轉(zhuǎn)基因HBV小鼠急性肝損傷的生物學(xué)特性研究

轉(zhuǎn)基因HBV小鼠急性肝損傷的生物學(xué)特性研究

魏琴1,2， 姜濤2， 苗娜3， 張春2， 李志強2， 壽璽2， 馬嵋2， 丁劍冰1

(新疆醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室， 烏魯木齊830011；2第一附屬醫(yī)院新疆醫(yī)學(xué)模型動物研究重點實驗室；

3第一附屬醫(yī)院病理科， 烏魯木齊830054)

摘要:目的研究四氯化碳(CCL4)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因乙型肝炎病毒(HBV)小鼠急性肝損傷的生物學(xué)特性的改變。方法選取32只健康雄性C57BL/6小鼠作為空白對照組，實驗組：選用32只健康雄性C57BL/6小鼠作為CCL4干預(yù)組，32只健康雄性HBsAg表達陽性C57BL/6-HBV轉(zhuǎn)基因小鼠為HBV+CCL4干預(yù)組?？瞻讓φ战M按0.5 mL/kg腹腔注射橄欖油溶液，于0、24、48、72 h 4個時間點取標本。實驗組每組各留8只作為空白對照，均按0.5 mL/kg腹腔注射橄欖油溶液，0 h處死；其余24只各自隨機分組，一次性給予0.5 mL/kg腹腔注射10%CCL4橄欖油溶液，分別于24、48、72 h每組隨機挑選8只小鼠，采集標本，全血用于計數(shù)白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血小板(PLT)，取血清測定天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)。結(jié)果與空白對照組比較，CCL4干預(yù)組24 h AST、ALT明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；HBV+CCL4干預(yù)組與CCL4干預(yù)組相比，AST、ALT水平在損傷24 h達到峰值，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)； CCL4干預(yù)組和HBV+CCL4干預(yù)組24 h時WBC均呈現(xiàn)下降，且兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；HBV+CCL4干預(yù)組RBC在24、48、72 h均降低，與0 h比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；HBV+CCL4干預(yù)組PLT 在48、72 h均降低，與0 h比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠在CCL4誘導(dǎo)下24 h AST、ALT顯著升高，WBC、RBC、PLT均降低；ALP、TP、ALB無明顯差異，這些指標的改變符合急性肝損傷模型的標準。結(jié)論成功建立HBV轉(zhuǎn)基因小鼠急性肝損傷模型，為進一步研究急性肝損傷的發(fā)病機制及其他變化提供了可靠的實驗平臺。

關(guān)鍵詞：HBV轉(zhuǎn)基因小鼠； 四氯化碳； 急性肝損傷；

中圖分類號：R392文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.04.013

[收稿日期：2014-12-04]

Study on the biological characteristics of HBV transgenic mice with acute liver injury

WEI Qin1,2， JiANG Tao2， MIAO Na3， ZHANG Chun2， LI Zhiqiang2， SHOU Xi2，

MA Mei2， DING Jianbing1

(1DepartmentofImmunology，BasicMedicalCollege，XinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830011，China;2XinjiangKeyLaboratoryofMedicalAnimalModelResearch;

3DepartmentofPathology,TheFirstAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

Abstract:ObjectiveTo study the biological characteristics of acute liver injury in mice induced by transgenic hepatitis B virus (HBV) by carbon tetrachloride (CCL4). Methods32 male C57BL/6 mice were the control group; 32 male C57BL/6 mice were the CCL4 group; 32 male transgenic C57BL/6 mice with HBsAg positive expression were HBV+CCL4 group. The control group was injected intraperitoneally by 0.5 mL/kg olive oil and taken specimens at 0, 24, 48, 72 h. 8 mice in two model groups were taken as control and given 0.5 mL/kg intraperitoneal injection of olive oil solution, killed at 0 h. The other 24 mice were grouped randomly and given 0.5 mL/kg 10% CCL4 olive oil solution once to produce acute liver injury model, 8 mice among which were randomly selected for specimens at 24, 48, 72 h to detect whole blood leukocyte count (WBC), red blood cell (RBC), platelets (PLT), measured in serum aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (ALP), total protein (TP), albumin (ALB). ResultsCompared with the control group, AST and ALT in CCL4 group peaked at 24 h, with significant difference (P<0.01)； compared with the CCL4 group, AST and ALT in HBV+CCL4 group peaked at 24 h, with a significant difference (P<0.01)；WBC decreased in model groups, with a significant difference (P<0.05)；Compared with 0 h in HBV+CCL4 group; RB C in HBV+CCL4 group decreased at 24, 48, 72 h, with a significant difference (P<0.05)；Compared with 0 h in HBV+CCL4 group，PLT decreased at 48， 72 h, with a significant difference (P<0.05). At 24 h AST and ALT peaked; WBC, RBC, PLT decreased in HBV transgenic mice induced by CCL4; ALP, TP, ALB had no significant difference. All the changes were in accordance with the standard indicators of acute liver injury. Conclu-sion58The establishment of acute liver injury model in HBV transgenic mice was of feasibility and reliability for further research on pathogenesis of acute liver injury.

Key words: HBV transgenic mice; carbon tetrachloride; acute liver injury

乙型肝炎病毒(HBV)的持續(xù)存在一直嚴重影響著人類的肝臟功能，目前全球約有4億人是HBV攜帶者，全世界每年因HBV感染及其后遺癥而死亡的人數(shù)為100萬～200萬[1]。急性肝損傷又是各種嚴重肝病發(fā)生、發(fā)展的始動環(huán)節(jié)，如果不能得到及時有效的治療，很快就可轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿螕p傷，甚至是肝纖維化、肝硬化乃至肝癌。因此，肝損傷已經(jīng)成為嚴重危害人類健康的重大疾病之一。已有研究對轉(zhuǎn)基因HBV小鼠基礎(chǔ)的生理生化指標進行分析[2-4],采用四氯化碳(CCL4)制作急性肝損傷是經(jīng)典的肝損傷模型[5-6]，轉(zhuǎn)氨酶常作為衡量肝損傷的常用指標[7-9]。本研究選擇攜帶HBV病毒的轉(zhuǎn)基因小鼠作為工具鼠，利用CCL4誘導(dǎo)小鼠制作急性肝損傷模型，以觀察在不同時間肝臟損傷的生物學(xué)特性的改變。

1材料和方法

1.1動物及分組選取32只健康雄性C57BL/6小鼠作為空白對照組，32只健康雄性C57BL/6小鼠作為CCL4干預(yù)組(購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)；另購遺傳背景相同的SPF級乙肝表面抗原(HBsAg)陽性轉(zhuǎn)基因雄性小鼠32只作為HBV+CCL4干預(yù)組(購自上海南方模式生物公司)。均為6～8 周齡,動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。

1.2試劑及儀器HBsAg 檢測試劑盒(荷蘭 Akio nobel 公司),天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)血清及血常規(guī)檢測試劑(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，AST試劑盒(批號:140213008)，ALT試劑盒(批號:140113006)，ALP試劑盒(批號:140312006)，TP試劑盒(批號:140813009)，ALB試劑盒(批號:140913009),V-53LEO(Ⅰ)溶血劑(批號：2013041401),V-53LEO(Ⅱ)溶血劑(批號：20111011),V-53LH溶血劑(批號：2013070701),V-53清潔液(批號：20120428001),四氯化碳(天津永晟精細化工有限公司，批號20121025)，橄欖油(意大利AGIA，批號4406049)。生化儀(BS-120)、五分類血球儀(BC-5300Vet)購自深圳邁瑞有限公司，顯微鏡(LM3000)購自美國Leica公司。

1.3方法

1.3.1急性肝損傷模型的制作選取32只健康雄性C57BL/6小鼠作為空白對照組，實驗組：選用32只健康雄性C57BL/6小鼠作為CCL4干預(yù)組，32只雄性HBsAg表達陽性C57BL/6-HBV轉(zhuǎn)基因小鼠為HBV+CCL4干預(yù)組，制作急性肝損傷模型?？瞻讓φ战M按0.5 mL/kg腹腔注射橄欖油溶液，于0、24、48、72 h 4個時間點取標本。實驗組每組各留8只作為空白對照，均按0.5 mL/kg腹腔注射橄欖油溶液，0 h處死，其余24只各自隨機分組，一次性給予0.5 mL/kg腹腔注射 10%CCL4橄欖油溶液，分別于24、48、72 h每組隨機挑選8只小鼠，內(nèi)眥靜脈取血，3 000 r/min離心5 min，取血清測定AST、ALT、ALP、TP、ALB，全血用于測定血常規(guī)。

1.3.2血液學(xué)檢查全血用EDTA-2K抗凝,混勻后用全血細胞計數(shù)儀測定白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)及血小板(PLT)。采用生化分析儀測定血清中AST、ALT、ALP、TP、ALB。

2結(jié)果

2.1肝損傷不同時期血清生化水平的改變

2.1.1肝損傷不同時期AST、ALT的變化組間比較，在24 h時， CCL4干預(yù)組AST、ALT明顯高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在48、72 h時，HBV+CCL4干預(yù)組AST、ALT明顯高于 CCL4干預(yù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。組內(nèi)比較，空白對照組4個時間點的AST、ALT水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。 CCL4干預(yù)組CCL4誘導(dǎo)24 h 時AST、ALT水平迅速升高，與0、48、72 h比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。HBV+CCL4干預(yù)組24 h AST、ALT水平迅速升高并達峰值，48 h水平仍較高，與0、72 h比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

2.1.2肝損傷不同時期ALP、TP、ALB的變化3組動物ALP、TP、ALB在經(jīng)CCL4干預(yù)后無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2肝損傷不同時期血常規(guī)指標WBC、RBC、PLT的改變

2.2.1肝損傷不同時期WBC的變化組間比較，24 h時CCL4干預(yù)組WBC明顯低于空白對照組和HBV+CCL4干預(yù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。組內(nèi)比較，空白對照組內(nèi)各時間點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；24 h時CCL4干預(yù)組WBC明顯低于0、48、72 h時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

2.2.2肝損傷不同時期RBC的變化組內(nèi)比較，HBV+CCL4干預(yù)組24 h時RBC明顯低于0 h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)，RBC在不同時間點3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。

2.2.3肝損傷不同時期PLT的變化組間比較，24 h時HBV+CCL4干預(yù)組PLT明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 組內(nèi)比較，HBV+CCL4干預(yù)組，24 h PLT明顯高于48、72 h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1　3組動物AST、ALT、ALP的比較( ±s， U/L)

注：與空白對照組比較， *P<0.05； 與CCL 4干預(yù)組比較， △P<0.05； 與本組24 h比較， ★P<0.05。

注：與空白對照組比較，*P<0.05； 與CCL4干預(yù)組比較，△P<0.05； 與本組24 h比較，★P<0.05。

3討論

正常情況下，大多數(shù)免疫功能正常的成人急性感染 HBV后可通過適應(yīng)性免疫和固有免疫應(yīng)答的協(xié)調(diào)作用而得以清除，并獲得對 HBV再次感染的抵抗力，但約10%的成人HBV感染者或經(jīng)母嬰垂直傳播途徑感染的人群不能有效清除病毒，導(dǎo)致HBV持續(xù)感染，甚至最終發(fā)展成為肝硬化或肝癌[10]。CCL4是一種典型的肝臟毒性物質(zhì)，其誘導(dǎo)的肝損傷模型有典型的組織學(xué)、生物化學(xué)和分子學(xué)的改變[11]，CCL4致急性肝損傷模型是經(jīng)典模型之一。

諸興桂[12]研究顯示，轉(zhuǎn)氨酶是作為鑒定肝臟是否損傷的標志物，其為可溶性酶。當(dāng)肝細胞受到損傷時，這些酶就迅速釋放，隨之血清中轉(zhuǎn)氨酶水平升高[13]。本研究結(jié)果顯示，AST在干預(yù)24 h迅速達到峰值，且轉(zhuǎn)基因HBV小鼠組最高，提示24 h時CCL4已經(jīng)造成了肝臟功能障礙；而CCL4干預(yù)組在48 h就急劇下降，而轉(zhuǎn)基因HBV小鼠從48 h開始下降至72 h仍遠高出正常水平，可能提示與小鼠攜帶的HBsAg有關(guān)，可以推斷健康小鼠因為肝功能健全，肝臟的自我修復(fù)能力很強，在48 h AST水平就降到一個低值，而轉(zhuǎn)基因小鼠AST水平始終較高，提示肝損傷仍在進行中。ALT是反映肝損傷的很靈敏的指標。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)干預(yù)24 h健康C57BL/6小鼠與未干預(yù)組小鼠相比ALT顯著升高，提示24 h時CCL4已經(jīng)造成了肝臟損傷；在48 h，經(jīng)CCL4干預(yù)后的健康C57BL/6小鼠組ALT迅速下降，而轉(zhuǎn)基因小鼠組仍處于較高水平，而且急性肝炎時血清ALT高低與臨床病情輕重相平行，提示肝損傷在48 h較為嚴重。ALP、TP、ALB在CCL4干預(yù)后未見明顯改變，可能是由于在早期肝損傷時ALP及蛋白水平尚未發(fā)生變化。本研究顯示，轉(zhuǎn)基因HBV小鼠WBC在0 h高于空白對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，經(jīng)CCL4干預(yù)24 h 后3組動物WBC均降低，這完全符合動物的臨床表現(xiàn)，其中以CCL4干預(yù)組降幅最大，而轉(zhuǎn)基因HBV小鼠次之，這可能是由于轉(zhuǎn)基因HBV小鼠本身攜帶HBsAg以致其產(chǎn)生免疫耐受，反而對外來刺激反應(yīng)較緩慢。轉(zhuǎn)基因HBV小鼠經(jīng)CCL4干預(yù)后，24 h RBC開始降低并低于正常值下限，48 h升高，這與WBC的變化保持一致，符合動物的臨床表現(xiàn)。同樣轉(zhuǎn)基因HBV小鼠組經(jīng)CCL4干預(yù)后，24 h PLT急劇下降并低于正常值下限，這也是符合急性肝損傷的臨床血液學(xué)改變。

總之，本研究結(jié)果表明，在CCL4干預(yù)后HBV轉(zhuǎn)基因小鼠24 h即可成功復(fù)制急性肝損傷模型，但與健康C57BL/6小鼠在CCL4干預(yù)后相比較，48 h健康小鼠轉(zhuǎn)氨酶即可迅速降低，而HBV轉(zhuǎn)基因小鼠則變化不大，這可能與HBsAg攜帶有關(guān)，導(dǎo)致HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟自我修復(fù)能力較差。其具體機制需要進一步實驗從病理學(xué)、分子生物學(xué)及免疫學(xué)等方面展開進一步研究。

參考文獻：

[1]Jung MC, Pape GR. Immunology of hepatitis B infection [J]. The Lancet Infectious Diseases, 2002，2(1):43-50.

[2]康愛君，田楓，張闊，等.C57BL/6J-HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清生化指標與性別年齡之間的關(guān)系[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2008,18(1):34-36.

[3]鄭鳳嬌，劉光澤，龔燕紅，等.HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血液生理生化指標檢測分析[J]. 華南國防醫(yī)學(xué)雜志，2011,25(4):292-294.

[4]陳迪，田楓，康愛君，等.C57BL/6J-HBV轉(zhuǎn)基因小鼠隨增齡乙肝表面抗原表達及轉(zhuǎn)氨酶水平變化探討[J]. 四川動物，2011, 30( 2)：186-188.

[5]李紅，關(guān)鳳英，李蘭蘭，等.柳葉鬼針草總黃酮對四氯化碳所致小鼠急、慢性肝損傷的保護作用[J].吉林大學(xué)學(xué)報，2010，36(5):901-902.

[6]Zhang C, Wei Q, Wen H. Liver cancer-related gene CYP2E1 expression in HBV transgenic mice with acute liver injury [J].Tumor Biol, 2014，35(4):3671-7.

[7]林英，朱曦，么改琦，等.重組人生長激素對腸源性內(nèi)毒素血癥大鼠急性肝損傷的影響[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2011，36(2):295-297.

[8]Adetoro KO, Bolanle JD, Abdullahi SB, et al. In vivo antioxidant effect of aqueous root bark,stem bark and leaves extracts of Vitex doniana in CCL4induced liver damage[J].Asian Pac J Trop Biomed,2013,3(5)：395-400.

[9]劉長海，華春秀，歸改霞，等.和厚樸酚對小鼠四氯化碳肝損傷的保護作用[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2013，48(4)：470-473.

[10]Wang J, Cheng L, Wondimu Z,et al. Cutting Edge: CD28 engagement releases antigen-activated invariant NKT cells from the inhibitory effects of PD-1 [J]. J Immunol, 2009,182(11):6644-6647.

[11]Sebastiani G, Gkouvatsos K, Maffettone C, et al. Accelerated CCL4induced liver fibrosis in Hjv-/-mice, associated with an oxidative burst and precocious profibrogenic gene expression [J]. PloS One,2011, 6(9):e25138.

[12]諸興桂.乙肝病毒標志物和肝功能損傷的相關(guān)性研究[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2013，34(19):2623-2624.

[13]Domitrovic R,Jakovac H. Effects of standardized bilberry fruit extract (Mirtoselect)on resolution of CCL4induced liver fibrosis in mice[J]. Food Chem Toxicol,2011,49(4):848-854.

(本文編輯楊晨晨)