HPLC-ESI-MS／MS快速測定澤蘭水提物中的7種成分

HPLC-ESI-MS/MS快速測定澤蘭水提物中的7種成分

強光輝，劉昆善，姚宏武，李 軍

(西安市自來水有限公司，西安710082)

摘要：目的建立澤蘭水提物中主要成分咖啡酸、迷迭香酸、熊果酸、蘆丁、木犀草素、齊墩果酸和槲皮素快速測定的超高效液相色譜-電噴霧-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜方法。方法超聲法制備澤蘭水提物，XBridge-C18(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)反相梯度洗脫法對樣品進(jìn)行分離；電噴霧電離源負(fù)離子模式多級反應(yīng)監(jiān)測掃描法對各成分進(jìn)行定量分析。結(jié)果方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.24%～2.8%范圍內(nèi)，回收率在93.3%～105.2%之間，檢測限為0.05～1.0 μg·L-1。結(jié)論該方法具有分析速度快，靈敏度高和特異性強的特點，可為中藥中目標(biāo)成分的含量測定提供方法學(xué)參考。

關(guān)鍵詞：澤蘭；高效液相色譜；質(zhì)譜；電噴霧電離

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.011

中圖分類號：R282文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：(2015-03-20)

Simultaneous determination of seven compounds inLycopuslucidusTurcz. aqueous extract by HPLC-ESI-MS/MS

QIANG Guanghui，LIU Kunshan，YAO Hongwu，LI Jun(Xi′an Municipal Water Limited Company，Xi′an 710082，China)

Abstract:ObjectiveTo develop a method for rapid and simultaneous determination of rosmarinci acid，caffeic acid，ursolic acid，cyanidenon，phytomelin，oleanolic acid and quercetin by ultra-performance liquid chromatography-electrospray-triple quadrupole mass spectrometer. MethodsUltrasonic method was used to prepare the aqueous extract of Lycopus lucidus Turcz.；an XBridge-C18reverse phase column was employed to separate the interest compounds through gradient elution；multi reaction monitoring method under electrospray ionization and negative ion mode was utilized to determine the seven compounds. ResultsThe relative standard deviations of the method were in the range of 0.24%-2.8%；the recoveries were ranged from 93.3%-105.2%；the limits of detection were 0.05-1.0 μg·L-1. ConclusionThe proposed method has the advantages of rapid speed of analysis，high sensitivity and specificity. It is possible to become an alternative for the determination of target compounds in traditional Chinese medicine.

Key words:LycopuslucidusTurcz.；ultra-performance liquid chromatography；mass spectrometry；electrospray ionization

澤蘭為唇形科植物毛業(yè)地瓜兒苗(LycopuslucidusTurcz.var.hirtus Regel)的干燥地上部分[1]，廣泛分布于東北、華北、華東、中南、西南、陜西和甘肅等地。該藥為中醫(yī)臨床廣泛應(yīng)用的中藥之一，具有活血化瘀、行水消腫、解毒消癰的功效，在月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉、痛經(jīng)、產(chǎn)后瘀血、腹痛和水腫等疾病的治療方面具有獨特的療效[2]。中華人民共和國藥典收載的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有薄層定性鑒別，尚無定量檢測方法和指標(biāo)[3]，已有報道也多將研究的重點主要集中在澤蘭藥理藥效學(xué)研究及其植物資源的可持續(xù)開發(fā)研究方面，而對其進(jìn)行質(zhì)量控制方面的研究較少。已有文獻(xiàn)采用高效液相色譜法通過特征圖譜和指紋圖譜法研究了澤蘭飲片與提取物的相關(guān)性，證明方法可用于澤蘭的質(zhì)量控制[4-5]。也有文獻(xiàn)采用高效液相色譜法進(jìn)行了澤蘭中熊果酸、齊墩果酸和迷迭香酸的含量測定方法研究[6-7]。上述研究為澤蘭及其復(fù)方質(zhì)量控制提供了參考，具有潛在的推廣前景。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法可將色譜的高分離能力與質(zhì)譜的高靈敏結(jié)構(gòu)鑒定能力結(jié)合為一體，在中藥有效成分含量測定和結(jié)構(gòu)鑒定方面具有獨特的優(yōu)勢[8-11]。本研究采用超高效液相色譜(UPLC)-電噴霧(ESI)-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法(MS/MS)對澤蘭水提物中迷迭香酸等7種成分進(jìn)行了測定，旨在建立澤蘭高靈敏和高特異的快速含量測定方法，為澤蘭質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供方法學(xué)參考。

1儀器與試藥

1.1儀器美國Waters公司ACQITY UPLC TM系統(tǒng)，包括：二極管陣列檢測器，二元高壓梯度泵，API 3200 OV，AP串聯(lián)三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀(美國AB公司)；超聲波儀(上海易凈超聲波儀器有限公司)。

1.2試藥澤蘭藥材購自陜西省中藥材公司，由西安市食品藥品檢驗所鑒定為LycopuslucidusTurcz.的干燥地上部分；迷迭香酸對照品(批號 100526)、咖啡酸對照品(批號 110885-00102)、熊果酸對照品(批號 110742-200517)、木犀草素對照品(批號 111520-200809)、蘆丁對照品(批號 080-9303)、齊墩果酸對照品(批號 110709-200505)和槲皮素對照品(批號 100081-200406),均購自中國藥品生物制品檢定所；色譜純甲醇(美國Fisher公司)；自制超純水；其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1樣品制備

2.1.1對照品溶液的制備分別準(zhǔn)確稱取迷迭香酸、咖啡酸、熊果酸、木犀草素、蘆丁、齊墩果酸和槲皮素對照品2.0，1.5，3.0，4.0，1.5，2.0和3.5 mg，置于5.0 mL量瓶中，用甲醇溶解加甲醇定容至刻度，制備質(zhì)量濃度分別為0.4，0.3，0.6，0.8，0.3，0.4和0.7 mg·mL-1的對照品儲備溶液，4.0 ℃冷藏備用。

2.1.2澤蘭供試品溶液的制備 取適量澤蘭藥材，50 ℃條件下干燥至恒質(zhì)量，粉碎后過40目篩。準(zhǔn)確稱取藥材粉末10.0 g，加水300 mL，超聲提取30 min(頻率為60 Hz)。濾過，重復(fù)提取2次，收集2次濾液，減壓蒸干，以水為溶劑定容于5.0 mL量瓶中，0.45 μm水系微孔濾膜濾過。

2.2分析條件

2.2.1色譜條件XBridge-C18(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)色譜柱；流動相A液為甲醇，B液為含5×10-3mol·L-1甲酸胺水溶液；0 min，25% A；7 min，80% A；7.01～9.0 min，25% A；流速為0.4 mL·min-1；檢測波長為280 nm；柱溫設(shè)定為40 ℃；進(jìn)樣體積為2.0 μL。

2.2.2質(zhì)譜條件電噴霧電離源負(fù)離子模式電離；噴霧電壓設(shè)定為-4 500 V；離子源溫度設(shè)定為550 ℃；離子源輔助氣壓力為1 369 kPa。

3結(jié)果與討論

3.1方法的優(yōu)化

3.1.1色譜條件的優(yōu)化色譜流動相組成是電噴霧源中待測樣品離子化效率高低的關(guān)鍵影響因素。本研究分別以乙腈或甲醇為流動相A；2.0，5.0和10.0 mmol·L-1甲酸胺水混合溶液作為流動相B。改變梯度洗脫條件，測試混合對照品溶液中各物質(zhì)的分離效果及離子化效率。結(jié)果表明：擬定梯度洗脫條件下，各待測指標(biāo)的分離度最好；甲酸胺濃度對待測指標(biāo)的分離度無顯著影響，但可影響其離子化效率。當(dāng)甲酸胺濃度為2.0 mmol·L-1時，混合對照樣品總離子流圖中各待測指標(biāo)離子強度明顯偏低，僅為105；當(dāng)甲酸胺濃度為5.0和10.0 mmol·L-1時，各對照品的離子化效率明顯增加，離子強度達(dá)107；但當(dāng)流動相中添加10.0 mmol·L-1甲酸胺時，基線噪音明顯增大，約為5.0 mmol·L-1甲酸的3倍。乙腈水體系與甲醇水體系相比，對色譜峰的分離度和離子化效率無顯著影響。從毒性和經(jīng)濟角度考慮，本研究選擇甲醇為A液，含5.0 mmol·L-1甲酸胺水溶液為B液；最佳梯度條件為0 min，25% A；7 min，80% A；7.01～9.0 min，25% A。

3.1.2MS/MS條件的優(yōu)化采用蠕動泵連續(xù)注射各對照樣品溶液的方法手動優(yōu)化多級反應(yīng)監(jiān)測掃描(MRM)定量模式的最佳條件。各對照品母離子的質(zhì)荷比通過Q1全掃描確定，子離子通過碎片離子掃描確定，通過強度最大的母離子和子離子確定選擇反應(yīng)離子對。用該離子對優(yōu)化碰撞入口電壓(CEP)、碰撞出口電壓(CXP)、解簇電壓(DP)、入口電壓(EP)和碰撞能量(CE)等參數(shù)，以選擇離子對的離子信號具有較高的穩(wěn)定性和靈敏度。選擇靈敏度最高的離子對進(jìn)行定量測定，得到最佳質(zhì)譜檢測條件，見表l。

表17種對照品電噴霧質(zhì)譜檢測最佳條件

Tab.1 The optimized parameters for the determination of the seven standards by electrospray tandem mass spectrometry

名稱母離子子離子DP/VEP/VCEP/VCE/VCXP/V迷迭香酸359.2197.1359.2160.9a-24-6-11-12-4咖啡酸179.2135.0a-20-4-13-14-3熊果酸455.7425.4a-25-2-16-20-8木犀草素285.2133.0a-25-2-12-10-4蘆丁609.5300.2a-36-6-25-25-3齊墩果酸455.8409.6a-32-2-17-18-4槲皮素 301.2283.1301.2273.2a-20-8-45-26-2

a：定量離子對

3.2工作曲線、檢測限和定量限分別取各對照品儲備溶液適量，混合均勻，加甲醇配制成質(zhì)量濃度依次為5，10，25，50，100，250，500，1 000，2 500，5 000和10 000 μg·L-1的混合對照品溶液。進(jìn)樣分析，測定各對照品提取離子峰的峰面積，并與質(zhì)量濃度(μg·L-1)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2。檢測限按信噪比等于3計算，定量限按信噪比等于10計算，見表2。由表2可知，迷迭香酸等對照品在5～10 000 μg·L-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，提取離子峰峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，檢測限為0.05～1.0 μg·L-1，定量限為0.2～3.0 μg·L-1。

表27種對照品線性關(guān)系、檢測限和定量限

Tab.2 Calibration curve，limits of detection and limits of quantificationfor the seven standards

成分回歸方程r線性范圍/μg·L-1檢測限/μg·L-1定量限/μg·L-1迷迭香酸Y=412X+93000.99655～50000.050.2咖啡酸Y=326X+124350.998410～25000.100.3熊果酸Y=335X+112700.99015～100000.200.5木犀草素Y=216X+86470.994610～100000.050.2蘆丁Y=552X+103260.99875～50000.401.2齊墩果酸Y=496X+76900.99515～25000.501.5槲皮素Y=208X+71490.99895～50001.003.0

3.3方法的精密度和回收率分別稱取24份澤蘭干燥粉末，6份不加對照品溶液，6份分別加入質(zhì)量濃度為10 μg·L-1的混合對照品溶液1.0 mL，6份分別加入100 μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，其余6份加入質(zhì)量濃度為2 500 μg·L-1的混合對照品溶液1.0 mL，按照藥材提取方法進(jìn)行提取，定容于100 mL量瓶中。擬定分析條件下進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個標(biāo)準(zhǔn)添加質(zhì)量濃度迷迭香酸等物質(zhì)的測定回收率在93.3%～104.7%，95.2%～101.4%，98.1%～104.6%，96.7%～102.5%，99.0%～104.8%，97.8%～105.2%和97.6%～101.7%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.24%～2.3%，0.36%～2.8%，0.68%～2.0%，1.0%～2.4%，0.35%～1.2%，0.82%～2.8%和0.74%～2.7%范圍內(nèi)，表明該方法回收率滿足藥材中指標(biāo)成分的含量測定要求，且精密度良好。

3.4含量測定按照2.1.2項下方法，分別制備6份澤蘭藥材溶液，精密吸取2.0 μL，擬定條件下進(jìn)樣分析。圖l澤蘭提取液中各待測指標(biāo)MRM模式的萃取離子對色譜圖。由圖1可見，7種待測指標(biāo)均有較高靈敏度，且可在5.0 min之內(nèi)完成分離和檢測。澤蘭藥材中迷迭香酸、咖啡酸、熊果酸、木犀草素、蘆丁、齊墩果酸和槲皮素的含量分別為1.27，0.25，0.36，0.12，0.26，1.42和0.42 mg·g-1。

圖1澤蘭藥材多級反應(yīng)模式的提取離子流圖

Fig.1 Extracted ion chromatograms ofLycopuslucidusTurcz. aqueous extract in multi reaction monitoring acquisition mode

m/z：(a)179.2>135.0；(b)359.2>160.9；(c)285.2>133.0；(d)455.7>425.4；(e)455.8>409.6；(f)609.5>300.2；(g)301.2>273.2

3小結(jié)

本文采用超聲萃取制備澤蘭總提物，超高效液相色譜進(jìn)行分離、離子阱多級反應(yīng)模式進(jìn)行檢測的方法，對澤蘭水提物中酚酸類和黃酮類化合物進(jìn)行了檢測分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與經(jīng)典的液相色譜法相比，該方法特異性強，其他共存物質(zhì)無干擾。此外，由于使用了選擇離子對檢測技術(shù)，該方法對含量較低的咖啡酸、木犀草素和蘆丁依然具有高靈敏度，且測試結(jié)果準(zhǔn)確。該方法操作簡單，分析時間短，有望為澤蘭質(zhì)量控制方法的建立提供方法學(xué)借鑒。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉君.澤蘭的化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，10(1)：23-24.

[2]周迎春，郭麗新，王世龍.澤蘭有效成分對急性血瘀大鼠凝血功能和體外血栓形成的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2013，41(1):22-24.

[3]國家藥典委員會.中國藥典2010年版[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[4]陳慕媛，黃月純，劉東輝，等.澤蘭飲片及不同部位HPLC指紋圖譜研究[J].中成藥，2010，32(12):2029-2032.

[5]黃月純，張子龍，魏剛，等.澤蘭及其精制提取物HPLC特征圖譜的相關(guān)性研究[J]. 藥物分析雜志， 2011，31(8):1506-1510.

[6]楊學(xué)猛，徐風(fēng)梅.HPLC法測定澤蘭中熊果酸、齊墩果酸的含量[J].中草藥，2003，34(10)：11，31.

[7]童欣，賀凡珍，彭維，等. HPLC 法同時測定澤蘭中咖啡酸和迷迭香酸的含量[J].中草藥，2012，35(2):246-247.

[8]馮建明，陳卓，梁建強，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定野生蘑菇中2類肽類毒素的含量[J].西北藥學(xué)雜志，2013，28(4):351-354.

[9]李倩，廖予菲，楊洋，等.HPLC-ESI-TOF-MS法優(yōu)選麻黃中麻黃堿的提取工藝 [J].西北藥學(xué)雜志，2013，28(1):4-7.

[10]孫連娜，陳萬生，陶朝陽，等.澤蘭化學(xué)成分的研究[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2004，25(9):1029-1030.

[11]孫連娜，陳萬生，陶朝陽，等.澤蘭化學(xué)成分的研究[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報，2004，20(3):172-173.