小立碗蘚PpAGO7基因啟動(dòng)子分離及其啟動(dòng)活性分析

*通信作者:王愛民,理學(xué)碩士,副教授,主要從事植物生理與分子生物學(xué)教學(xué)與研究。E-mail:aiminwang@jsnu.edu.cn

小立碗蘚PpAGO7基因啟動(dòng)子分離及其啟動(dòng)活性分析

高運(yùn)通,潘沈元,王愛民*

(江蘇師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,江蘇徐州 221116)

摘要:AGO7蛋白在多種植物中被發(fā)現(xiàn)并預(yù)測在葉片生長發(fā)育過程中起作用,但是在高等植物中最古老且唯一沒有維管束的苔蘚植物中卻未有報(bào)道。該文通過BLAST比對(duì)水稻OsAGO7基因編碼的氨基酸序列得到小立碗蘚AGO7蛋白編碼基因PpAGO7,擴(kuò)增PpAGO7基因起始密碼子上游的啟動(dòng)子序列,利用在線軟件PlantCARE和PLACE分析該啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)特征;并構(gòu)建啟動(dòng)子分析載體pPpAGO7-GUS,轉(zhuǎn)化擬南芥,通過轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS染色結(jié)果分析推測PpAGO7啟動(dòng)子的啟動(dòng)特性。結(jié)果顯示:(1)PpAGO7基因啟動(dòng)子序列中含有大量的光反應(yīng)有關(guān)的順式作用元件以及數(shù)個(gè)分生組織相關(guān)和防御與脅迫相關(guān)作用元件。(2)T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS染色結(jié)果表明,PpAGO7基因啟動(dòng)子會(huì)啟動(dòng)GUS在擬南芥的不同部位和不同生長時(shí)期表達(dá),而且在根尖、葉片頂端、雄蕊的花藥、雌蕊的柱頭和種子等部位的染色較其他部位更深。(3)生長在光照強(qiáng)度1 000 lx和4 000 lx下轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS酶活性比光照強(qiáng)度7 000 lx和10 000 lx下的低。研究表明所克隆的PpAGO7基因啟動(dòng)子具有組成性啟動(dòng)活性,且在生長旺盛的部位啟動(dòng)活性較強(qiáng),此外其啟動(dòng)活性還受到光照因素的影響,為進(jìn)一步研究小立碗蘚的PpAGO7基因功能提供了重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞:小立碗蘚;PpAGO7;啟動(dòng)子

收稿日期:2014-09-17;修改稿收到日期:2014-12-17

基金項(xiàng)目:科技部轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)子課題(2014ZX08012-002)

作者簡介:高運(yùn)通(1989-),男,在讀碩士研究生,主要從事植物分子遺傳學(xué)研究。E-mail:545080590@qq.com

中圖分類號(hào):Q785;Q789 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

基金項(xiàng)目《西北植物學(xué)報(bào)》2014年刊載論文統(tǒng)計(jì)

基金項(xiàng)目1．國家級(jí)基金：318項(xiàng),占總數(shù)的41.7%。其中：國家自然科學(xué)基金167項(xiàng),國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃即國家“973”基金16項(xiàng),國家“863”計(jì)劃基金14項(xiàng),國家“948”基金5項(xiàng),國家博士點(diǎn)基金(含博士后基金6項(xiàng))22項(xiàng),國家其它項(xiàng)目基金93項(xiàng)。

基金項(xiàng)目2．中國科學(xué)院基金：19項(xiàng),占總數(shù)的2.5%。其中：知識(shí)創(chuàng)新工程基金2項(xiàng),西部之光基金7項(xiàng),其它基金10項(xiàng)。

基金項(xiàng)目3．各部委基金：82項(xiàng),占總數(shù)的10.7%。其中：科技部基金7項(xiàng),教育部基金12項(xiàng),農(nóng)業(yè)部基金28項(xiàng),國家林業(yè)局基金14項(xiàng),其它部委基金21項(xiàng)。

基金項(xiàng)目4．中外合作基金：3項(xiàng),占總數(shù)的0.4%

基金項(xiàng)目5．大學(xué)基金：62項(xiàng),占總數(shù)的8.1%

基金項(xiàng)目6．省(市)各類研究基金：273項(xiàng),占總數(shù)的35.8%

Separation and Functional Analysis of the Promoter of

PpAGO7 Gene fromPhyscomitrellapatens

GAO Yuntong,PAN Shenyuan,WANG Aimin*

(School of Life Science,Jiangsu Normal University,Xuzhou,Jiangsu 221116,China)

Abstract:The AGO7 was found in many plants and was predicted to play a role in the processduring growth anddevelopment of leaves in higher plants.However,it was not reported in bryophytes which was one of the oldest and the only one which had no vascular bundle in higher plants.By comparison to the amino acid sequence of OsAGO7 in rice with BLAST tool,we obtained the AGO7 protein code gene in Physcomitrella patens named PpAGO7.We also cloned the promoter sequence of PpAGO7 and analyzed its sequence characters by using online software Plant CARE and PLACE.Then the promoter analysis vector pPpAGO7-GUS was built and transferred into Arabidopsis todetect the initiation activity.The result indicated that:(1)The promoter sequence contained large amount of cis-acting elements related to the photo reaction and a plurality of elements related to the meristem anddefense and oppression related elements.(2)According to the staining result of the T2 transgenic plants,GUS staining was found indifferent tissues andduringdifferent growth periods.Moreover,the staining color was muchdeeper in the root,leaf tip,anther of stamen,stigma of pistil and seeds than in other tissues.(3)The GUS enzymatic activity of the transgenic Arabidopsis under the light intensity condition 1 000 lx or 4 000 lx was lower than that under the light intensity condition 7 000 lx or 10 000 lx.All results indicted that the cloned PpAGO7 promoter had constitutively promoting activity and was influenced by light intensity.

Key words:Physcomitrellapatens;PpAGO7;promoter

AGO蛋白(argonaute proteins)是RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)的核心成分,它在幾乎所有已知的RNA沉默通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用,包括維持基因組的穩(wěn)定、調(diào)控組織發(fā)育[1]、對(duì)逆境的適應(yīng)性應(yīng)答以及在RNA層面對(duì)入侵核酸(轉(zhuǎn)基因和植物病毒)的免疫等[2]。

前人對(duì)植物AGO蛋白功能的研究在擬南芥中最為全面和透徹,在擬南芥的10個(gè)AGO蛋白中全部具有切割活性所必需的催化三聯(lián)體DDH或DDD,但目前被證實(shí)有切割活性的只有AtAGO1、AtAGO4和AtAGO7[3-4]。AGO7最早是在早熟的擬南芥突變體中與ta-siRNA一同被鑒定出來的,Adenot等[5]發(fā)現(xiàn)TAS3 ta-siRNA的產(chǎn)生依賴于AGO7蛋白的作用,并且生成的ta-siRNA能繼續(xù)與AtAGO7結(jié)合形成沉默復(fù)合體調(diào)節(jié)下游的靶mRNA[5-6]。這是目前為止第一個(gè)也是唯一一個(gè)被證實(shí)的AtAGO7參與的siRNA通路。迄今為止,AGO7蛋白的功能在水稻、擬南芥等高等開花植物中的研究已經(jīng)較為全面,但是在高等植物中最古老且是唯一一類沒有維管束的陸生植物苔蘚中尚未有報(bào)道。

苔蘚植物是最古老的陸生植物之一,廣泛分布于世界各地,雖然屬于高等植物,有莖葉的分化但是莖中無導(dǎo)管,葉中無葉脈,沒有輸導(dǎo)組織,根的結(jié)構(gòu)也非常簡單稱為“假根”[7]。進(jìn)化學(xué)上認(rèn)為苔蘚植物和維管植物是起源系統(tǒng)上的一個(gè)姐妹進(jìn)化支。從苔蘚植物在進(jìn)化樹上的相對(duì)位置說明它是研究陸生植物進(jìn)化的理想材料[8]。小立碗蘚(Physcomitrellapatens)屬于葫蘆蘚科小立碗蘚屬,是目前為止發(fā)現(xiàn)的同源重組率最高的植物,是研究功能基因特性的理想材料[9]。而且在前人對(duì)小立碗蘚的研究中沒有任何有關(guān)AGO7蛋白的生物學(xué)功能的報(bào)道。本研究通過比對(duì)擬南芥、水稻和玉米中AGO7基因的保守序列,獲得小立碗蘚的AGO7蛋白編碼基因PpAGO7,進(jìn)而克隆PpAGO7基因起始密碼子上游堿基序列,分析其序列結(jié)構(gòu)并構(gòu)建以PpAGO7基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)的啟動(dòng)子分析質(zhì)粒pPpAGO7-GUS。農(nóng)桿菌介導(dǎo)浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥,通過GUS染色和GUS活性測定以了解PpAGO7基因啟動(dòng)子在擬南芥中的表達(dá)特性,為研究小立碗蘚中PpAGO7基因的生物學(xué)功能提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

小立碗蘚(Physcomitrellapatens)及擬南芥(Arabidopsisthaliana)哥倫比亞型由本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)。大腸桿菌(Escherichiacoli)菌種DH5α、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌種EHA105、啟動(dòng)子分析載體p1300GN均由江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院保存。T4dNA ligase及Taq酶購自TaKaRa公司;限制性內(nèi)切酶購自Thermo Scientific公司;DNA片段快速膠回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司。引物合成和測序工作均由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

1.2　 PpAGO7啟動(dòng)子的克隆及啟動(dòng)子分析質(zhì)粒的構(gòu)建

以小立碗蘚成熟莖葉體為材料,用SDS法提取基因組總DNA[10]。以水稻的OsAGO7蛋白的氨基酸序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ABO93307.1)為模板對(duì)小立碗蘚的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastp(http://www.cosmoss.org/bm/BLAST?type=1)比對(duì),得到與OsAGO7同源性較高的蛋白序列,并獲得其對(duì)應(yīng)的DNA堿基序列。利用Primer5軟件設(shè)計(jì)正向引物APGF(5′-cttAAGCTTGCTTTTTAACTTCTACATC-3′,下劃線為HindⅢ酶切位點(diǎn))和反向引物APGR(5′-aaaG-GATCCGCGGCATGATGACAAAACA-3′,下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn)),擴(kuò)增PpAGO7基因起始密碼子上游長1 773 bp的序列。擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s,54 ℃退火45 s,72 ℃延伸2 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。電泳回收目的基因片段測序。

將擴(kuò)增獲得的啟動(dòng)子片段用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切后插入到無啟動(dòng)子的含有卡那霉素抗性基因的載體p1300GN中BamHⅠ和HindⅢ之間,后接GUS基因的編碼區(qū)序列、潮霉素抗性基因HYG和NOS終止子,構(gòu)建成啟動(dòng)子分析質(zhì)粒pPpAGO7-GUS(圖1)。酶切鑒定和測序表明構(gòu)建正確。

圖1　質(zhì)粒載體pPpAGO7-GUS示意圖

1.3　 PpAGO7基因啟動(dòng)子序列分析

利用在線啟動(dòng)子分析軟件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)對(duì)克隆的PpAGO7基因啟動(dòng)子潛在的功能進(jìn)行預(yù)測。

1.4　擬南芥轉(zhuǎn)化

將啟動(dòng)子分析質(zhì)粒pPpAGO7-GUS通過凍融法導(dǎo)入到農(nóng)桿菌EHA105中[11],之后取適量農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子接種至含有50 mg/L卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中,28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜,OD600在1.2～1.6之間時(shí)室溫離心,將農(nóng)桿菌沉淀重新懸浮于適當(dāng)體積的滲透培養(yǎng)基中使OD600在0.8左右,浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥[12]。

1.5　轉(zhuǎn)基因擬南芥篩選和GUS組織化學(xué)染色分析

收集擬南芥種子,消毒后置于含有35 mg/L潮霉素的1/2 MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)10d,將生長正常的幼苗(轉(zhuǎn)化株)移至土壤中培養(yǎng)。待擬南芥成熟后,分別提取總DNA并以PAGF和PAGR為引物PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)其是否已插入質(zhì)粒載體。分單株收取轉(zhuǎn)基因擬南芥種子并用上述相同的方法培養(yǎng)得到T1代轉(zhuǎn)化株。分別選取不同時(shí)期及不同組織的T1代擬南芥轉(zhuǎn)化株按Jefferson的方法進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色[13]。

1.6　轉(zhuǎn)基因擬南芥不同光照強(qiáng)度處理及GUS活性測定

將培養(yǎng)箱(光照強(qiáng)度7 000 lx、12 h光照8 h黑暗、21 ℃)中培養(yǎng)15d的T2代擬南芥轉(zhuǎn)化株轉(zhuǎn)到光照強(qiáng)度分別為1 000、4 000、7 000和10 000 lx,其他環(huán)境條件不變的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d,非轉(zhuǎn)基因擬南芥置于4 000 lx光強(qiáng)的培養(yǎng)箱中作為參照。3d后測定GUS活力,隨機(jī)選取4個(gè)處理組轉(zhuǎn)基因擬南芥及非轉(zhuǎn)基因植株在液氮中研磨,用磷酸緩沖液法提取總蛋白并測定樣品蛋白質(zhì)含量[14]。然后參照Richard等[15]的方法檢測各樣品中GUS的活力。酶活力單位定義為每分鐘PNPG生成1 nmol對(duì)硝基苯酚的酶量為一個(gè)單位,GUS活力(U)以每分鐘每毫克蛋白的酶活力表示(nmol·mg-1·min-1)[16]。每個(gè)處理組設(shè)置3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1　 PpAGO7序列的確定及啟動(dòng)子片段的克隆

通過Blastp比對(duì)得到的小立碗蘚氨基酸序列含有2個(gè)高度保守的PAZ和PIWI結(jié)構(gòu)域,具有典型的AGO類蛋白的結(jié)構(gòu)特征。為研究PpAGO7基因啟動(dòng)子活性,采用PCR擴(kuò)增從預(yù)測的PpAGO7基因啟始密碼子起上游1 773 bp的DNA片段(圖2,A)。之后將擴(kuò)增的片段與T載體連接然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR和BamHⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定(圖2,B)并將陽性克隆測序,測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(http://www.cosmoss.org)序列一致。

2.2　 PpAGO7基因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)特征

用PlantCARE數(shù)據(jù)庫分析我們所得到的PpAGO7啟動(dòng)子序列,結(jié)果(圖3)表明,PpAGO7基因起始密碼子ATG上游1 773 bp啟動(dòng)子序列中含有啟動(dòng)子區(qū)域特征元件TATA-box 11個(gè),CAAT-box 9個(gè)。進(jìn)一步結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),PpAGO7啟動(dòng)子序列中含有高水平轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子5′-UTR嘧啶密集區(qū)(5′-UTR Py-rich stretch);與光反應(yīng)有關(guān)的BOX-Ⅰ、CG-motif、CGT-motif、G-box、G-Box、GT1-motif、GTGGC-motif及與病原體、真菌誘導(dǎo)子侵入有關(guān)的Box-W1、MBS、W box等順式作用元件;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了數(shù)個(gè)響應(yīng)低氧環(huán)境的作用元件ARE、響應(yīng)低溫脫水的作用元件C-repeat/DRE、與分生組織有關(guān)的作用元件CAT-box、與防御和物理脅迫有關(guān)的元件TC-rich repeats以及響應(yīng)低溫環(huán)境的元件LTR等多個(gè)順式作用元件。

2.3　啟動(dòng)子分析質(zhì)粒pPpAGO7-GUS的構(gòu)建與轉(zhuǎn)基因植株的獲得

按照上述方法將構(gòu)建的啟動(dòng)子分析質(zhì)粒pPpAGO7-GUS通過浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。分單株收獲種子并萌發(fā)于含有潮霉素的選擇培養(yǎng)基上,篩選出長勢良好的幼苗移至土壤中繼續(xù)生長。隨機(jī)選取5株轉(zhuǎn)基因擬南芥植物提取總DNA,以APGF和APGR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,均獲得約2 kb條帶(圖4)。表明獲得的植株即為插入了質(zhì)粒載體pPpAGO7-GUS的轉(zhuǎn)化株。

圖2　小立碗蘚 PpAGO7啟動(dòng)子的擴(kuò)增(A)與啟動(dòng)子分析質(zhì)粒pPpAGO7-GUS的酶切鑒定(B)

圖3　小立碗蘚 PpAGO7基因啟動(dòng)子序列特征分析

2.4　 PpAGO7啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性分析

為了檢測所擴(kuò)增的序列是否具有啟動(dòng)活性,分別選取生長10、20、45和55d等4個(gè)時(shí)期的轉(zhuǎn)基因擬南芥的根、莖、葉、花和果實(shí),進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色(圖5)。由圖可見,擬南芥轉(zhuǎn)化株在這4個(gè)時(shí)期都有顯色,而且在各自時(shí)期的根、葉、莖、花和種子部位也都有不同程度的著色(圖5,A～I(xiàn))。并且在根尖、葉片頂端、雄蕊的花藥、雌蕊的柱頭和種子這些部位的染色相對(duì)于其他部位更深(圖5,D、J、K和L)。由此可以推測該啟動(dòng)子可能在個(gè)體生長發(fā)育的整個(gè)時(shí)期都有啟動(dòng)活性。

圖4　轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR檢測結(jié)果

2.5　 PpAGO7啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性與光照強(qiáng)度關(guān)系

由于PpAGO7啟動(dòng)子的序列分析中發(fā)現(xiàn)有很多光敏感的作用元件,為此分析了不同光照強(qiáng)度下該啟動(dòng)子活性。結(jié)果(圖6)顯示,在光照強(qiáng)度7 000 lx和10 000 lx條件下,轉(zhuǎn)基因擬南芥中GUS活性無顯著差異,都在30 nmol·mg-1·min-1左右。而在光照強(qiáng)度1 000 lx和4 000 lx條件下,轉(zhuǎn)基因擬南芥中的GUS活性則要顯著低于10 000 lx條件(P<0.01)。與光照強(qiáng)度1 000 lx相比,光照強(qiáng)度4 000、7 000和10 000 lx下生長的轉(zhuǎn)基因擬南芥中的GUS活性分別是其2.35倍、3.72倍和3.76倍。在非轉(zhuǎn)基因擬南芥中,GUS活性幾乎為零。

圖5　T 2代轉(zhuǎn)基因擬南芥各個(gè)時(shí)期不同部位GUS組織化學(xué)染色

圖6　轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS活性與光照強(qiáng)度關(guān)系柱狀圖

3討論

AGO蛋白是一個(gè)高度保守且龐大的家族,作為沉默復(fù)合體的核心成分,在RNA沉默中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[17]。AGO7蛋白是植物體內(nèi)特有的一種小RNA即反式作用小RNA(ta-siRNA)生物合成途徑中必需的。擬南芥AtAGO7基因敲除突變體表現(xiàn)為早熟,繼而導(dǎo)致葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)的缺陷[18]。水稻中OsAGO7基因的超表達(dá)會(huì)引起葉片內(nèi)卷[19]。在玉米中ZmAGO7基因下調(diào)突變株中,葉片維管束生成異常,從而影響了葉片的形態(tài)[20]。番茄中SLAGO7在營養(yǎng)組織葉中微弱表達(dá),而在生殖器官花中強(qiáng)烈表達(dá),表達(dá)量從花蕾到盛開的花呈遞增趨勢,但在果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期中表達(dá)都非常微弱甚至不表

達(dá)[21]。由此推測AGO7蛋白介導(dǎo)的ta-siRNA途徑可能在植物葉片和花器官的形態(tài)結(jié)構(gòu)和發(fā)育過程起到一定作用。本實(shí)驗(yàn)從小立碗蘚中分離出PpAGO7基因起始密碼子上游1 773 bp的啟動(dòng)子片段,并以此構(gòu)建啟動(dòng)子分析載體,在轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS染色結(jié)果中,根尖、葉頂端和花的花藥與柱頭都有較深的著色,而這些一般都是生長分化較快的部位,說明此段啟動(dòng)子區(qū)域的啟動(dòng)活性具有組織特異性,并且也預(yù)示著PpAGO7基因可能在小立碗蘚的組織生長發(fā)育、葉片極性生長和花的發(fā)育的過程中起到一定的的調(diào)控作用。

Qu等[22]發(fā)現(xiàn),擬南芥AtAGO7和AtAGO1共同參與由siRNA介導(dǎo)的對(duì)蕪菁皺縮病毒(TCV)的免疫反應(yīng),其中AtAGO1占主導(dǎo)作用而AtAGO7起輔助作用。在PpAGO7基因啟動(dòng)子序列中也發(fā)現(xiàn)了與病原體、真菌誘導(dǎo)子侵入有關(guān)的順式作用元件Box-W1、W box和MBS,其中MBS是MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn),MYB轉(zhuǎn)錄因子家族參與植物苯丙烷類次生代謝途徑的調(diào)節(jié),而苯丙烷類次生代謝途徑在植物抗病害作用中發(fā)揮著重要作用[23]。這似乎預(yù)示著PpAGO7基因可能在對(duì)抗入侵病原體和真菌誘導(dǎo)子的過程中發(fā)揮作用,但還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。另外,由于在PpAGO7啟動(dòng)子序列中有大量的光響應(yīng)有關(guān)作用元件,為了探究此片段啟動(dòng)活性是否與光照因素有關(guān),本實(shí)驗(yàn)又設(shè)置了4組不同的光照強(qiáng)度培養(yǎng)T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥,并分別測定GUS酶活性。結(jié)果也證明了光照強(qiáng)度的高低確實(shí)會(huì)影響PpAGO7基因啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性。這些結(jié)果都為進(jìn)一步探究小立碗蘚中AGO7蛋白的生物學(xué)功能提供了重要的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn):

[1]HUTVAGNER G,SIMARD M J.Argonaute proteins:key players in RNA silencing[J].Nat.Rev.Mol.CellBiol.,2008,9(1):22-32.

[2]VAUCHERET H.Post transcriptional small RNA pathways in plants:mechanisms and regulations[J].GenesDev.,2006,20(7):759-771.

[3]TOLIA N H,JOSHUA-TOR L.Slicer and the argonautes[J].Nat.Chem.Biol.,2007,3(1):36-43.

[4]VAUCHERET H.Plant ARGONAUTES[J].TrendsPlantSci.,2008,13(7):350-358.

[5]ADENOT X,ELMAYAN T,LAURESSERGUESd,etal.DRB4-dependent TAS3 trans-acting siRNAs control leaf morphology through AGO7[ J].Curr.Biol.,2006,16(9):927-932.

[6]HUNTER C,WILLMANN M R,WU G.Trans-acting siRNAmediatedrepression of ETTIN and ARF4 regulates heteroblasty inArabidopsis[J].Development,2006,133(15):2 973-2 981.

[7]周云龍.植物生物學(xué)(第2版)[M].北京:高等教育出版社,2004:331-345.

[8]KENRICK P,CRANE P.The origin and early evolution of plant on land[J].Nature,1997,389(6 646):33-39.

[9]SCHAEFERd G,ZRYD J P.Efficient gene targeting in the mossPhyscomitrellapatens[J].PlantJ.,1997,11(6):1 195-1 206.

[10]WANG Xd(王曉丹),Lü H Y(呂慧穎),ZHANG J(張敬).Comparative study on methods of extractingdNA from soybean leaf for PCR[J].MolecularPlantBreeding(分子植物育種),2004,2(6):81-894(in Chinese).

[11]YU Y ZH(余云舟),DU J(杜娟),WANG G(王罡).Studies on the freeze-thaw method of transforming recombinant plasmiddNA intoAgrobacteriumtumefaciens[J].JournalofJilinAgriculturalUniversity(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)),2003,25(3):257-259,262(in Chinese).

[12]CLOUGH S J,BENT A F.Floraldip:a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation ofArabidopsisthaliana[J].PlantJ.,1998,16(6):735-743.

[13]JEFFERSON R A.Assaying chimeric genes in plants:theGUSgene fusion system[J].PlantMol.Biol.Rep.,1987,5(4):387-405.

[14]BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].AnalyticalBiochemistry,1976,72(1):248-254.

[15]RICHARD A J.Assaying ghimeric genes in plants:theGUSgene fusion system[J].PlantMolecularBiology,1987,37(6):387-405.

[16]XU L ZH(許蘭珍),PENG A H(彭愛紅),HE Y R(何永睿).Expression analysis of three phloem-specific promoters in transgenicPoncirustrifoliata[J].ActaHorticulturaeSinica(園藝學(xué)報(bào)),2014,41(1):1-8(in Chinese).

[17]BAULCOMBEd.RNA silencing in plants[J].Nature,2004,431(7 006):356-363.

[18]ADENOT X,ELMAYAN T,LAURESSERGUESd.DRB4-dependent TAS3 trans-acting siRNAs control leaf morphology through AGO7[J].Curr.Biol.,2006,16(9):927-932.

[19]SHI Z Y,WANG J,WAN X S.Over-expression of riceOsAGO7 gene induces upward curling of the leaf blade that enhanced erect-leaf habit[J].Planta,2007,226(1):99-108.

[20]ZHANG X L,DOUGLAS R N,STRABLE J.PUNCTATE VASCULAR EXPRESSION1 (PVE1) is a novel maize gene required for leaf pattern formation that functionsdownstream of the ta-siARF pathway[J].PlantPhysiol.,2012,159(4):1 453-1 462.

[21]XIANG Y(向婭),XIAN ZH Q(先志強(qiáng)),LINd B(林冬波).Cloning and expression analysis of SlAGO7 in tomato[J].ChineseJournalofTropicalCrops(熱帶作物學(xué)報(bào)),2013,34(4):641-647(in Chinese).

[22]QU F,YE X,MORRIS T J.ArabidopsisdRB4,AGO1,AGO7,and RDR6 part icipat e in adCL4- initiated antiviral RNA silencing pathway negatively regulated bydCL1[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2008,105(38):14 732-14 737.

[23]ABE H,YAMAGUCHI-S K,URAO T.Role ofArabidopsisMYC and MYB homologs indrought- and abscisic acid-regulated gene expression[J].PlantCell,1997,9(10):1 859-1 868.

(編輯:宋亞珍)

《西北植物學(xué)報(bào)》2014年第1～12期共發(fā)表論文365篇(含英文論文7篇),論文共獲得763個(gè)各類研究基金項(xiàng)目的支持,平均每篇論文獲基金項(xiàng)目達(dá)2.09個(gè)。有357篇論文均獲得各類研究基金的支持,占刊載論文總數(shù)的97.8%。其中,106篇論文有1項(xiàng)基金支持,占論文總數(shù)的29.0%;132篇論文有2項(xiàng)基金支持,占論文總數(shù)的36.2%;119篇論文獲3項(xiàng)以上基金支持,占論文總數(shù)的32.6%?！段鞅敝参飳W(xué)報(bào)》2014年刊載論文的基金論文比為0.978。論文基金的具體來源統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下：

(南紅梅供稿)