表面增強(qiáng)拉曼光譜法快速鑒別非法染色的關(guān)黃柏藥材

通信作者：陸峰，男，博士研究生，教授，研究方向：藥物、生物光譜信息學(xué)，拉曼光譜的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究，Tel：021-81871268,E-mail：fenglufeng@hotmail.com

表面增強(qiáng)拉曼光譜法快速鑒別非法染色的關(guān)黃柏藥材

李丹1,汪冰2,李曉1,張中湖2，鞏麗萍2，陸峰1,褚克丹1

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué),福建 福州 350122;2.山東省食品藥品檢驗研究院,山東 濟(jì)南 250101)

摘要：目的采用表面增強(qiáng)拉曼光譜法(SERS)對非法染色的關(guān)黃柏進(jìn)行快速檢測。方法采用原位還原法制備的銀膠紙作為SERS基底，擦拭經(jīng)乙醇溶液潤濕的關(guān)黃柏，銀膠紙的擦拭區(qū)立即進(jìn)行SERS檢測。本文先后對硝酸銀的濃度、銀膠紙的增強(qiáng)效果及穩(wěn)定性等因素進(jìn)行考察和優(yōu)化。結(jié)果成功鑒別經(jīng)0.01 mg·mL-1金胺O染料染色的關(guān)黃柏。結(jié)論表面增強(qiáng)拉曼光譜法可實現(xiàn)對染色黃藥材的快速、簡單、靈敏和無損的鑒別。

關(guān)鍵詞：表面增強(qiáng)拉曼光譜；銀膠紙;關(guān)黃柏；非法染色；金胺O

作者簡介：李丹，女，研究方向：紙基-SERS法及其在復(fù)雜樣品檢測中的研究，E-mail:cicilee08@163.com

中圖分類號：R286.0文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Identification of dyeing adulteration in Amur Cork-tree Bark by

surface-enhanced Raman spectroscopy

LIDan1,WANGBing2,LIXiao1,ZHANGZhong-hu2,GONGLi-ping2,LUFeng1,CHUKe-dan1

(1.FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine，F(xiàn)uzhou350122，China；2.ShandongInstitute

forFoodandDrugControl，Jinan250101，China)

Abstract：ObjectiveTo establish a surface-enhanced Raman scattering (SERS) method for the detection of dyed Amur Cork-tree Bark.MethodsSupported silver nanoparticles on filter paper were synthesized by the method of in situ reduction.Experimental designs were performed to obtain the best detection results by studying the parameters：the concentration of silver nitrate solution,the enhancement effect and stability of the Ag NPs-paper.ResultsThe dyed Amur Cork-tree Bark,stained by Auramine O at the concentration of 0.01 mg·mL-1,had been successfully detected.ConclusionCompared with the Ag NPs-paper and SERS technology,the scheme provided a simple and rapid detection method of dyed Amur Cork-tree Bark.

Key words:SERS;Ag NPs-paper;Amur Cork-tree Bark;Dyeing adulteration;Auramine O

1前言

近些年來，隨著藥材市場的不斷發(fā)展，摻偽造假的現(xiàn)象也層出不窮[1]，常見造假現(xiàn)象包括增加飲片重量、摻偽、染色等，其中非法染色尤為突出。非法染色的藥材多為冒充貴細(xì)藥材，經(jīng)染色后外觀酷似正品， 大多數(shù)消費者難以識別。金胺O，又稱堿性嫩黃O、鹽基淡黃、鹽基槐黃、堿性槐黃等，工業(yè)上用于蠶絲、腈綸、皮革及紙張等物品的染色；另外，金胺O用于黃色中藥材的非法染色的現(xiàn)象也屢見不鮮[2~4]。關(guān)黃柏為蕓香科植物黃檗PhellodendronamurenseRupr.的樹皮，性寒，味苦，常用于濕熱瀉痢、黃疸、帶下、熱淋、腳氣、骨蒸勞熱、盜汗、遺精、瘡瘍腫毒等病癥[4]，然而，接觸或食用金胺O染色的黃柏藥材，會引起癌腫[5]。因此，建立關(guān)于非法染色關(guān)黃柏的快速、簡單和準(zhǔn)確的鑒別方法十分必要。

目前，國內(nèi)外對染色中藥材、中藥飲片和常見色素的檢測方法包括：理化和經(jīng)驗鑒別、色譜、質(zhì)譜及其連用技術(shù)、光譜法等[2~14]。例如：饒偉文等[9]人采用薄層色譜法和HPLC-DAD鑒定相關(guān)藥材，并在摻假蒲黃和黃芩中檢測出金胺O，在紅花中檢測出金橙Ⅱ；莫連峰等[10]用HPLC法測定染色黃芩中金胺O的含量，檢測的14批市售蒲黃，其中有7批檢測出金胺O；Di Anibala等[13]利用表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)法和算法分析技術(shù)成功鑒別了辣椒粉中的蘇丹紅染料。從研究者之前的工作中不難發(fā)現(xiàn)，薄層色譜法操作簡單，成本較低，但影響因素較多，一般用于定性初篩；色譜、質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)具有樣品用量少、靈敏度高等特點，但檢測時間長，且需對樣品進(jìn)行一定的前處理；而光譜技術(shù)，特別是近些年來興起的SERS技術(shù)可以實現(xiàn)色素快速、無損的鑒別，且具有制樣簡單、檢測時間短等優(yōu)點，因此，SERS具備成為快速、準(zhǔn)確檢測非法染色的中藥材方法的潛質(zhì)。

本文以非法染色的關(guān)黃柏為研究對象，選用還原法制備的銀膠紙作為SERS基質(zhì)，成功鑒別了低濃度金胺O染色的關(guān)黃柏。先后對硝酸銀的濃度、銀膠紙的增強(qiáng)效果和穩(wěn)定性等因素進(jìn)行考察和優(yōu)化，以期建立非法染色關(guān)黃柏的快速、準(zhǔn)確的鑒別方法，此法的建立有利于進(jìn)一步加大對中藥材、中藥飲片市場的監(jiān)管，保障消費者的用藥安全。

2儀器與試劑

2.1儀器蔡氏掃描電鏡(EVO MA-10 Germany)；i-Raman(BWS415,B&W Tek,U.S.A)，激發(fā)波長為785 nm，分辨率為5 cm-1；KQ-250DB型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2.2試劑和樣品硝酸銀、硼氫化鈉和無水乙醇均為分析純(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；定量濾紙(杭州特種紙業(yè)有限公司)；純凈水；金胺O和結(jié)晶紫(CV)(阿拉丁試劑公司)；關(guān)黃柏購于藥店。

3實驗部分

3.1染色關(guān)黃柏的制備精密稱取CV和金胺O粉末0.003 g，分別溶解于純凈水和乙醇3 mL，振蕩溶解，即制得濃度為1 mg·mL-1的染料標(biāo)準(zhǔn)溶液，其余濃度的染料溶液通過逐級稀釋獲得。取適量關(guān)黃柏進(jìn)行染色，染色后的藥材烘干待用。

3.2原位還原法制備銀膠紙

3.2.1精密稱取17、51、85、136和170 mg硝酸銀，分別溶解于10 mL純凈水，制備0.01、0.03、0.05、0.08 和0.10 mol·L-1的硝酸銀溶液，避光保存待用；精密稱取46.8 mg 硼氫化鈉，溶解于60 mL的純凈水，制備0.2 mol·L-1的硼氫化鈉溶液，待用。

3.2.2原位還原法[15，16]制備銀膠紙將定量濾紙浸泡在上述硝酸銀溶液中，待6 min后取出；分別取0.2 mol·L-1的硼氫化鈉溶液10 mL進(jìn)行原位還原，反應(yīng)片刻后用純凈水淋洗數(shù)次后干燥待用。

3.3金胺O的標(biāo)準(zhǔn)圖譜的獲得采用移液槍移取1 mg·mL-1的金胺O標(biāo)準(zhǔn)溶液1 μL，滴加于優(yōu)化過的銀膠紙上，滴加區(qū)立即進(jìn)行SERS檢測，即獲得染料的標(biāo)準(zhǔn)SERS圖譜。

3.4染色關(guān)黃柏的檢測與優(yōu)化采用移液槍移取25 μL的乙醇-水混合溶液潤濕染色后的關(guān)黃柏數(shù)秒，用干燥的銀膠紙擦拭藥材的潤濕區(qū)域數(shù)秒，擦拭后的銀膠紙立即進(jìn)行SERS檢測。

4結(jié)果與討論

4.1硝酸銀溶液濃度的考察和優(yōu)化

4.1.1硝酸銀濃度對增強(qiáng)效果的影響選取0.1 mg·mL-1的CV作探針對不同浸泡時間所制得銀膠紙的增強(qiáng)效果進(jìn)行考察，取1 μL該溶液點于浸泡0.01、0.03、0.05、0.08和0.10 mol·L-1的硝酸銀溶液后制得的銀膠紙上，點樣區(qū)立即進(jìn)行SERS檢測，結(jié)果見圖1(A)。選用1 170 cm-1處的特征峰強(qiáng)度[17]作為標(biāo)準(zhǔn)比較增強(qiáng)效果，將3次檢測的平均強(qiáng)度做柱狀圖，如圖1(B)所示，采用0.05 mol·L-1的硝酸銀制備的銀膠紙增強(qiáng)效果最好；且當(dāng)濃度超過0.05 mol·L-1時，增強(qiáng)效果有所減弱，這可能是由于高濃度的硝酸銀在空氣中發(fā)生了氧化反應(yīng)。因此，選擇0.05 mol·L-1硝酸銀溶液制備的銀膠紙進(jìn)行下述實驗。

圖1　(A)1 μL 0.1 mg·mL -1的CV滴于各銀膠紙上所得SERS檢測圖譜；(B)銀膠紙增強(qiáng)效果柱狀圖， 從左至右依次為：0.01、0.03、0.05、0.08和0.10 mol·L -1

4.1.2銀膠紙增強(qiáng)因子的計算采用下述公式計算新制備銀膠紙的增強(qiáng)因子(EF)[18]：

EF=Is×NR/(IR×Rs)

其中，I表示1 170 cm-1處的拉曼峰強(qiáng)度，N表示沉積于SERS基底上的CV的分子數(shù)。使用圖1A的數(shù)據(jù)進(jìn)行計算，銀膠紙的增強(qiáng)因子為4.6×103。

4.2銀膠紙的表征采用掃描電鏡對銀膠紙進(jìn)行表征，結(jié)果見圖2。如圖所示，定量濾紙(A)表面僅能觀察到紙纖維；而采用原位還原法制備的濾紙(B)表面大量的銀納米粒子清晰可見且顆粒尺寸在 50～100 nm 左右，這為“SERS熱點”的獲得提供了保證。

圖2　濾紙(A)和銀膠紙(B)的掃描電鏡圖 (放大倍數(shù)分別是2 000倍和50 000倍)

4.3銀膠紙穩(wěn)定性的考察同樣選取0.1 mg·mL-1的CV作探針對儲存10 d內(nèi)銀膠紙的增強(qiáng)效果進(jìn)行考察，取1 μL該溶液點于銀膠紙上，點樣區(qū)立即進(jìn)行SERS檢測。選用1 170 cm-1處的特征峰強(qiáng)度作為標(biāo)準(zhǔn)比較增強(qiáng)效果，3次檢測的平均強(qiáng)度與存放時間(d)的關(guān)系如圖3所示：隨著儲存時間的延長，銀膠紙的增強(qiáng)效果有所降低，但一周內(nèi)基本保持穩(wěn)定。

4.4染色關(guān)黃柏的鑒別首先，采用表面增強(qiáng)拉曼

圖3　經(jīng)不同儲存時間后銀膠紙的增強(qiáng)效果變化 (從左至右依次為：1、3、5、7和10 d)

光譜法鑒別市售關(guān)黃柏藥材，滴加乙醇-水的混合溶液25 μL潤濕藥材表面數(shù)秒，取銀膠紙擦拭后進(jìn)行SERS檢測。0.1 mg·mL-1的金胺O的標(biāo)準(zhǔn)SERS圖及市售關(guān)黃柏的擦拭檢測結(jié)果見圖4(A)，用OPUS軟件進(jìn)行特征峰的標(biāo)示后發(fā)現(xiàn)金胺O在415、456、505、562、734、776、1 160、1 480、1 548及1 594 cm-1等多處存在特征峰；市售關(guān)黃柏藥材的擦拭檢測光譜(紅)與空白銀膠紙的光譜(藍(lán))相比，在729 cm-1處存在特征峰，初步判定為關(guān)黃柏藥材浸出物的特征峰。

隨后，檢測1、0.1和0.01 mg·mL-1的金胺O染料染色的關(guān)黃柏藥材。操作步驟同上所述，檢測圖譜見圖4(B)。如圖所示：染色樣品的檢測圖譜除729 cm-1處出現(xiàn)關(guān)黃柏基質(zhì)峰外，在415、505、562、734、776、1 160 cm-1等處還存在金胺O的特征峰。因此，采用此法可快速判別關(guān)黃柏藥材是否被金胺O非法染色。另外，經(jīng)0.01 mg·mL-1染料溶液染色前后關(guān)黃柏?zé)o明顯顏色變化，但仍可檢測出金胺O，因此此法可滿足真實鑒別的需求。

圖4　 (A)0.1 mg·mL -1金胺O的標(biāo)準(zhǔn)圖、市售關(guān)黃柏藥材的擦拭檢測結(jié)果以及銀膠紙的空白光譜; (B)經(jīng)不同濃度的金胺O(1、0.1、0.01 mg·mL -1)染色關(guān)黃柏的鑒別結(jié)果

5結(jié)論

采用表面增強(qiáng)拉曼光譜法成功鑒別了金胺O非法染色的關(guān)黃柏藥材；本文先后對硝酸銀的濃度、銀膠紙的增強(qiáng)效果以及穩(wěn)定性等因素進(jìn)行考察和優(yōu)化，成功檢測經(jīng)0.01 mg·mL-1金胺O染料染色的關(guān)黃柏，已可以滿足真實鑒別的需求。隨著研究的不斷深入，表明增強(qiáng)拉曼光譜法的應(yīng)用將有利于進(jìn)一步加大對中藥材、中藥飲片市場的監(jiān)管，保障消費者的用藥安全。

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