異丙酚對CO 2氣腹后大鼠肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

異丙酚對CO2氣腹后大鼠肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

鄒海波，張巍麗，施鵬，孫曉峰

(沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院，沈陽110024)

摘要：目的觀察異丙酚對CO2氣腹后大鼠肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。方法選擇雄性大鼠48只，隨機(jī)分為A、B、C、D組，每組12只。A、B、C組經(jīng)尾靜脈泵注生理鹽水、D組經(jīng)尾靜脈泵注異丙酚。A組不做其他處理，B組經(jīng)CO2氣腹建立大鼠肺缺血模型，C、D組經(jīng)CO2氣腹建立大鼠肺血再灌注模型。各組造模后處死大鼠，取肺組織檢測丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)，計(jì)算肺濕干質(zhì)量比(W/D)，采用免疫組化法、Real-time PCR法、Western blotting法分別檢測肺組織中HO-1陽性細(xì)胞數(shù)、蛋白表達(dá)及mRNA水平。結(jié)果B、C組SOD、MDA、W/D與A組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，D組SOD、MDA、W/D與A組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。D組肺組織中HO-1蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)、蛋白相對表達(dá)量、mRNA相對表達(dá)量高于其他三組(P均<0.01)。結(jié)論 異丙酚在CO2氣腹后大鼠肺臟血再灌注損傷中具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與HO-1表達(dá)增加有關(guān)。

關(guān)鍵詞：肺缺血；再灌注損傷；異丙酚；二氧化碳?xì)飧?；大?/p>

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.41.010

中圖分類號：R563

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)41-0028-03

收稿日期：(2015-07-14)

腹腔鏡在臨床外科的應(yīng)用越來越廣泛，但CO2氣腹帶來的諸多不良反應(yīng)也引起了關(guān)注。異丙酚作為一種臨床麻醉常用藥，具有抗氧化應(yīng)激作用，其對肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制目前還存在爭議[1]。2014年4月~2015年5月本實(shí)驗(yàn)以大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，觀察異丙酚在CO2氣腹后大鼠肺缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1動物分組及模型制備成年Wistar雄性大鼠48只,體質(zhì)量280~320 g。將其隨機(jī)分成A、B、C、D組4組，每組12只。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h，自由飲水。參照Pringle法造模的麻醉劑量，10%水合氯醛(3 mL/kg)經(jīng)大鼠腹腔麻醉。皮膚消毒后，腹部插入氣腹針(壓力20 mmHg)，剖開頸動脈，插管檢測平均動脈壓(MAP)。A組不做其他處理，僅尾靜脈泵注生理鹽水1 h(10 mL/kg)；B組在A組基礎(chǔ)上給予氣腹(壓力20 mmHg)1 h；C組在A組基礎(chǔ)上，氣腹1 h后放開0.5 h；D組在C組基礎(chǔ)上，用異丙酚代替生理鹽水，經(jīng)尾靜脈泵注異丙酚1.5 h[10 mg/(kg·h)](異丙酚原液用生理鹽水10倍稀釋)，氣腹(壓力20 mmHg)1 h后放開0.5 h。各組于造模后即刻處死大鼠。

1.2肺組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測大鼠處死后取肺組織10 mg，置于液氮中冷凍。用硫代巴比妥酸比色法測定肺組織中MDA，黃嘌呤氧化酶法測定肺組織中SOD，均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3肺濕干質(zhì)量比(W/D)計(jì)算模型制備成功后處死大鼠，取右上肺葉稱濕質(zhì)量，置于80 ℃烘箱中烘烤48 h至恒重，取出后稱干質(zhì)量，計(jì)算肺W/D。

1.4肺組織中HO-1表達(dá)檢測

1.4.1HO-1蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞檢測采用免疫組化法。處死大鼠后取右肺組織置于10%甲醛中固定，石蠟包埋，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。光鏡下觀察，陽性細(xì)胞的細(xì)胞核染色為棕色，計(jì)數(shù)3個視野陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.4.2HO-1蛋白半定量檢測采用Western blotting法。取各組右肺組織10 mg，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。以β-actin為內(nèi)參，顯影后曝光沖片，膠片經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)掃描、成像后測定單位吸光度，并將各組吸光度值分別與β-actin密度值相比得出HO-1蛋白相對表達(dá)量。

1.4.3HO-1 mRNA檢測采用Real-time PCR法。取各組凍存肺組織50 mg，以TRIzol法勻漿后提取漿液中總RNA，應(yīng)用紫外分光光度法測定其表達(dá)水平。取1 μg總RNA，嚴(yán)格按照Prime Script RT Master Mix試劑盒說明書的要求逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并置于-30 ℃保存，以目的基因與內(nèi)參基因的差值作為目的基因的相對表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組肺組織SOD、MDA及W/D比較見表1。

表1　各組肺組織SOD、MDA及W/D比較( ± s)

表1　各組肺組織SOD、MDA及W/D比較( ± s)

組別nSOD(U/mg)MDA(nmol/mg)W/DA組12625.41±85.314.02±0.753.75±0.38B組12383.75±35.15*△3.15±0.73*△4.84±0.45*△C組12303.51±70.23*5.91±0.52*5.85±0.89*D組12474.57±101.283.65±1.434.11±0.61

注：與A組、D組比較，*P<0.05；與C組比較，△P<0.05。

2.2各組肺組織中HO-1蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)經(jīng)免疫組化法檢測A、B、C、D組肺組織中HO-1蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)分別為(5±1)、(11±2)、(17±1)、(25±2)個。與A組比較，B、C組陽性細(xì)胞數(shù)增多(P均<0．05)；與B、C組比較，D組陽性細(xì)胞數(shù)增多 (P均<0.01)。

2.3各組肺組織中HO-1蛋白相對表達(dá)量A、B、C、D組HO-1蛋白相對表達(dá)水平分別為0.02±0.003、0.31±0.07、0.49±0.06、0.62±0.03；與A組比較，B、C組HO-1蛋白表達(dá)水平升高，且C組高于B組(P均<0.05);與B、C組比較，D組HO-1蛋白表達(dá)水平升高(P均<0.05)。

2.4各組肺組織中HO-1 mRNA水平A、B、C、D組肺組織中HO-1 mRNA的相對表達(dá)量分別為0.23±0.09、0.58±0.13、0.71±0.16、0.93±0.15；與A組比較，B、C組中HO-1 mRNA表達(dá)水平升高(P均<0．05)；與B、C組比較，D組HO-1 mRNA表達(dá)水平升高(P均<0.01)。

3討論

腹腔鏡CO2氣腹后所產(chǎn)生的機(jī)體各個器官缺血再灌注損傷是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[2]。液體復(fù)蘇可導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征,其中肺最易受累[3]。嚴(yán)重的肺缺血再灌注損傷是遠(yuǎn)期急慢性炎癥反應(yīng)的危險(xiǎn)因素[4]，其特征性病理變化為：凋亡細(xì)胞以肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞為主[5]，肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損后，肺泡-毛細(xì)血管屏障功能障礙，使炎癥細(xì)胞和炎性介質(zhì)滲出，肺泡及肺泡間質(zhì)水腫，組織細(xì)胞死亡[6、7]。肺缺血再灌注損傷是由缺血的直接損傷及鈣離子超載、中性粒細(xì)胞活化[8]引發(fā)“呼吸爆發(fā)”，產(chǎn)生大量自由基和促炎癥細(xì)胞因子、內(nèi)皮細(xì)胞等多種因素介導(dǎo)的多臟器功能受損的復(fù)雜病理生理過程[9]。Kupffer細(xì)胞激活產(chǎn)生大量氧自由基(OFR)和炎癥介質(zhì)被公認(rèn)為是缺血再灌注損傷早期最主要的致傷原因[10]。生理狀態(tài)下，體內(nèi)OFR的生成與清除處于動態(tài)平衡，但在某些病理狀態(tài)下，如肺臟再灌注損傷時通過吞噬細(xì)胞系統(tǒng)、線粒體呼吸鏈、兒茶酚胺的自身氧化等途徑產(chǎn)生大量OFR，OFR是缺血器官再灌注后致組織損傷最早、最重要的有害物質(zhì)之一[11]。特別是肺缺血再灌注致大量OFR生成，可激活轉(zhuǎn)錄因子蛋白(NF-κB)，使炎癥因子釋放增多[12]。

MDA是OFR與細(xì)胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)(LP)過程中毒性最大的過氧化產(chǎn)物(LPO)。由于LPO具有活性高、氧化性能強(qiáng)和極不穩(wěn)定的特點(diǎn)，直接測定器官中的含量比較困難。MDA是自由基攻擊生物膜引發(fā)的脂質(zhì)LPO，其水平可反映脂質(zhì)過氧化程度，間接地反映出細(xì)胞受自由基攻擊和損傷的程度[13]。SOD是體內(nèi)最主要的自由基清除劑，可清除OFR。在缺血再灌注過程中過氧化-抗氧化狀態(tài)失衡時，LP呈病理性增強(qiáng)，抗氧化防御體系被嚴(yán)重破壞，自由基可以與細(xì)胞膜磷脂、蛋白質(zhì)、核酸等反應(yīng)，并進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞的代謝功能發(fā)生障礙。當(dāng)體內(nèi)OFR生成增多時，SOD與超氧陰離子反應(yīng)生成過氧化氫，再由過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶轉(zhuǎn)變?yōu)樗?，從而清除自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。MDA和SOD的變化表明缺血和再灌注是兩個不同的階段，CO2氣腹造成的缺血過程中對肺臟造成了損傷，當(dāng)氣腹壓力解除后這種損傷不但沒有停止反而繼續(xù)加重，即再灌注損傷。在本次實(shí)驗(yàn)中，高氣腹壓力壓迫大鼠肺門部血管造成肺組織缺血性損傷，此時大鼠肺組織內(nèi)的MDA含量升高，SOD含量降低。當(dāng)放開氣腹后，肺組織經(jīng)歷了再灌注過程，但此時損傷不但未減輕反而由于再灌注繼續(xù)加重，MDA顯著升高，SOD顯著降低，但是應(yīng)用異丙酚后，MDA含量明顯下降，SOD含量明顯升高。可見，高氣腹壓對大鼠肺組織造成了缺血再灌注損傷，異丙酚對其具有保護(hù)性作用。

HO-1又稱熱休克蛋白32，是一種限速酶，正常生理情況下存在于多個臟器與組織中，表達(dá)較少。但在應(yīng)激情況下HO-1的表達(dá)便會反應(yīng)性的增強(qiáng)，以減少應(yīng)激狀態(tài)帶來的損傷。HO-1可催化血紅素生成一氧化碳、鐵離子和膽綠素，在抗氧化應(yīng)激、抗炎、抑制細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用；有研究結(jié)果表明，HO-1的保護(hù)作用還可能與減輕脂質(zhì)LP、降低半胱氨酸蛋白酶活性以對抗細(xì)胞凋亡和腫瘤壞死因子水平有關(guān)。本研究結(jié)果證明，HO-1在A組、B組、C組、D組中的表達(dá)逐漸升高，特別是D組升高最為明顯，也充分證明異丙酚在肺臟缺血再灌注損傷過程中，可通過誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)而發(fā)揮對肺臟的保護(hù)作用。

丙泊酚用于止血帶所致缺血再灌注損傷時，能減少OFR生成，減輕脂質(zhì)過氧化。異丙酚的保護(hù)性作用的機(jī)制表現(xiàn)為：清除OFR，降低OFR水平，減輕脂質(zhì)LP，增強(qiáng)體內(nèi)SOD、谷胱甘肽過氧化物酶活性，減弱中性粒細(xì)胞“呼吸爆發(fā)”，穩(wěn)定細(xì)胞膜。異丙酚可直接與自由基反應(yīng)，生成2,6-二異丙基苯氧基團(tuán)，使自由基滅活，清除體內(nèi)OFR，使脂質(zhì)LP減弱；增加NO的含量，改善微循環(huán)障礙。此外，異丙酚良好的脂溶性亦使其更容易積聚在細(xì)胞的脂質(zhì)雙分子層上，從而提高細(xì)胞抗氧化損傷的能力。很多實(shí)驗(yàn)也表明，異丙酚具有增強(qiáng)SOD活性的作用，異丙酚不但減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生而且還能保持自由基清除劑的活性。本研究結(jié)果顯示，異丙酚可增加HO-1的蛋白表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，降低OFR水平，糾正缺血再灌注損傷中過氧化-抗氧化失衡狀態(tài)。另外，有研究表明，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增高和線粒體鈣超載能夠通過激活鈣調(diào)節(jié)蛋白依賴性激酶-13和卡配因而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[14]；缺血再灌注損傷發(fā)生后，MDA、LPO和NF-κB水平明顯升高，可作為肺損傷炎癥反應(yīng)和肺損傷程度的指標(biāo)[15]；異丙酚阻斷細(xì)胞內(nèi)鈣超載，增加抗炎性細(xì)胞因子，減少促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減少多巴胺積聚等也可能參與了異丙酚對肺的保護(hù)作用。因而，異丙酚可以通過增加HO-1蛋白的表達(dá)減輕大鼠的肺缺血再灌注的損傷。

參考文獻(xiàn)：

[1] 蘇麗東，莫日根，豐波.丙泊酚對大鼠缺血再灌注致肝損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2014，33(3)：129.

[2] 凌云志，禹莉，梁啟勝，等.七氟醚對兔肝臟缺血再灌注損傷的影響[J].蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，37(8)：884-887.

[3] 楊木強(qiáng)，耿智隆，陸化梅，等.RI聯(lián)合PTX對重度失血性休克大鼠肺缺血再灌注損傷的影響[J].山東醫(yī)藥，2011，51(3)：18-20.

[4] 王家順，張俊，王建軍，等.TOLL樣受體2在大鼠肺移植缺血再灌注損傷期的時序性表達(dá)及意義[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，40(2):27-29.

[5] 倪世榮，徐正玠，王鑫.三七總皂苷減低兔肺缺血再灌注損傷和一直細(xì)胞凋亡[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2012，32(2)：170-174.

[6] 劉備 唐冬梅 杜寧，等.七氟烷預(yù)處理聯(lián)合后處理對肺缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制[J].山東醫(yī)藥，2015，55(17)：17-19.

[7] 段明科，王維武，蘭峻斌，等.缺血后處理減輕肺缺血再灌注損傷的效果及機(jī)制探討[J].山東醫(yī)藥，2013，53(14):15-17.

[8] 伍火志，袁江，王理想，等.后處理對缺血再灌注損傷大鼠肺Egr-1和IL-β表達(dá)的影響[J].中國病理生理雜志，2011，27(1)：33-36.

[9] 張殷，高偉忠，但伶.丙泊酚對大鼠肝缺血再灌注致急性肺損傷時Nrf2和HO-1表達(dá)的影響[J].中國老年學(xué)雜志，2013，33(13)：3126-3128.

[10] 蔡俊贏，徐國海.乙酰半胱氨酸對兔肝缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制探討[J].免疫學(xué)雜志，2013，29(1)：85-87.

[11] 譚金峰 ，王現(xiàn)雷，金哲浩，等.肝缺血再灌注損傷機(jī)制與防治的最新認(rèn)識[J].疑難病雜志，2013，12(12)：979-981.

[12] 盧建，喜楊濤.亞甲藍(lán)預(yù)處理對大鼠肝缺血再灌注肺損傷的保護(hù)作用[J].浙江創(chuàng)傷外科，2012，17(2)：169-171.

[13] 魯建軍，翁慧雯，馬俊，等.缺血后處理對供體犬肺組織凋亡基因表達(dá)的影響[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)，2013，34(1)：53-58.

[14] 張俊，王家順，鄭志坤，等.細(xì)胞自噬水平在大鼠缺血/再灌注肺組織內(nèi)變化及其作用[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，33(9)：1146-1149.

[15] 龔文輝，張成鑫，華天風(fēng)，等.Leptin減輕大鼠肺缺血再灌注損傷及其保護(hù)作用機(jī)制[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，49(5)：603-605.