA并沒(méi)有得到大規(guī)模的應(yīng)用。其中最主要的原因是生產(chǎn)PHA的成本太高。目前PHA生產(chǎn)主要依賴于微生物發(fā)酵,在微生物發(fā)酵合成PHA的所有發(fā)酵條件因素中,底物是一個(gè)重要因素,其成本占到總成本的28%~50%[21]。采用廉價(jià)底物將在很大程度上降低PHA的生產(chǎn)成本。利用廢棄油脂合成PHA既可以解決廢棄油脂處理不當(dāng)帶來(lái)的廢水、廢氣等環(huán)境污染的問(wèn)題,又可以降低PHA的生產(chǎn)成本,使其獲得廣泛應(yīng)用。

4.1　生物柴油副產(chǎn)物

近年來(lái),石油危機(jī)、能源緊缺的問(wèn)題日益嚴(yán)峻,世界各國(guó)正積極研發(fā)太陽(yáng)能、風(fēng)能、水能、生物質(zhì)能等可再生的替代能源。生物柴油作為一種極有前景的可再生能源,受到全世界學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的普遍關(guān)注。然而,在生產(chǎn)生物柴油的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物,主要包括脂肪酸甲酯、甘油、游離脂肪酸、水、低碳醇(甲醇或乙醇)和微量的鹽(如K2SO4,NaCl)等[22~23]。其中僅甘油一種產(chǎn)物就可達(dá)到生物柴油總產(chǎn)量的1/10。生物柴油副產(chǎn)物是非常好且便宜的PHA合成的原料。以生物柴油副產(chǎn)物為原料合成PHA,對(duì)于解決生物柴油副產(chǎn)物過(guò)度積累的問(wèn)題具有重要意義,因此利用生物柴油副產(chǎn)物甘油合成PHA受到廣泛關(guān)注。

Nikel等以甘油為碳源,利用重組大腸桿菌arcA突變株,添加1.78 g/ L水解酪氨酸合成了PHB[24]。Koller等最先利用還未被鑒定的耐高滲透壓的微生物以生物柴油副產(chǎn)物為碳源在未添加任何前體的情況下合成P(3HB-co-3HV)[25]。Mothes等利用純甘油,以Paracoccus denitrificans和Cupriavidus necator JMP 134為出發(fā)菌株合成PHB,PHB占細(xì)胞干重的70%。當(dāng)以含有5.5% NaCl的粗甘油為碳源時(shí),PHB含量降低至48%,這主要由于氯化鈉高滲作用引起的[23]。Cavalheiro等以純甘油為底物,利用Cpriavidus necator DSM 545生產(chǎn)PHB,最大細(xì)胞干重是82.5 g/L,PHB產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞干重的62%,產(chǎn)率為1.1~1.5g PHB L-1h-1。當(dāng)以廢甘油為底物時(shí),PHB產(chǎn)率為0.84 gPHBL-1h-1,細(xì)胞干重為68.8g/L。生物量濃度在PHB積累時(shí)起到關(guān)鍵作用,降低生物量的濃度,PHB含量可達(dá)細(xì)胞干重的50%,PHB產(chǎn)率可達(dá)1.1gPHB L-1h-1[26]。Mazur等以Cupriiavidus necator為出發(fā)菌株,在添加了米糠油制備的生物柴油副產(chǎn)物的礦物鹽培養(yǎng)基中,30℃,150rpm培養(yǎng)24h,合成了PHB[27]。

4.2　餐廚廢油

餐廚廢油包括煎炸廢油、泔水油和地溝油等源自于餐飲業(yè)的廢油脂,成分主要是烹調(diào)用植物油和食品中動(dòng)物油脂,化學(xué)組成主要為脂肪酸甘油酯[28]。

煎炸廢油是指餐館、飯店、單位食堂等做煎炸食品后廢棄的煎炸用油。煎炸廢油屬于大分子疏水性有機(jī)物,其在多次煎炸過(guò)程中與空氣中的氧氣接觸,發(fā)生一系列水解、氧化、聚合等復(fù)雜反應(yīng),使得油黏度增加,油中原本含有的一些不飽和脂肪酸含量極低,產(chǎn)生了一些具有致癌作用的脂肪酸類聚合物及醛、酮、內(nèi)酯等刺激性氣味的物質(zhì)。泔水油主要是指從餐廚垃圾中分離回收的廢油,這類廢油是植物油和動(dòng)物油的混合物,主要來(lái)自餐廚垃圾處理廠,容易收集和集中管理。地溝油是從餐飲單位廚房排水除油設(shè)施分離出的油脂和排水管道或檢查井清掏污物中提煉出的油脂,由于地溝油回收、加工及提煉過(guò)程衛(wèi)生條件惡劣,導(dǎo)致地溝油中含有多種有毒有害成分,重金屬、細(xì)菌、真菌、黃曲霉毒素等嚴(yán)重超標(biāo),因此地溝油對(duì)人體具有很大的危害性。餐廚廢油如果進(jìn)入環(huán)境或被不法商販加工為食用油重新回到居民餐桌,會(huì)造成極大的環(huán)境污染,并嚴(yán)重威脅人類健康。同時(shí)餐廚廢油具有廢物與資源的二重性,由于其回收價(jià)格低,含碳量高,因此作為微生物培養(yǎng)的有效碳源獲得了廣泛的研究。

Taniguchi等研究發(fā)現(xiàn),Ralstonia eutropha(現(xiàn)重新命名為C.necator)能吸收植物油脂廢物以及廢動(dòng)物脂,轉(zhuǎn)換成PHA,且產(chǎn)量較高,高達(dá)細(xì)胞干重的80%[29]。Stanislav Obruca等以廢棄菜籽油為底物,利用Cpriavidus necator H16生產(chǎn)PHA,通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)PHA產(chǎn)量可達(dá)105g/L,每克油脂可產(chǎn)生0.83gPHA,產(chǎn)率為1.46gPHAL-1h-1[30]。Kahar等利用Ralstonia eutropha H16為實(shí)驗(yàn)菌種,以廉價(jià)大豆油為碳源生產(chǎn)PHA,細(xì)胞干重可達(dá)118~126 g/L,PHA含量為 72%~76% (w/w)。研究表明,以廉價(jià)大豆油作為唯一碳源生產(chǎn)PHA,每克豆油可產(chǎn)生PHA0.72~0.76g,碳源成本降至0.4美元/kgPHA[31]。Pradella等利用大豆油為碳源,以Cupriavidus necator為出發(fā)菌種,研究表明當(dāng)大豆油添加量為40g/L時(shí),細(xì)胞干重最高可達(dá)83g/L,PHB含量為81% (w/w),PHB 產(chǎn)率為2.5 gL-1h-1,且磷、銅、鈣、鐵等元素的缺乏會(huì)限制細(xì)菌的生長(zhǎng)和PHB的合成[32]。Fernández等通過(guò)Pseudomonas aeruginosa 42A2利用廢的烹飪油和其他廢油生產(chǎn)PHA,該菌株可以積累54.6%的PHA[33]。孫萬(wàn)東等用硫酸銨作氮源,以15g/L煎炸廢油為碳源生產(chǎn)PHB時(shí),PHB的含量和產(chǎn)量分別為82.1%、10.86g/L,PHB的產(chǎn)率為0.724gL-1h-1,相同情況下利用煎炸廢油可以獲得比純豆油更高的PHB產(chǎn)量[21]。Verlinden等利用Cupriavidus necator 為實(shí)驗(yàn)菌種,以煎炸廢油為底物生產(chǎn)PHA,PHA產(chǎn)量可達(dá)1.2g/L,與以葡萄糖為底物時(shí)濃度類似[34]。

5存在問(wèn)題與展望

利用廢棄油脂生產(chǎn)PHA提供了廢棄油脂資源化途徑,但同時(shí)也存在一些問(wèn)題。廢棄油脂組成較為復(fù)雜,且成分不穩(wěn)定,其中含有不能被微生物利用的成分,或許會(huì)影響微生物發(fā)酵合成 PHA。利用廢棄油脂生產(chǎn)的 PHA 分子量相對(duì)較小,且產(chǎn)品中容易存在油脂殘留。相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,必將解決PHA生產(chǎn)成本較高的問(wèn)題,同時(shí)提高產(chǎn)品質(zhì)量,并實(shí)現(xiàn)廢棄油脂的資源化利用和高附加值產(chǎn)品的開發(fā)。

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通訊作者:任連海(1971—),男,河北人,副教授,主要從事固體廢棄物處理處置方面的教學(xué)研究工作。

作者簡(jiǎn)介:劉慧(1990—),女,河北人,北京工商大學(xué)食品學(xué)院碩士研究生。

收稿日期:2014-12-04

中圖分類號(hào):X703

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1674-9944(2015)01-0263-03