紅花中影響山柰素含量測定的化合物研究

紅花中影響山柰素含量測定的化合物研究

馬久太，盧新義，孫寶平，孫宇宏，單娜，謝偉

(陜西步長制藥有限公司，西安710077)

摘要：目的對紅花中影響山柰素含量測定的未知化合物(Imp)進(jìn)行分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定。方法采用溶劑法和柱層析法提取、分離得到未知化合物(Imp)，并通過理化性質(zhì)和光譜數(shù)據(jù)鑒定該化合物的分子結(jié)構(gòu)。結(jié)果從紅花乙醇提取、酸水解物中分離得到的未知化合物(Imp)，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定為6-甲氧基山柰酚。結(jié)論明確影響紅花中山柰素含量測定的化合物為6-甲氧基山柰酚。為紅花中山柰素的準(zhǔn)確測定提供了依據(jù)，且該化合物為紅花中首次發(fā)現(xiàn)。

關(guān)鍵詞：紅花；6-甲氧基山柰酚；化合物

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.006

中圖分類號：R284文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項目：國家十二五重大新藥創(chuàng)制(編號：2011ZX11201)；陜西省“13115”重大科技專項(編號：2010ZDKG-106)

收稿日期：(2015-03-05)

Study on the compound affecting the determination of kaempferol inCarthamustinctoriusL.

MA Jiutai，LU Xinyi，SUN Baoping，SUN Yuhong，SHAN Na，XIE Wei(Shaanxi Buchang Pharmaceutical Limited Company，Xi ′an 710077，China)

Abstract:ObjectiveTo study the unknown compound affecting the determination of kaempfero in Carthamus tinctorius L. by separation， purification and structure identification. MethodsBy solvent extraction and column chromatography，the unknown compound was isolated，and the molecular structure was identified by physical and chemical properties and spectral data. ResultsThe unknown compound from the ethanol extraction and acid hydrolysate separation was identified as 6-methoxy kaempferol.ConclusionThe unknown compound affecting the content determination of kaempferide was 6-methoxy kaempferol.

Key words:CarthamustinctoriusL.；6-methoxy kaempferol；compounds

紅花為菊科植物紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花，是傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，具有活血通經(jīng)、散瘀止痛的功效。紅花中主要成分為以山柰酚和槲皮素為母體的多種黃酮類化合物[1]。研究發(fā)現(xiàn)，按照《中國藥典》2010年版紅花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項下的含量測定方法[2]，在對新疆不同地區(qū)、多個批次的紅花藥材進(jìn)行山柰素含量測定時，有未知化合物包埋于山柰素的色譜峰中，無法分離，導(dǎo)致測量結(jié)果偏高。為準(zhǔn)確測定紅花中山柰素含量，保證方法的可靠性，我們對紅花中未知的目標(biāo)化合物進(jìn)行了分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定。

1儀器與試藥

1.1儀器Waters e2695-Xevo G2-S QTof 液質(zhì)聯(lián)用儀，MassLynx質(zhì)譜工作站，DMX500型核磁共振儀(德國Brucker)；Prominence 20AXR-IT-TOF液質(zhì)聯(lián)用儀，LC-MS solution工作站(日本島津)；Waters 2545制備液相色譜儀(美國Waters)；LC-20AD高效液相色譜儀，SPD-M20A DAD檢測器(日本島津)；SephadexLH-20(YMC)；DV215CD分析天平(美國)。

1.2試藥山柰素對照品 (批號110861-200808，供含量測定用，購于中國食品藥品檢定研究院)；紅花藥材產(chǎn)地為新疆吉木薩爾縣，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤高級實驗師鑒定為菊科植物紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花；柱層析硅膠(100～200目、200～300目，青島海洋化工集團(tuán)公司)；甲醇為色譜純；水為高純水；其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1藥典方法測定山柰素含量中存在干擾現(xiàn)象及對該化合物進(jìn)行初步確證我們對多批紅花藥材中山柰素含量測定時發(fā)現(xiàn)，某個化合物對測定結(jié)果存在干擾，使山柰素含量較實際值偏高，為準(zhǔn)確測定紅花中山柰素的含量，本文對此進(jìn)行了系列研究。

2.1.1通過DAD檢測器發(fā)現(xiàn)山柰素色譜峰存在不純物采用Ch.P.供試品制備方法及色譜條件，通過DAD檢測器對5批紅花藥材中山柰素進(jìn)行含量測定，特征色譜圖詳見圖1和圖2。

圖1山柰素對照品HPLC色譜圖及色譜峰純度圖

注：不純物：未檢測到;峰純度指數(shù)：0.999 909;單點閾值：0.997 953;最小峰純度指數(shù)：1 955

Fig.1 Kaempferol reference substance chromatogram & purity chromatogram

Note: impurity:not detected;the index of peak purity:0.999 909;single point threshold: 0.997 953;the minimum index of peak purity: 1 955

圖2紅花供試品溶液HPLC色譜圖及色譜峰純度圖

注：不純物：檢測于19.96 min;峰純度指數(shù)：0.996 566<0.999 0;單點閾值：0.997 874;最小峰純度指數(shù)：1 308

Fig.2CarthamustinctoriusL. sample solution chromatogram & purity chromatograms

Note: impurity: detected in 19.96 min;the index of peak purity: 0.996 566<0.999 0;the single point threshold: 0.997 874;the minimum index of peak purity:1 308

從圖2中可以看出，供試品色譜圖中山柰素色譜峰純度指數(shù)僅為0.996 566<0.999 0，不純物檢測于19.96 min，提示供試品中山柰素色譜峰中有其他化合物(Imp)存在，導(dǎo)致在該保留時間下色譜峰純度降低。

2.1.2運(yùn)用質(zhì)譜對存在化合物進(jìn)行確證通過HPLC-MS對2.1.1中樣品進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3。

圖3紅花藥材供試品TIC和tR=19.02 min提取的質(zhì)譜圖

Fig.3 The TIC plot ofCarthamustinctoriusL. sample solution & the extract mass chromatogram intR=19.02 min

從圖3可以看出，在保留時間19.02 min處的山柰素主峰TIC提取得到的質(zhì)譜圖中有2組分子離子峰，其中質(zhì)核比(m/z)為285.039 6是山柰素分子離子峰[M-H]-；m/z為315.050 7是Imp的分子離子峰[M-H]-。從結(jié)果可以看出，干擾山柰素含量測定的Imp為單一化合物，通過相對分子質(zhì)量差異可以初步推斷，可能為山柰素甲氧基化的衍生物。

2.2對干擾山柰素含量測定的化合物(Imp)的提取、分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1紅花中目標(biāo)化合物的提取紅花干燥藥材30 kg，以乙醇浸提2次，每次250 kg，過濾，濾液45 ℃減壓濃縮至浸膏，浸膏用60 ℃乙醇溶解，置于圓底燒瓶中，加入體積比為3∶1的鹽酸溶液(15→37)，置于電熱套中，加熱水解1 h，冷卻，水解液減壓濃縮至無醇味，加水?dāng)嚢?，用乙酸乙酯萃?次，合并萃取液，于65 ℃減壓濃縮至約為1 300 g，收率為4.3%。

2.2.2分離純化取浸膏700 g進(jìn)行硅膠柱分離，以石油醚-丙酮(100∶0～75∶25)溶劑系統(tǒng)洗脫，目標(biāo)化合物存在于石油醚-丙酮(75∶25)部分，得量約30 g，對該部分進(jìn)行硅膠柱分離，再以氯仿-甲醇(70∶1)進(jìn)行洗脫，收集65～85瓶洗脫液，合并，減壓干燥，得到黃色粉末4 g，用Sephadex LH-20及制備液相進(jìn)行純化，得到該未知化合物(Imp)約50 mg，浸膏中該未知的目標(biāo)化合物收率為0.007%。

2.2.3紅花中目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定所得化合物為黃色針狀結(jié)晶(丙酮)，鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陽性，mp 280.3 ℃。ESI-MSm/z：317 [M+H]+。1H-NMR ( DMSO-d6，500 MHz)δ: 6.55 ( 1H，s，H-8)，8.05 ( 2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，6.93 ( 2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，3.76 ( 3H，s，6-OCH3)。13C-NMR (DMSO-d6，500 MHz)δ：135.8 (C-2)，147.4 (C-3)，176.6 (C-4)，151.9 (C-5)，131.3(C-6)，157.7 (C-7)，94.2 (C-8)，151.9 (C-9)，103.8(C-10)，122.2(C-1′)，115.9 (C-2′，6′)，130.0 (C-3′，5′)，159.7(C-4′)，60.5 (6-OCH3)，以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道[3]一致，故鑒定目標(biāo)化合物為6-甲氧基山柰酚，該化合物為首次從紅花中分離得到，如圖4所示。

圖4目標(biāo)化合物6-甲氧基山柰酚可能裂解途徑及質(zhì)譜峰歸屬

Fig.4 The fragmentation pathway of target compound 6-methoxy kaempferol & the mass peaks assignment

3結(jié)論

本文對紅花進(jìn)行了醇提、水解及分離純化，得到未知化合物，并通過理化性質(zhì)及光譜數(shù)據(jù)對其結(jié)果進(jìn)行解析，并與參考文獻(xiàn)中數(shù)據(jù)比較，確定該化合物為6-甲氧基山柰酚。

4討論

紅花藥材醇提水解物用石油醚-丙酮(100∶0～75∶25)分離，6-甲氧基山柰酚主要存在于石油醚-丙酮(75∶25)部位，對該部位進(jìn)一步用石油醚-丙酮(10∶1，8∶1，6∶1，4∶1和2∶1)洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)洗脫效果不是很理想，目標(biāo)化合物和其他化合物未分開，因此更換洗脫溶劑為氯仿-甲醇，經(jīng)過對洗脫溶劑系統(tǒng)摸索，確定柱分離條件為氯仿-甲醇(70∶1)。由于6-甲氧基山柰酚和山柰素極性相近，用氯仿-甲醇(70∶1)洗脫，不需更換梯度，約15個柱體積，6-甲氧基山柰酚就能完全洗脫。在實驗中發(fā)現(xiàn)，用Sephadex LH-20對6-甲氧基山柰酚進(jìn)行純化，用氯仿-甲醇(1∶1)溶解上樣，洗脫，與甲醇相比，其純化效果更好。

本文對相關(guān)數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)進(jìn)行檢索[4-5]，均未發(fā)現(xiàn)紅花藥材中已分離純化得到6-甲氧基山柰酚，因此本次研究從紅花中分離得到的6-甲氧基山柰酚，是在紅花藥材中首次發(fā)現(xiàn)。

本文通過對文獻(xiàn)資料的檢索[6-10]，發(fā)現(xiàn)6-甲氧基山柰酚藥理作用和山柰素及黃酮類化合物基本一致，具有一定抗氧化、清除自由基的作用；具有預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)方面疾病的作用；也具有一定的致突變作用。由于該致突變作用是黃酮類化合物的共同特性，相比其他黃酮類化合物，6-甲氧基山柰酚中甲氧基空間結(jié)構(gòu)較大，故該結(jié)構(gòu)的致畸變作用較弱，故該化合物所導(dǎo)致的致突變作用在安全范圍之內(nèi)。

致謝：核磁共振由沈陽藥科大學(xué)分析測試中心測定，特對相關(guān)人員表示感謝。

參考文獻(xiàn)：

[1]徐如英，童樹洪.紅花的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國藥業(yè)，2010，19(20)：86-87.

[2]國家藥典委員會.中國藥典2010年版[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:1029-1031.

[3]張飛，覃江江，成向榮，等.湖北旋覆花化學(xué)成分的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012，24(5)：427-431，449.

[4]田蘭，吳桂榮，王巖，等.紅花黃色素研究進(jìn)展[J].西北藥學(xué)雜志，2007，22(4):218-220.

[5]陶春梅，于治國，袁璐，等.紅花藥材中紅花黃色素A的HPLC測定[J].西北藥學(xué)雜志，2006，21(6):254-255

[6]Zapata-Torres，Gerald. Effects of natural flavones and flavonols on the kinase activity of Cdk5[J]. J Nat Prod, 2004,67(3): 416-420.

[7]王若菁，楊濱.紅花的化學(xué)成分及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究進(jìn)展[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2007，13(5):65-69.

[8]姜建雙，夏鵬飛，馮子明，等.紅花化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志，2008，33(24):2911-2913.

[9]施峰，劉焱文.紅花的化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17(9):1666-1667.

[10]薩仁高娃，陳紅梅，泉山.蒙藥紅花化學(xué)成分及藥理活性研究概況[J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2009，24(3):333-335.